题目：Microfluidics-based engineered silver nanoparticles to control growth and biofilm formation in bacterial pathogens causing dental infection

原文链接:https://www.nature.com/srep

期刊：Scientific Reports

摘要

变形链球菌与粪肠球菌极易形成生物膜，是各人群龋齿、根管持续性感染的核心致病菌。本研究建立微流控辅助绿色合成工艺，制备蝶豆花源银纳米颗粒（CtAgNPs），并验证其对牙科致病菌的抗菌、抗生物膜作用。蝶豆花提取物内的多种生物活性物质，可在微流控反应体系中天然充当还原剂与稳定剂。通过系列表征明确 CtAgNPs 理化特性：紫外 - 可见光谱检测到 423 nm 特征表面等离子共振峰；场发射扫描电镜观察颗粒呈球形，平均粒径 151.6 nm；Zeta 电位为 - 26.1 mV，胶体稳定性优良；傅里叶变换红外光谱证实颗粒表面结合大量植物源活性官能团。斑马鱼胚胎毒性试验证明 CtAgNPs 具备良好生物相容性，无明显毒副作用。CtAgNPs 抗菌性能优异，最低抑菌浓度（MIC）区间为 3.125~6.25 μg/mL，对变形链球菌、粪肠球菌的生物膜抑制率均超 75%。作用机制研究显示，该纳米颗粒会诱发细菌氧化应激反应：脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量上升、过氧化氢酶（CAT）与超氧化物歧化酶（SOD）两类抗氧化酶活性降低，同时细菌胞内蛋白、多糖大量渗漏，说明纳米颗粒能够破坏细菌细胞膜结构。综上，微流控绿色合成的 CtAgNPs 可高效抑制牙科致病菌生长与生物膜形成，有望开发为绿色纳米制剂，用于防控与牙生物膜相关的各类口腔感染。

关键词微流控技术；蝶豆；粪肠球菌；变形链球菌；毒性；银纳米颗粒

引言

纳米技术可在纳米尺度（1–100 纳米）下对材料进行调控，纳米尺度材料会展现出独特的理化与生物特性，例如表面反应活性提升、机械强度增强、光学性能特殊等。上述特性使其在医学、环境科学、生物技术领域得到广泛应用，尤其在抗菌防治领域前景广阔。近年来，环境友好型纳米颗粒合成技术受到学界高度关注。传统化学、物理合成法普遍存在成本高昂、能耗大、原料具有毒性等缺陷。为解决上述问题，以植物提取物、细菌、真菌、藻类等生物原料为基础的绿色合成技术应运而生，成为安全、可持续且低成本的替代方案。

多种植物源银纳米颗粒已被证实具备丰富的生物医用价值，拥有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗生物膜等多重活性。尽管叶片、根茎、微生物、藻类等均可作为绿色合成纳米颗粒的生物原料，但本研究专门选用蝶豆花提取物作为制备原料，原因在于蝶豆花富含花青素、黄酮、酚酸类物质，这类物质是高效的还原剂与包覆稳定剂。这些植物活性成分不仅能够高效合成纳米颗粒，还可大幅提升产物的抗菌、抗氧化与抗炎能力。此外，相较于植物其他部位，蝶豆花的生化组分分布更均一，在微流控辅助合成过程中，能够制备出性质更稳定、均一性更好的纳米颗粒。基于上述特性，本研究提出假设：以蝶豆花提取物为原料、借助微流控技术制备的银纳米颗粒，具备更优异的结构稳定性与生物相容性，对变形链球菌、粪肠球菌两类牙科致病菌可发挥更强的抑菌与抗生物膜效果。

相较于传统批次合成工艺，微流控反应器具备多重优势：试剂消耗量更低、副产物生成更少，同时可实现快速成核与颗粒生长。采用蛇形几何结构的微流控反应器可在纳米级别精确控制流体混合、反应动力学和热条件，这有助于单分散纳米颗粒的可控且可重复制备。微流控中的蛇形通道设计通过产生二次迪恩涡旋增强对流混合，从而在无需外部能量输入的情况下，使停留时间分布更窄、颗粒尺寸控制更精准。此外，这类反应器可通过并行化实现放大，并配备集成在线监测系统以优化工艺。利用蛇形微流控技术绿色合成纳米颗粒，能以工程化的精准度将从花卉提取物中提取的生物活性化合物整合，使其具备更优的均匀性、稳定性和功能性能。

龋齿在社会经济差异更大的低收入人群中更为普遍。龋齿始于变形链球菌因碳水化合物产生的酸性增强，导致牙釉质和牙本质脱矿。粪肠球菌在持续性牙髓感染中起关键作用，且对常规消毒剂和抗生素具有高度耐药性。这些致病菌会产生胞外聚合物，形成复杂的生物膜，阻碍治疗剂的渗透。除口腔疾病外，变形链球菌和粪肠球菌还与亚急性细菌性心内膜炎以及心血管和代谢疾病相关的全身性炎症病症有关。龋齿的常规治疗方法，包括洁治、氯己定漱口和使用氟化物，虽能有效减少表面牙菌斑，但对深层生物膜效果不佳。全球范围内已探索出多种新策略，包括光动力疗法；然而，牙科感染在各人群中仍是严重的健康问题。在此背景下，银纳米颗粒凭借其强大的多靶点抗菌特性以及破坏顽固口腔生物膜的能力，正受到越来越多的关注。针对上述问题，本研究采用微流控技术，利用蝶豆花的花提取物合成银纳米颗粒，并评估其对牙科致病菌——变形链球菌和粪肠球菌的抗菌及抗生物膜效果。

结果

蝶豆花花水提物的植物化学特征

对蝶豆花瓣水提物进行植物化学分析后，发现其含有多种生物活性化合物，包括类固醇、萜类、酚类、单宁、黄酮类、生物碱、糖苷和花青素。表1展示了蝶豆花瓣水提物的气相色谱-质谱（GC-MS）分析结果，共鉴定出12种生物活性化合物，这些化合物是根据色谱图中的保留时间和峰强度确定的。(R)-2(苯甲酰氧基)丙醛的峰面积最大，达21.36%，保留时间为6.008分钟，表明其在提取物中占主导地位。其他植物化合物包括己烯酸（11.21%）、N,2-二甲基-N-亚硝基-1-丙胺（9.30%）和1-戊烯（7.91%）。这些植物化合物可能是蝶豆具有多种生物和药理活性的关键原因。

表1：蝶豆鲜花水提物的GC-MS分析

图1：蝶豆花卉提取物的气相色谱-质谱联用图谱

在 CtAgNPs 合成过程中观察到的视觉变化是重要的指示指标。观察到颜色从紫色转变为深紫色（图2a）。紫外-可见光谱研究证实了利用蝶豆花花提取物合成了银纳米颗粒（AgNPs），在400纳米处出现了吸收峰（图2b）。

图2：利用水相花提取物对蝶豆来源银纳米颗粒（CtAgNPs）进行表征：(a) 初始浑浊状态出现可见的颜色变化在微流控环境中，随着反应进行，紫色变为带有棕色沉淀物的透明鲜艳紫色；(b) 蝴蝶兰银纳米颗粒（CtAgNPs）与蝶豆花水花卉提取物的紫外-可见光谱；(c) 蝶豆花水花卉提取物的傅里叶变换红外光谱；(d) 蝴蝶兰银纳米颗粒（CtAgNPs）

蝶豆水提物的傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示出多个特征吸收峰，表明存在不同的官能团。在波数3285.14 cm⁻¹处的宽峰对应O–H伸缩振动，提示存在羟基。在特定位置的峰分别代表脂肪族化合物的C–H伸缩振动和C=O/酰胺I振动。另外几处峰则表明存在C–H弯曲振动、C–O伸缩振动以及可能的芳香族或卤素相关振动（图2c）。 合成的蝶豆银纳米颗粒（CtAgNPs）的FTIR光谱显示出独特的官能团，这些官能团可能参与了纳米颗粒的合成与稳定过程。在特定位置的峰对应C=O和C–O伸缩振动，表明存在来自蝶豆提取物的羰基和酯基。在特定波数附近的峰证实了C–Br、Ag–O和C–Cl振动的存在，表明银纳米颗粒成功合成且形成了金属-氧键。这些结果证实了CtAgNPs被有效包覆并具有良好的稳定性（图2d）。 CtAgNPs的高分辨率显微图像显示其为球形形貌，粒径范围在30.91 nm至45.00 nm之间，平均直径约为38 nm（图3a）。图3b展示了CtAgNPs的元素组成，在3 keV处出现强峰，证实了银的存在。能量色散X射线光谱（EDAX）分析显示，CtAgNPs中银的含量为63.41%，其次是氧（16.75%）、碳（15.16%）和氯（4.68%）（图3c）。 CtAgNPs的Zeta电位测定值为-26.1 mV，表明其因静电排斥作用具有良好的胶体稳定性（图4a）。其流体力学直径为157.1 nm，多分散指数（PDI）为30.7%（图4b），显示出中等的均一尺寸分布。扩散系数为特定数值，反映了CtAgNPs的迁移能力。71.4%的透光率体现了CtAgNPs的分散稳定性和光学特性。

图3：利用水相花提取物表征蝶豆来源的银纳米颗粒（CtAgNPs）：(a) 蝶豆银纳米颗粒的场发射扫描电子显微镜显微图；(b) 蝶豆银纳米颗粒的能量色散X射线分析；(c) 展示蝶豆银纳米颗粒元素组成的图表

图4：使用水性花提取物表征蝶豆来源的银纳米颗粒（CtAgNPs）：(a) CtAgNPs的动态光散射（DLS）分析，显示流体动力学直径；(b) CtAgNPs的Zeta电位分析，证实了纳米颗粒的稳定性。

CtAgNPs 对斑马鱼胚胎的毒性评估

在受精后24、48、72和96小时（hpf）对暴露于浓度为1至100微克/毫升的CtAgNPs的斑马鱼胚胎存活率进行了评估（图5a）。受精后48小时，斑马鱼胚胎的孵化率随CtAgNPs浓度的升高而降低，表现出剂量依赖性效应。3.125微克/毫升浓度组的孵化率为92%。孵化率逐步下降至6.25微克/毫升时的75%、12.5微克/毫升时的67%以及25微克/毫升时的60%。50微克/毫升（42%）和100微克/毫升（33%）浓度下也观察到孵化率降低，表明高浓度的CtAgNPs会抑制胚胎孵化（图5b）。斑马鱼胚胎毒性研究显示，随着CtAgNPs浓度升高，胚胎存活率呈剂量依赖性下降。受精后24至72小时，3.125微克/毫升浓度组的存活率为91.67%，6.25微克/毫升浓度组为83.33%，12.5至100微克/毫升浓度组均为75%。受精后96小时，存活率进一步降低，3.125微克/毫升浓度组为83.33%，6.25和12.5微克/毫升浓度组均为58.33%，25和50微克/毫升浓度组均为50%，100微克/毫升浓度组为41.67%（图5c）。低浓度（1至12.5微克/毫升）下，胚胎存活率较高，毒性作用微弱。高浓度（50至100微克/毫升）下，存活率出现小幅下降，且随暴露时间延长，存活率呈逐步降低趋势。 研究人员在受精后48小时观察了斑马鱼胚胎的心跳。在复式显微镜下可观察到心脏活动，表明胚胎生理发育正常。整个研究过程中未检测到心率或心律异常。经计算，CtAgNPs的半数致死浓度（LC₅₀）为35.637微克/毫升。在整个暴露周期内，未观察到可察觉的亚致死或致畸效应，包括胚胎凝固、体节形成缺失、尾部未分离以及心跳缺失等情况。

图5：蝶豆来源银纳米颗粒（CtAgNPs）在斑马鱼胚胎中的毒性评估：(a) CtAgNPs 对斑马鱼受精后数小时影响的显微图像；(b) CtAgNPs 处理的斑马鱼胚胎的孵化率；(c) CtAgNPs 处理的斑马鱼的存活率。误差棒表示平均值±标准差。*表示 t 检验（* P ≤0.05、** P ≤0.01、* * * P ≤0.001）。

研究蓝蝴蝶花衍生银纳米颗粒（CtAgNPs）对牙科病原菌的抗菌及生物膜抑制作用

研究评估了CtAgNPs对两种重要牙科病原菌——变形链球菌（S. mutans）和粪肠球菌（E. faecalis）的抗菌性能。CtAgNPs对变形链球菌和粪肠球菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为6.25微克/毫升和3.125微克/毫升；对变形链球菌和粪肠球菌的最低杀菌浓度（MBC）分别为12.5微克/毫升和6.25微克/毫升（见表2）。变形链球菌和粪肠球菌的耐受水平均为2。

表2. 牙科病原体中CtAgNPs的最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）及耐受水平

在12小时（图6a），与各自的对照组相比，CtAgNPs通过将变形链球菌和粪肠球菌的生长分别降至19.5%和23.13%，显著抑制了这两种细菌的生长。氨苄青霉素处理后，变形链球菌的生长率为70%，粪肠球菌的生长率为61.03%。这一结果清楚地表明，CtAgNPs在早期阶段的抗菌活性强于标准抗生素。在24小时（图6b），经CtAgNPs处理的细菌细胞中，细菌生长进一步受到抑制，变形链球菌的生长率降至13%，粪肠球菌降至16%。此时氨苄青霉素的抑制效果减弱，分别仅为63.33%和40.23%，这表明CtAgNPs的抗菌效力在一段时间内能够持续发挥作用。

银纳米颗粒对变形链球菌和粪肠球菌的生物膜形成具有显著作用（图6c）。本研究在48小时的生物膜形成周期内，将银纳米颗粒的作用与氨苄西林处理组及未处理对照组进行了对比。在变形链球菌和粪肠球菌中，生物膜形成率分别降至21.76%和15.2%。相比之下，氨苄西林处理组的生物膜形成率分别降至47.8%和41.87%。

图6：蝶豆来源银纳米颗粒（CtAgNPs）的抗菌功效：在(a)12小时、(b)24小时时，用CtAgNPs和氨苄青霉素处理的变形链球菌和粪肠球菌菌株的细菌生长速率测定；(c)48小时时，用CtAgNPs和氨苄青霉素处理的变形链球菌和粪肠球菌菌株的生物膜形成情况。误差棒表示平均值±标准差。*表示t检验（* P ≤0.05、** P ≤0.01、* * * P ≤0.001）

探究蝶豆来源银纳米颗粒（CtAgNPs）对口腔病原菌的作用机制

通过测定粪肠球菌和变形链球菌经 CtAgNPs 处理后泄漏的蛋白质和糖类含量，评估了 CtAgNPs 展现的抗菌活性模式。如图 7a 所示，与对照组和氨苄青霉素处理组相比，暴露于 CtAgNPs 的细菌细胞表现出更多的蛋白质泄漏。在粪肠球菌中，CtAgNPs 处理组的蛋白质泄漏量达到 45.4 微克/毫克，而对照组为 21 微克/毫克，氨苄青霉素处理组为 37 微克/毫克。变形链球菌中也出现了类似趋势，CtAgNPs 诱导的蛋白质泄漏量为 36 微克/毫克，高于氨苄青霉素处理组（31.5 微克/毫克）和对照组（8.5 微克/毫克）。

图7：通过生化分析评估的蝶豆来源银纳米颗粒（CtAgNPs）对口腔病原体的作用机制：(a) 蛋白质渗漏 (b) 糖类渗漏 (c) 丙二醛（MDA）活性测定 (d) 谷胱甘肽（GSH）测定活性 (e) 超氧化物歧化酶活性测定 (f) 过氧化氢酶活性测定。误差棒表示平均值±标准差。* 表示 t 检验（* P ≤0.05、** P ≤0.01、* * * P ≤0.001）与蛋白质渗漏类似，图7b显示壳核银纳米颗粒（CtAgNPs）使两种受试细菌的糖类渗漏量均增加。在粪肠球菌中，壳核银纳米颗粒处理组的糖类渗漏量为21微克/毫克，而氨苄青霉素组为14微克/毫克，对照组为7.6微克/毫克。变形链球菌也呈现出类似趋势，壳核银纳米颗粒处理组糖类渗漏量为24微克/毫克，氨苄青霉素组为15.4微克/毫克，对照组细胞为7.7微克/毫克。

为进一步探究，通过检测丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平来评估氧化应激反应。如图7c所示，经CtAgNPs处理的细胞MDA水平升高幅度更大。在粪肠球菌中，CtAgNPs处理组的MDA水平达到5.9微摩尔/毫升，而氨苄青霉素处理组为4.0微摩尔/毫升，对照组细胞仅为1.5微摩尔/毫升。变形链球菌中也观察到类似趋势，CtAgNPs使MDA水平升至5.3微摩尔/毫升，远高于氨苄青霉素处理组的3.0微摩尔/毫升和对照组的1.0微摩尔/毫升。 为进一步分析细菌的抗氧化防御系统，研究人员检测了GSH水平。如图7d所示，粪肠球菌经CtAgNPs处理后，GSH水平降至约44%，而氨苄青霉素处理组为62%。变形链球菌经CtAgNPs处理后，GSH水平降至48%，氨苄青霉素处理组则为78%。 研究还检测了CtAgNPs处理后两种重要抗氧化酶——超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。如图7e所示，粪肠球菌和变形链球菌经CtAgNPs处理后，SOD活性均显著下降。粪肠球菌中，氨苄青霉素处理使SOD活性降至66%，CtAgNPs处理则使其进一步降至22%；变形链球菌中，氨苄青霉素处理使SOD活性降至56.4%，CtAgNPs处理降至27%。 图7f显示，CAT活性也呈现相同趋势。粪肠球菌中，氨苄青霉素处理使CAT活性降至52.1%，CtAgNPs处理降至21%；变形链球菌中，氨苄青霉素处理组为42%，CtAgNPs处理组为20%。

讨论

蝶豆花水提物的植物化学特征显示其含有黄酮类、酚酸类、甾体类、三萜类和皂苷类成分。同样，对水提物进行的气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析证实了多种植物化合物的存在，表明其成分复杂，含有多种挥发性和半挥发性组分。这些化合物在辅助银纳米颗粒的成核与稳定过程中发挥关键作用，并能增强蝶豆花银纳米颗粒（CtAgNPs）的生物活性。这些植物化学物质的丰富性与多样性，使蝶豆花成为绿色合成银纳米颗粒的理想原料。纳米颗粒。富含植物化合物的蝶豆花花序提取物对变形链球菌和粪肠球菌具有协同抗菌作用。据报道，这些植物化学物质可通过多靶点机制破坏生物膜形成、细菌黏附以及代谢途径。

肉眼可见的颜色变化表明了蝶豆花卉提取物在还原银离子及稳定银纳米颗粒方面的有效性。这些研究结果与其他研究一致，包括马杜米塔等人2021年的研究，该研究成功从蝶豆蓝色花朵中合成了蝶豆银纳米颗粒（CtAgNPs）。兰贾尼等人（2021a）指出，表面等离子体共振（SPR）是金属纳米颗粒的特征之一，这是一种光学特性，其中传导电子会响应特定光频率发生集体振动。蝶豆银纳米颗粒在400纳米处的吸收峰与银纳米颗粒的表面等离子体共振峰相吻合。拉胡曼等人（2022）研究发现，醛类、萜类化合物、黄酮类、酰胺类、酮类和羧酸类物质可作为还原剂和封端剂发挥协同作用，同时促进纳米颗粒的稳定性。花卉提取物中的植物化合物可能通过在纳米颗粒合成过程中阻止聚集，促进了银离子（Ag⁺）向银原子（Ag⁰）的转化。

采用场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析了合成的CtAgNPs的表面形貌、粒径分布及结构特征。粒径分布范围相对较窄且颗粒呈均匀球形，这得益于蛇形微混合器实现的溶液精准混合。同样，Suha等人（2025）的研究表明，合成的CS-银纳米颗粒（CS-AgNPs）呈球形，粒径范围为10-50纳米。Muthukumar等人（2021）利用FESEM对采用印楝叶提取物合成的银纳米颗粒（AgNPs）进行表征，发现纳米颗粒分散性良好，平均粒径为20-40纳米。Bîrcă等人（2023）报道，通过改变硝酸银溶液和还原溶液的流速，在连续流微流控系统中合成了银纳米颗粒。该方法可精准调控反应条件，制得结晶度良好的金属银纳米颗粒，其微晶尺寸为31-54纳米。

能量色散X射线光谱（EDS）分析证实，银（Ag）为主要成分，质量百分比达63.41%，表明CtAgNPs合成成功。对应15.16%碳（C）、16.75%氧（O）和4.68%氯（Cl）的特征峰，说明植物化学成分参与了CtAgNPs的稳定化过程，且可能存在残留盐类。约3千电子伏特处的强银信号进一步验证了CtAgNPs中存在金属银。这些结果与Madhumitha等人2021年的研究一致，该研究表明CT-AgNPs具有较高的银含量，并在3千电子伏特处出现特征峰。CtAgNPs中银离子的存在是赋予其抗菌性能的重要因素。

傅里叶变换红外光谱法（FTIR）是一种实用的分析技术，可用于识别纳米颗粒合成与稳定过程中涉及的官能团和生物分子。蝶豆花卉水提物的FTIR结果显示，其富含植物化学物质，主要由不饱和及含氧官能团、类黄酮、花青素和糖苷构成，这些成分是其生物活性的驱动因素。O–H官能团的存在表明提取物中存在有助于抗氧化活性的酚类和类黄酮化合物。C–H伸缩振动峰表明提取物中存在脂肪链和脂质相关生物分子。C=O/酰胺峰可能源于可作为还原剂或稳定剂的蛋白质或共轭羰基化合物。C–O及低波数峰证实了醇类、多糖和芳香族植物化学物质的存在，进一步印证了该花卉水提物丰富的植物化学组成。

CtAgNPs的傅里叶变换红外光谱表明存在参与纳米颗粒合成与稳定的多种官能团。O-H伸缩振动表明存在酚类或醇类物质，其可作为还原剂。N-H伸缩振动表明存在与蛋白质相关的胺或酰胺，这些物质可作为天然封端剂，稳定纳米颗粒并防止其团聚。C-H伸缩振动证实存在脂肪族烃类，其可能对稳定起到作用。与(C equiv C)和(C=O)伸缩振动对应的峰表明存在炔烃、腈类以及含羰基的生物分子，这些物质可作为还原剂。(C=C)为封端剂。C=C和C-N伸缩振动表明存在芳香族化合物。此外，C-O伸缩振动表明存在醇类、酯类或羧酸类物质，其有助于纳米颗粒的稳定。Sharma等人（2021年）在对用印楝提取物合成的银纳米颗粒进行傅里叶变换红外光谱分析时，也报道了类似的官能团，这凸显了酚类化合物和蛋白质在纳米颗粒稳定中的作用。

在本研究中，CtAgNPs 的流体动力学直径为157.1纳米，这表明其在胶体溶液中具有均匀的尺寸分布。正如 Soundhararajan 等人（2020年）所报道的，带电粒子之间的斥力通过减少团聚、维持颗粒在悬浮液中的分散状态，对提高纳米颗粒的稳定性发挥着重要作用。动态光散射技术基于光的散射和布朗运动，验证了纳米颗粒的尺寸分布。Khan 等人（2025年）报道，以印度睡茄为介导合成的银纳米颗粒，其流体动力学直径约为26–27纳米，Zeta 电位为-21.4毫伏，这表明其具有中等程度的胶体稳定性。

ζ电位值±30毫伏被认为是稳定的纳米颗粒，因为其静电排斥力可防止聚集。在本研究中，CtAgNPs的ζ电位为-26.1毫伏，与该范围相近，表明其具有良好的胶体稳定性这与之前关于植物介导银纳米颗粒合成的研究报道一致。Patil 等人（2020 年）的研究表明，杜鹃提取物衍生的银纳米颗粒表现出负电泳迁移率，这凸显了表面电荷在纳米颗粒稳定性中的作用。本研究中观察到的低电导率证实了纳米颗粒的稳定分散，因为已知高离子强度会破坏纳米颗粒悬浮液的稳定性（Rajeshkumar 等人，2021 年）。本研究中测得的流体力学尺寸和适中的多分散性指数与以辣木和印楝为原料合成的银纳米颗粒相当，这类相似的尺寸分布和多分散性源于植物化学物质介导的合成过程。透光率也受纳米颗粒尺寸和浓度的影响，进而影响胶体体系的光散射特性。

本研究依据经济合作与发展组织（OECD）第236号试验指南《鱼类胚胎急性毒性（FET）试验》，采用斑马鱼胚胎对柠檬酸银纳米颗粒（CtAgNPs）的毒性进行了评估。实验期间，对暴露于不同浓度柠檬酸银纳米颗粒的斑马鱼胚胎存活率进行了监测。本研究中，经柠檬酸银纳米颗粒处理的斑马鱼（斑马鱼属）胚胎在整个暴露周期内未出现发育异常、死亡或孵化延迟的情况，表明柠檬酸银纳米颗粒具有生物相容性且无毒性。暴露于柑橘融合介导银纳米颗粒（50微克/毫升）的斑马鱼胚胎表现出正常孵化，且未检测到发育缺陷。然而，以往研究表明，高浓度银纳米颗粒可能因银离子释放引发氧化应激，进而导致斑马鱼胚胎存活率下降和发育紊乱。研究结果显示，柠檬酸银纳米颗粒在低浓度下具有生物相容性，与化学合成银纳米颗粒相比毒性极低。24小时pf（受精后小时）时胚胎存活率稳定，表明其具有初始耐受性；而48小时pf后存活率逐渐下降，体现了毒性具有时间和剂量依赖性。高浓度（25-100微克/毫升）下的孵化延迟现象，进一步说明需谨慎把控剂量。尽管存在孵化延迟，整体孵化率仍保持相对稳定，说明毒性处于可控范围。这反映出蝶豆中生物活性化合物的重要作用，其有助于减轻银纳米颗粒暴露引发的细胞毒性效应。

与氨苄青霉素抗生素相比，CtAgNPs 对变形链球菌和粪肠球菌具有较强的抗菌作用。其有效的抗菌活性可能源于银离子的缓慢释放以及 CtAgNPs 对细菌细胞的渗透作用。CtAgNPs 对变形链球菌和粪肠球菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为 6.25 微克/毫升和 3.125 微克/毫升，最低杀菌浓度（MBC）分别为 12.5 微克/毫升和 6.25 微克/毫升。变形链球菌和粪肠球菌的耐受值均为 2，这表明 CtAgNPs 具有强大的杀菌潜力。这一较低的耐受值凸显了 CtAgNPs 在控制牙科病原体方面的潜在有效性。CtAgNPs 的这种强抗菌作用可能源于多种机制，包括氧化应激、造成损伤破坏细菌细胞膜并干扰其代谢过程。纳米颗粒体积小、比表面积大，能更好地黏附在细菌表面，造成更严重的损伤并使其死亡。此外，蓝蝴蝶花中的生物活性化合物（即多酚和类黄酮）通过破坏细胞膜、抑制多种参与重要代谢通路的酶的功能，发挥抗菌作用。同样地，Ranjani 等人（2021a）报道了植物基银纳米颗粒的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为12.5微克/毫升和25微克/毫升。Rajeshkumar 等人（2021）报道了芦荟衍生纳米颗粒的MIC和MBC值低至6.25微克/毫升和12.5微克/毫升。Singh 等人（2025）也得到了类似的研究结果，他们对常见口腔病原体进行了抗菌活性评估，发现银纳米颗粒在低至25微克/毫升的浓度下就表现出显著的抑制效果，在100微克/毫升时抑制作用达到峰值。这些纳米颗粒展现出广谱抗菌活性，对变形链球菌和金黄色葡萄球菌尤为有效。同样，Yin 等人（2020）报道，在牙科材料中添加银纳米颗粒有助于防止细菌黏附和生物膜形成。蓝蝴蝶花银纳米颗粒（CtAgNPs）具有强大的抗生物膜活性，能有效应对持续性感染和与生物膜相关的感染。球形结构的蓝蝴蝶花银纳米颗粒比表面积大，可与细菌生物膜的胞外聚合物（EPS）层发生更强的相互作用，更易破坏细胞膜并导致细菌死亡。此外，蓝蝴蝶花中的生物活性化合物还能与银离子协同作用，提升其抗生物膜活性。总体而言，这些研究结果表明，蓝蝴蝶花银纳米颗粒可作为治疗牙科病原体引发的生物膜感染的可持续抗生素替代品。其绿色环保的合成方式以及持久的抗生物膜活性，使蓝蝴蝶花银纳米颗粒成为治疗生物膜相关感染的极具潜力的替代品。Khan 等人（2022）报道，绿色纳米颗粒具有更优的抗生物膜活性，这可能是因为它们会破坏细菌细胞膜，或干扰生物膜形成所必需的细胞信号通路。

碳纳米银颗粒的一种作用机制研究表明，其会破坏细菌细胞膜，导致蛋白质和糖类等重要细胞内成分泄漏。蛋白质释放量的增加凸显了细胞膜的严重损伤和细胞完整性的丧失，而糖类的泄漏则揭示了细菌细胞内代谢平衡的破坏。丙二醛（MDA）水平升高证实，碳纳米银颗粒会诱导氧化应激，导致细菌细胞膜发生脂质过氧化。这种氧化损伤进一步破坏了膜的稳定性，并加剧了细胞大分子的泄漏。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性的显著下降表明，碳纳米银颗粒会显著削弱细菌的抗氧化系统，诱导更强的氧化应激和更严重的细胞损伤。这些研究结果与此前的研究一致Basha等人（2025年）的研究发现探究了茄属植物介导的银纳米颗粒（AgNPs）对牙科病原体的作用。Negi等人（2024年）利用延龄草提取物开发了一种绿色合成的石墨烯-银纳米复合材料（GO-Ag），并在多重耐药铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中对其进行了测试。该纳米复合材料的最低抑菌浓度（MIC）为31.25–125微克/毫升，生物膜抑制率达80%–96%。透射电子显微镜（TEM）和活菌/死菌检测显示细菌细胞膜受到严重损伤，证实了细胞膜完整性被破坏。研究证实了活性氧（ROS）的产生，表明氧化应激是杀灭细菌的关键机制。他们还观察到过氧化氢酶和超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的活性显著下降，这也印证了氧化应激的存在。本研究的发现对于防控变形链球菌和粪肠球菌这类关键的牙科致病菌具有重要意义，这两种细菌是龋齿和牙髓感染的主要致病因素。由于生物膜的形成以及抗生素耐药性的产生，传统抗生素往往无法彻底清除这类细菌。CtAgNPs强大的抗菌特性表明其有望成为牙科领域的替代治疗制剂。其诱导氧化应激、破坏细菌细胞膜的能力，凸显了它们在对抗顽固性牙科感染方面的有效性。

结论

本研究凸显了基于微流控技术的银纳米颗粒（CtAgNPs）——源自蝶豆花卉提取物——在对抗牙科感染方面作为有效且可持续方法的巨大潜力。绿色合成与微流控技术的融合，不仅能精准调控纳米颗粒的特性，还符合环保且生物相容的标准。表征研究证实，CtAgNPs 具备理想的尺寸、形状和稳定性，而利用斑马鱼胚胎开展的体内实验验证了其在抗菌浓度下的安全性。重要的是，CtAgNPs 对粪肠球菌和变形链球菌这两种关键口腔病原体展现出强效抗菌作用，可破坏其氧化应激防御机制并抑制生物膜形成。总体而言，CtAgNPs 为应对与龋齿和根管感染相关的口腔病原体提供了一种新型可持续解决方案。其在牙膏、漱口水、牙科涂层等牙科护理产品中的潜在应用，有望通过提供更安全、更有效的抗菌剂替代品，彻底改变口腔卫生领域。未来的研究对于将这些研究成果转化为实际的牙科治疗手段至关重要。

材料与方法

蝶豆花花水提取物的提取、植物化学及气相色谱-质谱联用分析

新鲜阴蒂花采自钦奈西坦巴拉姆斯里奇特拉苗圃花园（12.935461°N，80.122322°E）。阴蒂花被鉴定并经金奈植物学家D·纳拉辛汉博士鉴定，凭证标本已存放于金奈BSACIST生命科学学院（馆藏编号：SLS-BSAU25005）。将花朵置于室温下阴干5天。取10克干燥花瓣，在200毫升高压灭菌蒸馏水中煮沸10分钟，冷却后通过Whatman 1号滤纸过滤。滤液以3000转/分钟的速度离心20分钟。上清液再次通过Whatman 1号滤纸过滤三次，得到澄清提取物。通过一系列定性植物化学分析，鉴定了蝶豆花朵提取物中含有的植物成分。

采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析对花卉提取物中植物化合物的详细定性和定量数据进行了鉴定。将水提物浓缩并冻干成细粉。将冻干粉用甲醇按1:1比例稀释，并用注射器过滤器进行0.22微米过滤。将1微升样品注入GC-MS系统（珀金埃尔默Clarus 680/600 T气相色谱-质谱联用仪，标准毛细管柱），在电子轰击模式（70电子伏特）下记录质谱图，并通过将保留时间和碎片模式与NIST数据库匹配来鉴定化合物。

蝶豆介导银纳米颗粒（CtAgNPs）的微流控系统介导合成与表征

本研究采用嵌入蛇形微混合器的微流控系统合成了蝶豆介导的银纳米颗粒（CtAgNPs），该微混合器的尺寸为57×32×6微米，在(10 ~mL ~h^{-1})的流速下，微流控蛇形混合器从入口到出口的总停留时间为2.6秒。该微混合器包含8个蛇形环路，每个环路的停留时间约为0.32秒。通过注射泵将1毫摩尔硝酸银溶液与蝶豆花水提液按1:1的比例注入聚二甲基硅氧烷微流控系统。采用紫外-可见光谱法、傅里叶变换红外光谱法、场发射扫描电子显微镜法、能量色散X射线光谱法、动态光散射法及Zeta电位法对合成的CtAgNPs进行了表征。观察到明显的颜色变化后，立即对合成的CtAgNPs进行紫外-可见光谱分析，以确认纳米颗粒的合成。使用配备1厘米石英比色皿的JASCO V-730分光光度计，在200–800纳米的波长范围内进行光谱扫描，并用蒸馏水进行基线校正。通过紫外-可见光谱分析确认CtAgNPs合成后，将胶体溶液以6000转/分钟的转速重复离心3次，每次10分钟，得到纯化的纳米颗粒。将沉淀合并，并用高压灭菌蒸馏水洗涤，以去除未还原的硝酸银。将沉淀干燥至细粉末状态，随后使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）在66.1千倍的放大倍数下对其进行分析。

使用TESCAN MIRA3仪器进行测试。工作距离设置为10.55毫米，采用二次电子（SE）探测器。为确保最佳的表面分辨率，样品在10.00千伏的加速电压下进行成像。场发射扫描电子显微镜（FESEM）结合EDAX能谱分析仪被用于研究合成的CtAgNPs的元素组成。采用JASCO红外光谱仪对CtAgNPs粉末进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，扫描范围为399至(4000 ~cm^{-1})，数据分辨率为(0.964 ~cm^{-1})。将1毫克/毫升的CtAgNPs细粉末溶解于10%的二甲基亚砜（DMSO）中，经超声处理得到纳米颗粒均匀分散的胶体溶液。采用安东帕Litesizer™动态光散射（DLS）仪结合Zeta电位分析仪对CtAgNPs胶体溶液进行测试，通过测定流体动力学直径、多分散性指数和表面电荷来分析纳米颗粒的粒径。测试在25℃的水悬浮体系中进行，所有读数均进行三次重复记录以保证可重复性。

评估银纳米颗粒在斑马鱼胚胎中的毒性

为评估 CtAgNPs 的生物相容性，本研究以斑马鱼（斑马鱼属）胚胎为体内模型开展毒性评估。CtAgNPs 对斑马鱼胚胎的毒性研究遵循 ARRIVE 指南进行，并已根据斯里兰卡医学科学研究所（本地治里）的机构指南和法规，获得该机构伦理委员会的批准（编号：IEC/C-P/11/2023）。本研究选取不同浓度的 CtAgNPs（1.5 微克/毫升、3.125 微克/毫升、6.2 微克/毫升、12 微克/毫升、25 微克/毫升、50 微克/毫升、75 微克/毫升、100 微克/毫升），以分析其剂量依赖性效应。野生型斑马鱼胚胎采自金奈市马尼曼加拉姆的塔伦养鱼场（邮编 601301）。胚胎在 E3 胚胎培养基（5 毫摩尔氯化钠、0.17 毫摩尔氯化钾、0.33 毫摩尔氯化钙、0.33 毫摩尔 (MgSO_{4})，pH 7.2）中，于标准实验室条件下，在 28±1℃、14:10 小时的光暗周期中培养。用不同浓度的 CtAgNPs（1.5 微克/毫升、3.125 微克/毫升、6.2 微克/毫升、12 微克/毫升、25 微克/毫升、50 微克/毫升、75 微克/毫升、100 微克/毫升）处理斑马鱼胚胎，对照组则不做任何处理。本实验按照经济合作与发展组织第 236 号指南《鱼胚急性毒性试验》进行，设置三次重复实验。采用概率单位分析法（芬尼，1952） 计算 CtAgNPs 的 (LC_{50})。使用复合显微镜观察胚胎直至受精后 96 小时，记录孵化率、心率、形态畸形及存活率等指标，以检测潜在的发育或生理异常。基于斑马鱼胚胎的毒性评估为 CtAgNPs 的生物相容性和安全性提供了关键数据，为其在环保型应用中的使用提供了支撑。

研究蝶豆衍生银纳米颗粒（CtAgNPs）的抗菌功效

研究人员参照2022年Khan等人的方法，采用96孔板对合成的CtAgNPs进行抗菌活性评估。向所有孔中加入LB肉汤，将CtAgNPs从0.39微克/毫升到100微克/毫升进行系列稀释。每孔接种2微升细菌培养物，对照组为仅含LB肉汤的菌株。氨苄青霉素（25微克/毫升）作为阳性对照。将培养板置于37℃培养24小时，在24小时时通过肉眼观察浊度来确定最低抑菌浓度（MIC）。在培养12小时和24小时时，通过测定600纳米处的吸光度来分析生长杀灭曲线。采用点滴平板法确定最低杀菌浓度（MBC），即培养24小时后能完全杀灭细菌生长的CtAgNPs浓度。

CtAgNPs 抗生物被膜性能的评估

参照（Basha 等人，2025；Khan 等人，2022）的方法，采用微量滴定板法评估生物膜形成情况：向各对应孔中加入100微升LB肉汤培养基，再加入100微升系列稀释的柠檬酸银纳米颗粒（浓度1毫克/毫升）和氨苄青霉素。向每孔接种2微升细菌培养物。将平板置于摇床中，37摄氏度下培养48小时。弃去所用培养基，清洗平板。平板完全风干后，加入0.1%结晶紫染色液（100微升），静置15分钟。用流水清洗平板并晾干。加入100微升30%冰醋酸对结合的结晶紫进行脱色。使用分光光度计在580纳米波长下测定吸光度。吸光度值为处理组和未处理组细菌菌株的生物膜形成程度提供了定量数据。

探究CtAgNPs的作用机制

为确定蝶豆来源银纳米颗粒（CtAgNPs）对细菌细胞膜完整性的影响，研究人员在变异链球菌和粪肠球菌的最小抑菌浓度（MIC）下分别用CtAgNPs和氨苄青霉素对其进行处理。于37℃孵育6小时后，对细胞进行离心，收集上清液，分别采用考马斯亮蓝法和蒽酮法检测蛋白质与糖类的泄漏量。通过检测丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平，观察CtAgNPs引发的氧化损伤。向经CtAgNPs和氨苄青霉素处理的细胞中加入硫代巴比妥酸（TBA）和十二烷基硫酸钠（SDS），于95℃孵育，随后对全部反应液进行离心，收集上清液，按照Basha等人2025年的研究方法，在530nm波长下测定吸光度，以检测MDA（脂质过氧化生物标志物）的含量。参考Soundharajan等人2025年的研究，用Ellman试剂处理细菌裂解液，通过检测412nm波长下的吸光度来测定GSH水平。参照Basha等人2025年以及Soundharajan和Srinivasan 2025年的研究方法，通过监测过氧化氢的变化来测定过氧化氢酶（CAT）活性。在240纳米处的分解。通过记录560纳米处氮蓝四唑（NBT）的还原情况来测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，该指标反映了细菌细胞中和超氧自由基的能力。

统计学分析

所有实验分析均进行三次重复，采用t检验（student t-test）确定统计学显著性。其中*表示t检验（* P<0.001)）。