题目：Preparation and bioactivity of probiotic-fermented lotus seed and lily bulb beverage

原文链接：https://doi.org/10.3389/fmicb.2026.1796122

期刊：Frontiers in Microbiology

摘要

引言：莲子和百合含有丰富的活性成分，包括多糖、黄酮类、多酚类和皂苷类物质，这些成分具有抗氧化、抗炎、免疫调节等多种生物活性。因此，莲子和百合在食品和化妆品行业中得到了广泛应用。

方法：首先，采用19株益生菌菌株（包括酵母菌属和乳杆菌属）对莲子、百合及其混合物进行发酵。通过比较不同菌株和发酵方式下发酵产物中的总多糖和总黄酮含量，筛选出适宜的发酵方式和菌株。其次，采用单因素试验和响应面优化法，利用DesignExpert 10软件进行Box-Behnken试验设计，以自由基清除率为响应值，探究影响莲子百合发酵 broth中多糖含量的三个关键因素：发酵时间、物料浓度和温度。第三，以鸡胚尿囊绒毛膜为体外眼刺激性测试替代模型，评价优化条件下发酵产物的安全性。第四，以LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7单核细胞作为细胞炎症模型，(H_{2} O_{2})诱导的人永生化角质形成细胞（HACAT）作为细胞氧化模型，小鼠黑色素瘤细胞B16-F10来评价发酵产物的体外抗炎、抗氧化及抑黑素作用。以(H_{2} O_{2})诱导的斑马鱼胚胎作为动物氧化模型，硫酸铜诱导的斑马鱼作为动物炎症模型，斑马鱼幼体来评价发酵产物的体内抗炎、抗氧化、抑黑素及美白皮肤效果。此外，采用TCC法和K-B纸片扩散法，检测发酵产物对金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌等常见痤疮致病菌的抑制作用。

结果：从20株益生菌中筛选出植物乳杆菌L-08作为发酵优势菌株。确定的优化发酵条件如下：发酵温度28℃、料液比1:35、发酵时间48小时、接种量1%。益生菌发酵显著增强了莲子百合混合发酵液的抗氧化和抗炎生物活性。在细胞实验中，确定莲子百合发酵液对各类细胞的安全浓度范围为0.625%至10%。在HaCaT细胞氧化模型中，莲子百合发酵液显著提高了总抗氧化能力。在RAW 264.7巨噬细胞模型中，它有效抑制了炎症介质的产生。在B16-F10黑色素瘤细胞模型中，它抑制了黑色素合成通路，展现出显著的美白效果。在斑马鱼损伤实验中，浓度为2.5%–10%的莲子百合混合发酵液显著提升了斑马鱼的总抗氧化能力，同时还表现出抗炎作用。在鸡胚尿囊膜实验中，莲子百合混合发酵液未对尿囊膜血管造成明显损伤，证明了其安全性。未发酵组与益生菌发酵组的对比分析证实，益生菌发酵显著增强了莲子百合混合发酵液的抗氧化和抗炎生物活性。

讨论：莲子百合复合发酵液具有抗氧化和抗炎的生物活性，且细胞存活率在90%以上，细胞毒性较低，这一特性可拓展其在保健品、药妆领域的应用。

关键词：生物活性、发酵、莲子百合、微生物、益生菌

引言

莲子取自睡莲科植物*睡莲*的干燥成熟种子，不仅口感佳，还营养丰富。其含多糖、黄酮类、多酚类、皂苷类等活性成分，具有抗炎（Bellahcene 等人，2026）、抗氧化、免疫调节等多种生物活性。同样，百合作为百合科植物，在烹饪和药用领域均被广泛应用。临床上，它被视为滋阴润肺、清热安神的名贵药材。百合富含多糖、黄酮类和皂苷类成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎、免疫调节等药理作用（Abbate 等人，2021）。莲子和百合的有效成分及药理作用一直是国内外学者的研究热点。在医学领域，这类植物常被用于抑制炎症反应、调节血糖水平和降低脂质含量。此外，莲子和百合均在皮肤抗氧化方面展现出潜力，适合添加至抗皱及皮肤健康养护类化妆品配方中，表明其在化妆品行业具有良好的应用前景。

微生物发酵技术是一种利用微生物代谢活性转化底物的生物催化工艺。微生物发酵的机制主要包括主要体现在以下方面：首先，微生物分泌胞外酶对有机底物的细胞壁进行生物降解，提高细胞膜的通透性，从而充分释放并利用底物中的营养物质。其次，微生物代谢活动产生的次级代谢产物可通过结构修饰改变底物组成，进而影响其性质与功能（帕帕吉安尼，2004）。与化学方法相比，微生物发酵技术具有可控性更强、安全性更高、副产物更少的优势。因此，该技术在食品工业、制药生产、生物能源制备及环境保护领域具有广阔的应用前景。

益生菌的生产是一门整合了微生物学、发酵工程以及食品加工技术的系统性流程。其核心在于培养特定的有益微生物，再将这些微生物加工成适合保存和食用的产品。主要生产步骤如下：菌株筛选与培养、菌株筛选：首先从自然环境中筛选出活性高、稳定性好且对人体有益的菌株。这些菌株必须通过安全性和功能性测试，包括耐酸性、定植能力以及益生菌功效。纯培养：在实验室中对筛选出的优质菌株进行纯培养，确保其不被杂菌污染，通常会将其储存在低温或冻干环境中以维持活性。大规模发酵培养、种子扩培：对保存的种子菌种进行逐步扩大培养和转接从实验室规模的摇瓶到中试规模发酵罐，最终到工业规模的大型发酵罐，以快速增加细菌数量。发酵生产：在大型发酵罐中，对温度、pH值、含氧量等条件进行控制。提供碳源、氮源、维生素及其他营养物质，使益生菌大量繁殖，达到目标浓度。收获与浓缩。发酵结束后，通过离心、过滤等分离技术将益生菌菌体与发酵液分离。去除废液和杂质，得到浓缩的菌泥。冷冻干燥或灭活。活菌益生菌产品：为延长保质期，对菌泥进行冷冻干燥处理，最大限度保留菌体的活性。植物乳杆菌L-08是本研究采用的优良益生菌菌株。它对莲子、百合的草本基质具有较强的适应性，还能高效介导大分子物质生物转化为生物活性小分子代谢物。L-08的发酵显著提高了皮肤功能成分的含量，使产品在化妆品和美容应用中具备更强的抗氧化、抗衰老及皮肤修复功效。

本研究旨在通过益生菌发酵制备发酵莲子百合，并探究其在养生、美容及药用方面的应用可行性。研究采用益生菌制备了19种发酵莲子百合样品，对比各组的总黄酮含量与总多糖含量，以全面筛选出最适用于莲子百合发酵的菌株。

结果与讨论

优势菌株筛选及最佳配比

本研究首先利用微生物发酵技术筛选发酵方法和优势菌株，并采用多种益生菌制备了19种不同的莲子百合发酵液。结果表明，乳酸菌在提高多糖含量方面优于酵母菌，其中L-08乳酸菌对总多糖含量的提升效果最为显著，如图1所示。当百合与莲子的比例为4:2时，混合发酵效果最佳。

图1.莲子单独发酵、百合单独发酵及莲子与百合混合发酵的多糖含量对比（与对照组相比，(**P<0.01) 1. (***P<0.001)

发酵条件的优化

单因素实验

以莲子百合发酵液中总多糖含量为指标，采用单因素法考察发酵时间、发酵温度、料液比和接种量对发酵液中多糖含量的影响。单因素实验结果如图2所示。以乳酸菌L-08与百合鳞茎按4:2的比例代表莲子为 （注：原文末尾未完整，译文也保留此不完整状态，严格对应原文内容）对照组中，YF-5发酵的莲子百合经72小时发酵后，总多糖含量达到最大值（图2A）。当补料批比为1:35时，发酵百合鳞茎液中的总多糖含量达到最高水平（图2B）。然而，超过该比例后，总多糖含量逐渐下降。如图2C所示，当发酵温度为28℃时，发酵百合鳞茎液中的总多糖含量达到峰值。当细菌接种量增加至1%时，发酵百合鳞茎液中的总多糖含量达到最大值。但当植物乳杆菌L-08的接种量超过1%时，发酵百合鳞茎液中的总多糖含量呈下降趋势（图2D）。

图2 单因素实验。(A) 发酵时间。(B) 固液比。(C) 发酵温度 (D) 菌液接种量。（与对照组相比，(p 0.05) 和 (* * p<0.01)

采用单因素法考察了发酵时间、发酵温度、接种量和料液比对多糖含量的影响，并确定了最佳发酵条件为料液比1:35（g/mL）、接种量1%、28℃发酵48小时。

刘等人（2020年）的研究提出，底物浓度是发酵过程中的关键参数。在筛选参数时，需要在维持发酵菌株活性与避免底物过载对发酵产物品质产生不利影响之间取得平衡。合理的接种量对发酵过程的健康运行和效率至关重要；高接种量会导致多糖含量降低，并抑制菌株生长，这与格雷泽和阿夫乔格鲁（2022年）的研究结果一致。在莲子与百合的混合发酵中，发酵温度是关键因素，它会影响乳酸菌生长过程中的生物酶活性及生化反应。这一发现与杜等人（2022年）的研究结果相符，强调了在莲子与百合混合发酵中调控适宜发酵温度的重要性。L-08菌株的代谢活动促进多糖的合成，但经过一定时间后，多糖可能开始发生分解或转化过程。发酵时间对多糖含量的影响与菌株的代谢活动及底物利用情况相关，这与李等人（2021年）的研究结果一致。

普拉切特-伯曼实验结果

通过使用Design-Expert 11.0软件进行的PB试验，测定了不同实验条件下的多糖含量。该系统分析了发酵时间、发酵温度、接种量和料液比对莲子百合发酵的影响，以确定发酵过程中影响多糖含量的最显著因素。结合Plackett-Burman试验结果，建立了多元线性回归方程(R 1=+148.91) 18.69A-16.37B-1.06C-8.87D，用于描述莲子百合发酵液中多糖含量R1与处理因素A、B、C之间的关系。经回归分析，该模型表现出良好的拟合度((R^{2}=0.8793))，且具有统计学意义显著性 ((P=0.0025))，置信水平为95%。在影响因素的单因素分析中，其重要性从高到低排序如下：A-液料比 ((P=0.0015))、B-接种量 ((P=0.0031))、D-时间 ((P=0.0475))、C-温度 ((P=0.0814))。结果见表3。

响应面法实验结果

Plackett-Burman（PB）试验筛选出影响莲子百合发酵的三个最显著因素：时间、料液浓度和温度。随后采用Box-Behnken（BB）试验设计对这些条件进行优化。Box-Behnken试验设计的结果见表4。对试验数据进行回归拟合，建立模型：R1 = +182.86+5.63A+2.09B+9.48C+8.39AB+0.6962AC+5.19BC-32.81A²-23.72B²-35.94C²，其中R1代表莲子百合发酵液的多糖含量，A、B、C分别代表料液比、接种量和发酵时间。该模型拟合效果良好，决定系数R²为0.9827，校正决定系数Adj R²为0.9604，表明模型与实际数据匹配度良好。通过软件对各因素最优水平的分析与预测结果如图3A-C所示，得出的最佳优化参数为：料液比35.486 mL/g、接种量1.307%、发酵时间49.655 h。对三组平行试验结果取平均后，莲子百合发酵液的多糖含量为183.869 mg/g。验证实验结果显示多糖含量为180.750 mg/g，与预测值相符，证明该模型构建成功。

在发酵的最佳条件下，多糖含量较优化前提升了约17%（154.485毫克/克）。该优化工艺旨在构建高效且经济的发酵体系，为莲子百合混合发酵液的生产提供科学依据。这不仅有利于活性生物成分的规模化制备，还符合绿色生产理念，为功能性食品和药品的生产提供了可行且可持续的解决方案。本研究旨在为工业化生产提供更高效、更环保的发酵工艺。

图3.固液比、菌添加量和发酵时间对发酵液中多糖含量的交互作用

莲子百合发酵液的安全性评价

本研究以鸡胚尿囊膜作为眼刺激性试验的体外替代模型，采用莲子百合发酵液对其安全性进行了评价最大耐受浓度法。结果显示，Texapon ASV 在不同浓度下会引起不同程度的出血和血管扩张，而氢氧化钠（NaOH）则出现凝血现象（见图4A）。随后，观察了阴性对照（0.9%生理盐水）和100%莲子百合发酵液对鸡胚尿囊膜（CAM）血管的影响。结果表明，两者均未阴性对照组以及100%莲子百合发酵液均未引发出血、凝血或血管扩张现象，且血管网络结构与轮廓保持清晰（见图4B）。因此，无需开展进一步的稀释浓度测试。综上，我们得出结论，莲子百合发酵液对眼睛无刺激性或仅具有轻微刺激性，表明其是一种安全且无刺激性的制剂。

图4.（A）阳性对照组和参考对照组的CAM图像。发酵液组。（B）阴性对照和莲子和百合球的CAM图

发酵产物对RAW 264.7细胞模型的体外抗炎活性研究

莲子和百合发酵对RAW 264.7细胞活性的影响

不同处理组下使用MTT法（Buranaamnuay，2021）测定RAW 264.7细胞的相对细胞活力，如图5A所示。对照组细胞活力设定为100%，浓度为20-40%的莲花百合发酵液对RAW 264.7细胞影响显著，相对细胞活力低于70%。相比之下，浓度为0.625-10%的莲花百合发酵液对RAW 264.7细胞影响较小，相对细胞活力高于70%。因此，用RAW 264.7细胞作为细胞炎症模型的莲花百合发酵液浓度为0.625-10%。

莲子和百合发酵对RAW264.7细胞TNF-α（肿瘤坏死因子）含量的影响

成熟的LPS刺激的小鼠巨噬细胞RAW 264.7作为体外细胞炎症模型，测量不同浓度的莲花百合发酵肉汤处理后TNF-a水平的变化。获得的标准曲线为(y=0.0088)x+0.0767((R^{2}=0.9979))建立的TNFα标准曲线在95%CI内可靠。与对照组（54.456 pg/mL）相比，模型组（273.301 pg/mL）显示TNF-α水平升高约5.02倍，表明成功构建了细胞炎症模型。与模型组相比，莲花百合发酵肉汤浓度为10%（117.752 pg/mL）时，TNF(-C2)水平显著降低，显示出显著差异((P<0.001))这些结果表明，随着莲花百合发酵肉汤浓度的增加，细胞炎症模型中的TNF-(###)水平逐渐降低。浓度为10%时，与阳性组（178.888 pg/mL）相比，降低率更明显，如图5B所示，具有统计学意义((P<0.05))表明荷花百合发酵液对炎症有抑制作用，且具有显著性。

莲子百合发酵液对RAW264.7细胞NO含量的影响

通过测量不同浓度莲花百合发酵液处理的细胞炎症模型中的一氧化氮含量，得到了一个标准曲线：(y=0.0038 x+)0.0811((R^{2}=0.9906))建立的一氧化氮标准曲线在95%的置信区间内是可靠的。将每个实验组的一氧化氮吸光度值插入标准曲线得到的结果如图5C所示，表明莲花百合发酵液可以降低细胞中的一氧化氮含量，特别是在10%的浓度下，其中e等显着，并显示出高度显着的二((P<0.001))。

发酵产物对HACAT细胞模型体外抗氧化活性的研究

莲子百合发酵液对HACAT细胞活性的影响

采用MTT法测定不同浓度荷花和百合发酵液中HACAT细胞的活力，如图6A所示，对照组HACAT细胞的相对细胞活力设定为100%，而0.625-10%发酵液组的相对细胞活力在70%以上，与对照组相比，20-40%发酵液组的相对细胞活力在70%以下。因此，用于通过HACAT细胞进行抗氧化实验的荷花与百合发酵液浓度设定为0.625%–10%。

图5.（A）不同浓度的莲子百合发酵液对RAW246.7细胞存活率的影响。（B）肿瘤坏死因子-α含量（与模型组相比，(* * P<0.01) (***P<0.001) (#P<0.05)）（C）一氧化氮含量（与模型组相比，(* * P<0.01) (***P<0.001)）

莲子与百合发酵对HaCaT细胞总抗氧化能力、过氧化氢酶活性、丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性的影响

通过测定(H_{2} O_{2})诱导的氧化损伤，测定了所建立的HaCaT细胞模型在不同处理条件下的总抗氧化能力。标准曲线为(y=-1.0447 times+1.511)，其在95%置信区间内具有可靠性。将各组数据代入该标准曲线，得到了HaCaT细胞在不同处理条件下的总抗氧化能力。如图6B所示，与对照组相比，模型组的总抗氧化能力下降了约70%，表明HaCaT细胞模型构建成功。这说明发酵莲子百合水可能增强细胞的抗氧化防御系统，从而提高细胞对氧化损伤的抵抗能力。

在不同组细胞的氧化损伤模型中测定了过氧化氢酶（CAT）的活性。实验结果（图6C）显示，与对照组相比，模型组的CAT酶活性降低了约3.5倍，表明HACAT细胞氧化模型构建成功。随着莲子百合发酵液浓度的升高，CAT酶活性逐渐升高，提示莲子百合发酵液具有显著的抗氧化活性。

通过不同的细胞氧化损伤模型，对丙二醛（MDA）的含量进行了测定。实验结果显示，与对照组相比，模型组的丙二醛含量增加了近2.72倍（图6D），证实HACAT细胞氧化模型构建成功。随着莲子百合发酵液浓度的升高，HACAT细胞中的丙二醛含量逐渐降低。与模型组相比，莲子百合发酵液组的丙二醛含量存在显著差异（(P<0.01)、(P<0.001)），验证了莲子百合发酵液作为潜在抗氧化剂的有效性。

在不同的细胞氧化损伤模型中检测了超氧化物歧化酶（SOD）的活性，结果如图6E所示。与对照组相比，模型组的超氧化物歧化酶（SOD）活性下降了近三倍，证实人永生化角质形成细胞（HACAT）氧化模型构建成功。随着莲子百合发酵液浓度的升高，超氧化物歧化酶（SOD）活性逐渐上升。与模型组相比，莲子百合发酵液组在超氧化物歧化酶活性上呈现出显著的统计学差异，这表明莲子百合发酵液可能通过正向调控超氧化物歧化酶活性，增强机体对抗氧化损伤的生物防御能力。

图6.（A）HaCaT细胞相对存活率。（B）HaCaT细胞总抗氧化能力 与模型组相比，(**P < 0.01)、(***P<0.001) （C）HaCaT细胞中过氧化氢酶（CAT）活性（与模型组相比，(*P<0.05)、(* * P<0.01) （D）细胞中丙二醛（MDA）含量（与模型组相比，(* * P<0.01)、(***P<0.001) ）（E）细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性（与模型组相比，(*P<0.05)、(**P < 0.01)、(***P<0.001)

发酵产物对B16-F10细胞模型体外美白活性的研究

莲子百合发酵对B16-F10细胞活性的影响

通过MTT法，我们筛选出莲子百合发酵液对B16F10黑色素瘤细胞的适宜浓度范围（韩等，2020）。结果显示，与对照组的细胞活力（100%）相比，随着莲子百合发酵液浓度的升高，B16-F10细胞的细胞活力逐渐下降。当莲子百合发酵液浓度在0.625%至10%之间时，细胞相对活力无显著下降，保持在60%以上；而当浓度当浓度超过10%时，细胞活力显著下降。因此，我们确定了0.625–10%的浓度范围（图7A），在该范围内，莲子百合发酵液不仅对细胞活力无显著影响，还呈现出抑制B16-F10黑色素瘤细胞增殖的趋势。

图7.关于B16-F10细胞存活率的研究。(B) 细胞中酪氨酸酶抑制率（与对照组比较，(* * P<0.01)、(***P<0.001)）。(C) 细胞中黑色素抑制率（与模型组比较，(**P<0.01)、(***P<0.001)）。(A) 不同浓度人参发酵液的作用效果

莲子百合发酵液对B16-F10细胞酪氨酸酶活性的影响

实验结果表明，随着浓度逐渐升高，荷花百合发酵液对B16-F10细胞中酪氨酸酶的抑制率显著提升，如图7B所示。与对照组相比，不同浓度的荷花百合发酵液各组均存在显著差异((P<0.01))。经姜黄素处理的阳性对照组，其酪氨酸酶抑制率也显著提高((P<0.001))。这一发现充分证实了荷花百合发酵液对酪氨酸酶的抑制作用，从而验证了其潜在的美白功效。

莲子百合发酵液对B16-F10细胞黑色素生长抑制率的影响

我们通过测定B16-F10黑色素细胞的黑色素抑制率，评估了莲子百合发酵液对黑色素生成的影响。实验结果表明，随着莲子百合发酵液浓度的升高，黑色素抑制率逐渐上升。所有实验组与对照组相比，B16-F10 细胞中的黑色素含量呈下降趋势（图7C）。

莲子百合发酵液生物活性研究

莲子百合发酵液安全浓度的测定

根据图8A，睡莲发酵液浓度在1.25%至40%范围内时，斑马鱼胚胎的存活率逐渐下降，40%浓度下存活率为零，20%以下浓度时存活率超过50%。在图8B中，不同浓度睡莲发酵液处理下斑马鱼胚胎的孵化率数据显示，浓度低于10%时孵化率超过80%。图8C同时还展示了不同浓度的荷花百合发酵液下斑马鱼胚胎的畸形率，结果显示与对照组相比，当浓度低于10%时，畸形率低于20%。综合分析表明，在1.25%至10%的浓度范围内，大多数斑马鱼能够正常发育。因此，可确定荷花百合发酵液用于斑马鱼胚胎模型抗氧化实验的适宜浓度范围为1.25%至10%。

图8.(A) 发酵液对斑马鱼胚胎存活率的影响。(B) 发酵液对斑马鱼胚胎孵化率的影响。(C) 发酵液对斑马鱼胚胎畸形率的影响。(D) 藤茶发酵液的总抗氧化能力（斑马鱼）。（与模型组比较，(* * P<0.01)、(***P<0.001)）(E) 发酵液对斑马鱼丙二醛含量的影响（与模型组比较，(* * P<0.01)、(***P<0.001)）(F) 斑马鱼过氧化氢酶活性（与模型组比较，(* * P<0.01)、(***<0.001)）(G) 发酵液对斑马鱼超氧化物歧化酶活性的影响（与模型组比较，(* * P<0.01)、(***P<0.001)）

莲子百合发酵对斑马鱼总抗氧化能力的影响

将各组数据代入5.4.2.2中绘制的总抗氧化能力（T-AOC）标准曲线进行计算，得到了不同加工条件下斑马鱼总抗氧化能力的定量结果，如图8D所示。与模型组相比与对照组相比，所有发酵液组的总抗氧化能力（T-AOC）均呈现出显著的统计学差异（(P<0.01)、(P<0.001)）。不同实验组的T-AOC含量表现出明显的剂量依赖性效应，其中10%发酵液浓度组的T-AOC水平显著高于其他组。

莲子百合发酵对斑马鱼丙二醛含量的影响

在AAPH诱导的斑马鱼氧化损伤模型中（Abbate等人，2021年），我们测定了荷花百合发酵液处理的斑马鱼体内丙二醛（MDA）水平的变化，以评估其体内抗氧化活性。图8E展示了相应的结果。随着荷花百合发酵液浓度的升高，斑马鱼体内的MDA水平逐渐降低，与模型组相比存在显著差异（(P<0.01)、(P<0.001)）。这表明荷花百合发酵液对AAPH诱导的斑马鱼氧化损伤模型具有抗氧化保护作用。

莲子与百合发酵对斑马鱼超敏过氧化物酶过氧化氢酶活性的影响

在AAPH诱导的斑马鱼氧化损伤模型中，我们测定了荷花百合发酵液处理后斑马鱼体内过氧化氢酶（CAT）活性的变化，如图8F所示。各实验组均表现出一定程度的浓度依赖性，随着荷花百合发酵液浓度的升高，CAT活性逐渐增加。与模型组相比，所有实验组均存在显著差异（(P<0.01)、(P<0.001)），表明荷花百合发酵液在增强斑马鱼自由基抗性方面具有显著效果。

莲子与百合发酵对斑马鱼超氧化物歧化酶活性的影响

在AAPH诱导的斑马鱼氧化损伤模型中，我们测定了荷花百合发酵液处理后斑马鱼体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化，如图8G所示。与模型组相比，所有实验组均观察到显著差异（(P<0.01)、(P<0.001)），表明荷花百合发酵液显著增强了斑马鱼对自由基的抵抗力。

莲子百合发酵液对斑马鱼体内美白活性的研究

斑马鱼黑色素相对含量的测定

通过使用Image J软件对成像结果进行统计分析，我们评估了暴露于不同浓度荷花、百合发酵液及阳性对照组的斑马鱼黑色素生成情况。结果如下所示在图9中，图9A展示了黑色素在斑马鱼不同身体部位的沉积情况。随着莲与百合发酵液浓度的逐渐升高，黑色素生成量呈下降趋势，黑色素沉积也随之逐渐减少。这表明莲与百合发酵液对斑马鱼体内的黑色素合成具有抑制作用。

图9B展示了斑马鱼幼虫一侧黑色素相对含量的对比情况。随着荷花百合发酵液浓度的升高，其对黑色素生成的抑制作用也呈现出逐渐增强的趋势。与对照组相比，所有实验组的发酵液均显著降低了斑马鱼体内的黑色素含量（(P<0.01)、(P<0.001)）。

图9C展示了斑马鱼幼虫背部黑色素相对含量的变化趋势，与侧面黑色素相对含量的趋势一致。这些实验结果一致表明，莲子百合发酵液能显著抑制斑马鱼幼虫体内黑色素的合成，具有明显的美白活性。

莲子百合发酵对斑马鱼酪氨酸酶活性的影响

图9D所示结果表明，随着荷花和百合发酵液浓度的增加，其对酪氨酸酶的抑制率逐渐提高。与模型组相比，荷花百合发酵液组和阳性组均显著提高了酪氨酸酶的抑制率（(P<0.01)、(P<0.001)）。这表明在斑马鱼体内，荷花百合发酵液对酪氨酸酶活性具有显著的抑制作用。

莲子百合发酵液对斑马鱼体内模型的抗炎活性

莲子百合发酵对斑马鱼体内模型的抗炎作用

采用硫酸铜法诱导的斑马鱼炎症模型（Singh 等人，2022）来评估莲子百合发酵液的抗炎效果，如图9E、F所示。在荧光显微镜下，模型组的各区域均观察到明显的炎症细胞聚集和外渗趋势。而莲子百合发酵液组与阳性对照组则显著减少了炎症细胞的迁移，尾部平均细胞计数有所降低，与模型组相比存在显著差异（(P<0.01)、(P<0.001)）。这表明莲子百合发酵液在抑制斑马鱼炎症方面表现出显著的抗炎活性。

图9 （A）荷花与百合发酵物对斑马鱼黑色素生成、斑马鱼幼虫黑色素沉积的影响。（B）侧面相对黑色素含量；背部相对黑色素含量（与对照组相比，(* * P<0.01)、(***P<0.001)）（C）葡萄叶茶发酵 broth 对斑马鱼酪氨酸酶抑制率的影响（与模型组相比，(**P<0.01)、(***P<0.001)）（D）莲子与百合鳞茎发酵 broth 对斑马鱼炎症因子的影响。（E）荧光显微镜下斑马鱼幼虫的炎症位点图。（F）炎症位点的炎症细胞数量（与模型组相比，(* * P<0.01)、(***P<0.001)）。

莲子百合发酵液对致痘细菌的抑制作用

莲子百合发酵液的最低抑菌浓度（MIC）

以TTC作为指示试剂（Tanaka等人，2021年），测定莲子百合发酵液对供试细菌的最低抑菌浓度（MIC），结果列于表5。对于表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌，莲子百合发酵液的MIC为30%；对于痤疮丙酸杆菌，MIC为40%。

在K-B纸片法实验中，我们设置了不同浓度以考察抗菌效果。对于表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌，低、中、高浓度分别设为30%、50%和70%；对于痤疮丙酸杆菌，对应的浓度设为40%、60%和80%。图10A中的最小抑菌浓度（MIC）数据是对抗菌效果的初步评估。

莲子百合发酵液的抗菌活性

图10展示了采用K-B纸片法，不同浓度的莲花与百合发酵液对三种常见致痘细菌的抑菌活性。具体的抑菌圈尺寸如图10B所示。低、中、高浓度组以及阳性、阴性对照组中不同菌株的抑菌圈大小，反映出莲花与百合发酵液对这三种病原菌的抑制效果。尤其是在高浓度下，痤疮丙酸杆菌的抑菌圈达到(19.14 ± 0.58)毫米，效果最为显著。这些数据有力证明了莲花与百合发酵液在抑制致痘细菌方面具有潜在应用价值。

结论

目前关于草本发酵的研究大多集中在单一草本原料上，或仅对常规草本进行简单的复合发酵，且多聚焦于食品和保健品领域，对成分转化及医美应用的探索尚显不足。本研究首次实现了莲子与百合的科学复合协同发酵，突破了常规复合发酵中单一原料发酵活性不足、协同成分薄弱的短板，填补了该领域的研究空白。在代谢物层面，与传统研究仅关注单一草本总多酚、黄酮、多糖等类别成分含量不同，本研究通过混合发酵，诱导出单一原料发酵无法合成的功能性代谢物包括高活性酚酸衍生物、抗炎寡肽、多糖修复型片段等，其独特的身体组成与转化机制已研究明确，为功效发挥提供了核心物质基础。在应用领域方面，本研究首次聚焦该发酵产物在化妆品与医美领域的应用价值，依托其独特代谢物，阐明了其抗皮肤光老化、修复医美后受损屏障、舒缓敏感肌、淡化色素沉着、修复皮肤屏障等专属医美功效，突破了传统草本发酵产品应用场景单一的局限，为药食同源草本发酵产品在医美领域的发展提供了全新方向，兼具学术与应用创新价值。

本研究首次运用微生物发酵技术优化发酵工艺并筛选优势菌株，采用不同益生菌制备了19种莲子百合特色发酵产品。结果表明，不同益生菌对莲子百合发酵体系中功能成分的积累具有显著影响。与酵母菌相比，乳酸菌在提升多糖含量方面表现更优，其中乳酸菌L-08对莲子百合水溶性总多糖的促进作用最为显著。当百合与莲子配比为4:2的混合发酵条件下，水溶性总多糖积累量达到最高，这为莲子百合发酵产品的深度开发与利用提供了可靠依据和技术支撑。

其次，我们对莲子百合发酵液的制备工艺参数进行了优化。通过单因素分析和响应面法，确定了最优发酵条件。结果表明，各因素的最佳优化值为料液比35.486 mL/g、接种量1.307%、发酵时间49.655 h。在此条件下，莲子百合发酵液中的总多糖含量最高，该方法具有绿色、低耗、操作简便等优势，适合工业化应用。

随后，我们在CAM模型中评估了优化条件下发酵产物的安全性。结果显示，莲子百合发酵液在100%浓度下对鸡胚绒毛尿囊膜无刺激性，表明该发酵液对鸡胚绒毛尿囊膜具有较好的安全性，未观察到明显毒性。

在细胞实验中，我们确定莲子百合发酵液对各类细胞的安全浓度范围为0.625%～10%，并进一步评估了其多种生物活性。在探讨莲子百合发酵产品的功能活性过程中，体外细胞模型与体内动物模型的实验结果为发酵产品的生物活性提供了关键佐证。体外实验中，我们采用人永生化角质形成细胞（HaCaT）氧化损伤模型评估发酵产品的抗氧化活性，结果证实莲子百合发酵产品可有效缓解HaCaT细胞的氧化应激损伤，降低细胞内活性氧水平，提高抗氧化酶活性，这进一步证实了水溶性总多糖作为发酵产品核心活性成分的抗氧化功能。同时，本研究引入斑马鱼幼虫和胚胎模型进行体内功能验证。系统检测了斑马鱼胚胎的发育状态、斑马鱼幼虫的存活率及形态指标，以及体内抗氧化和氧化应激修复相关指标。结果表明，发酵莲子百合产品可促进斑马鱼胚胎正常发育，提高氧化应激下斑马鱼幼虫的存活率，并在体内发挥显著的抗氧化和氧化损伤保护作用。在HACAT细胞氧化模型中，莲子百合发酵液显著提高了总抗氧化能力；在RAW 264.7巨噬细胞模型中，其成功抑制了炎症介质的生成，尤其是在TNF-α抗炎实验中，10%浓度组的效果优于阳性药物（地塞米松组）；在B16-F10黑色素瘤细胞模型中，其抑制了黑色素合成通路，展现出显著的美白效果。

此外，在斑马鱼幼鱼和胚胎模型中，我们在2.5%–10%的安全浓度范围内评估了莲子百合发酵液的生物活性，重点研究了其抗氧化、美白及抗炎功效。实验结果表明，莲子百合发酵液可显著提升斑马鱼的总抗氧化能力，并通过抑制炎症细胞迁移发挥抗炎作用，为其在抗炎领域的应用提供了科学依据。同时，该发酵液在不同浓度下均能强效抑制黑色素合成，展现出显著的美白效果。这些研究发现为阐明莲子百合发酵液的作用机制、开发其治疗应用提供可靠的基础。

莲子百合发酵液在细胞和斑马鱼模型中不仅表现出多重抗氧化、抗炎和美白的生物效应，还对痤疮致病菌具有显著的抑制作用，为其作为天然抗菌剂应用于痤疮治疗提供了实验依据和科学依据。

综上所述，发酵莲子百合提取物具有抗氧化、美白、抗炎、抗菌等多种生物活性，在功能性应用方面具有广阔潜力。该研究不仅拓展了天然植物提取物在医美及治疗领域的应用前景，也凸显了药食同源理念在现代医学研究中的潜在价值。

材料与方法

材料与试剂

莲子和百合：均购自安徽亳州中药材交易中心。本实验所用乳酸菌和酵母菌均保藏于广东药科大学生物化学与分子生物学实验室。总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒及总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒及RPMI-1640培养基均购自Gibco公司。人永生化角质形成细胞（HACAT）、小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10）及小鼠单核巨噬细胞（RAW246.7）均为本实验室自行冻存于广东药科大学生物化学与分子生物学实验室。斑马鱼AB品系购自国家水生种质资源库斑马鱼资源中心（CZRC），并在本实验室孵化饲养。标记成熟绿色荧光炎性细胞的转基因斑马鱼Tg（corola: EGFP）由广东药科大学引进，在本实验室传代培养。

莲子百合发酵工艺优化

莲子百合发酵菌株的活化

实验中使用的益生菌包括乳酸菌和酵母菌。乳酸菌包含以下菌株：L-01、L05、B-01、L-07、L-06、P-01、L-02、L-08、L-04、L-09、L-03、L-10。酵母菌包含以下菌株：Y-08、Y-12、Y-13、Y-14、Y-15、Y-16、Y-18。共使用了19株菌株。

乳酸菌

将乳酸菌从超低温冰箱中取出，于37℃解冻，接种至MRS液体培养基中，置于恒温摇床（37℃、160转/分钟）中培养6小时。使用酶标仪测定630纳米处的吸光度值，使吸光度值维持在0.8至1.2范围内（Ayivi等人，2022年）。

酵母菌

将酵母从超低温冰箱中取出，于37摄氏度下解冻，接种至PDA液体培养基中。在恒温摇床（25摄氏度、220转每分钟）中培养6小时。使用酶标仪测定630纳米处的吸光度值，将吸光度值控制在0.8至1.2范围内（Wang等人，2021）。

莲子百合发酵液的制备

新鲜莲子和百合于60℃鼓风干燥箱中干燥，随后经高速万能粉碎机粉碎，过60目筛。所得粉末以石油醚脱脂，于121℃高压灭菌20分钟后，备用。

莲子分别进行发酵：取2克经过高压蒸汽灭菌的莲子粉，转移至锥形瓶中。在超净工作台中，按照料液比1:20（克:毫升）向瓶中加入60摄氏度的无菌水40毫升。共设置20个发酵组，每个发酵组均添加1%（体积/体积）益生菌种子液，对照组则用无菌水替代种子液。酵母菌组在28摄氏度、150转/分钟的恒温摇床条件下发酵48小时，乳酸菌组在37摄氏度、150转/分钟的恒温摇床条件下发酵48小时（Walker和Walker，2018）。发酵结束后，离心（8000转/分钟，10分钟）收集上清液，即为不同菌株的莲子发酵液，于4摄氏度下保存备用。

百合单独发酵：取2克经高压灭菌的百合粉置于锥形瓶中，后续操作步骤与莲子单独发酵的步骤相同，得到不同菌株的百合发酵液，于4摄氏度下保存备用。

莲子与百合共同发酵：分别称取1克莲子粉和1克百合粉置于高压灭菌后的锥形瓶中，后续步骤与如上所述，获得了不同菌株的发酵莲子百合发酵液，并将其置于4摄氏度下保存备用。

莲子百合发酵菌株的筛选

以发酵液中的多糖含量为指标进行初筛，以黄酮含量为指标进行复筛。植物中总多糖含量通常采用苯酚-硫酸法测定。在10 mL离心管中依次加入1 mL样品、1 mL 5%苯酚溶液和5 mL浓硫酸。静置10分钟后，混匀反应体系，于室温下孵育30分钟。反应结束后，在490 nm波长下测定各反应体系的吸光度值。以葡萄糖含量为纵坐标、吸光度值为横坐标绘制标准曲线。 发酵液中总黄酮含量采用硝酸铝比色法测定。具体步骤为：在10 mL离心管中加入1 mL样品，再加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀并静置6分钟后，加入1 mL 10%硝酸铝溶液，再次混匀并静置6分钟。随后加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，用双蒸水定容至10 mL，反应15分钟。反应结束后，在510 nm波长下测定样品吸光度，以芦丁含量为纵坐标、吸光度值为横坐标绘制标准曲线。

莲子与百合混合发酵比例的筛选

取经过高压灭菌的莲子粉与百合粉，按照不同的百合与莲子配比进行混合，制成发酵基质。实验分组及亚组设置如下： 组1：原料预处理 亚组1：莲子粉高压灭菌 亚组2：百合鳞茎粉高压灭菌 组2：配比混合发酵基质组 亚组1：百合鳞茎:莲子=6b57963-f669-404a-8279-f3c036426873 亚组2：百合鳞茎:莲子=1:5 亚组3：百合鳞茎:莲子=2:4 亚组4：百合鳞茎:莲子=(seed =3: 3) 亚组5：百合鳞茎:莲子=4:2 亚组6：百合鳞茎:莲子=5:1 亚组7：百合鳞茎:莲子=6:0 随后，将混合粉末以料液比1:20（g:mL）加入锥形瓶中，向瓶中加入60℃的无菌水，冷却至室温。加入1%的优势菌株种子液，其中酵母菌组置于恒温摇床中，于28℃、150转/分钟条件下发酵48小时；乳酸菌组置于恒温摇床中，于37℃、150转/分钟条件下发酵48小时。发酵结束后，分别离心（8000转/分钟，10分钟）收集上清液，即得不同菌株对应的莲子发酵液。

采用响应面法优化莲子百合混合发酵工艺体系

单因素实验

采用单因素法研究莲子百合复合发酵的工艺条件，且以多糖含量为指标，探究发酵时间、发酵温度、料液比和接种量对发酵液中多糖含量的影响。采用L-08乳酸菌菌株对莲子与百合进行混合发酵，百合与莲子的配比为4:2。

普拉凯特-伯曼设计

P-B实验（严等，2021）聚焦于不同因素对莲子百合发酵 broth 中总多糖含量的影响。所选变量水平基于各发酵条件下总多糖含量达到最大值前后的数值。实验设计包含不同水平的料液比（低水平：1 g:30 mL，高水平：1 g:35 mL）、细菌接种率（低水平：0.5%，高水平：1%）、发酵时间（低水平：36 h，高水平：48 h）以及发酵温度（低水平：25℃，高水平：28℃）。将这些因素输入Design-Expert 10软件进行分析，以莲子百合中的总多糖含量作为关键指标。共制定了12种实验方案，如表1所示。

响应面设计

通过PB实验设计，确定了影响莲子百合发酵的三个主要因素：发酵时间、底物浓度和温度。采用BoxBehnken实验（Yazici等人，2021年）设计了17个实验组，对莲子百合发酵液中的多糖含量进行分析。利用Design-Expert 10软件，通过代入三个因素的前最大值、最大值和后最大值条件，完成了这些实验设计。

莲子百合发酵酒的安全性评价

鸡胚绒毛尿囊膜的制备

在全自动孵化器中，鸡卵孵化9天。取出9日龄卵后，进行卵检并标记气室区域。剔除未受精、无生命及畸形的卵。制备绒毛尿囊膜（CAM）时，用手术镊去除气室上方的卵壳，沿气室膜边缘加入1毫升0.9%氯化钠溶液，并在20分钟内完成实验。

CAM 替代眼刺激试验方法

采用最大耐受浓度法分析莲子百合发酵液对鸡胚尿囊膜（CAM）的刺激作用。每组设置6枚鸡胚，分别给予阴性对照（0.9%生理盐水）、阳性对照（氢氧化钠）、参比对照（Texapon ASV）及发酵液实验组处理。向CAM血管清晰且均匀的区域预先加入200微升溶液，3分钟后轻轻冲洗，持续观察2小时。观察鸡胚尿囊膜橡胶圈范围内的血管情况在电子显微镜下进行观察，以评估是否存在出血、溶血或凝血现象。根据出血、凝血及血管溶解的情况，结合表2所示的评分表对每个鸡胚进行评估和打分。同时评估了各实验组的刺激性与腐蚀性。

数据分析

使用Prism GraphPad 10软件对实验结果进行分析并绘制图表。所有实验数据均为三次独立实验的平均值，以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析对实验结果进行统计分析，当(p<0.05)时，差异具有统计学意义。

发酵莲子百合液的抗炎活性

将保存在−80℃的RAW264.7细胞解冻并重悬。将所得细胞悬液接种至含有25 mL完全DMEM培养基的T25培养瓶中。在37℃、5% (CO_{2})的条件下进行培养。当细胞融合率达到80%–90%时，吸取状态最佳的RAW264.7细胞悬液，按1:1的比例与0.4%台盼蓝混合。将该混合物置于细胞计数仪上，在显微镜下观察，制备密度为(1 ×10^{5} / mL)的HaCaT细胞悬液

莲子百合发酵液对RAW264.7细胞安全浓度的评估

使用RPMI-1640基础培养基制备浓度为0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%、30%和40%（体积/体积）的发酵液样品。向96孔板中每个浓度设置六个复孔。对照组仅加入RPMI-1640培养基。培养20小时后，向每孔依次加入50微升MTT染色液。4小时后弃去上清液，再加入150微升二甲基亚砜（DMSO）。在室温下于摇床上低速振荡10分钟。随后，使用酶标仪测定570纳米处的吸光度，并根据公式1计算RAW 264.7细胞活力 [Cell survival rate (%)=frac{left(A-A_{0}right)}{left(A_{1}-A_{0}right)} × 100 %] 其中字母A代表：红花实验组的吸光度值；(A_{0} :)为溶剂空白组的吸光度值；(A_{1})为正常组的吸光度值

RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子TNF-α (###)的检测

将 TNF- (###) ELISA 试剂盒中的标准品稀释至 0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 和 200 pg/mL 的浓度。随后，按照试剂盒说明书构建 TNF-α 标准曲线。按照试剂盒指示处理细胞样本，在 450 nm 波长下测定每个样本的吸光度，并根据标准曲线计算每孔的 TNFα 含量。每组设置六个平行实验组。

RAW264.7细胞中一氧化氮的测定

按照一氧化氮试剂盒的说明书要求，将标准品 (NaNO_{2}) 稀释至 0、1、2、5、10、20、40 和 60 微摩尔浓度，绘制标准曲线。随后依据试剂盒说明书处理细胞样本，在 540 纳米波长下测定各样本的吸光度。利用已建立的一氧化氮标准曲线，计算各样本组的一氧化氮含量（Chen 等人，2018）。

莲子百合发酵液对HACAT细胞模型体外抗氧化活性的研究

将储存在−80℃的HaCaT细胞解冻复苏，得到细胞悬液。随后将细胞接种至含有3mL完全培养DMEM培养基的T25细胞培养瓶中，在37℃、5% (CO_{2})条件下进行细胞培养。细胞汇合度达到80%–90%时进行观察，吸弃状态良好的HaCaT细胞悬液。按1:1比例加入0.4%台盼蓝溶液，滴加至细胞计数板上。将细胞密度调整至(1 ×10^{5} cells / mL ,)，据此制备HaCaT细胞悬液。用基础DMEM培养基将发酵液稀释为40%、30%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%和0.625%的浓度。

人永生化角质形成细胞氧化损伤细胞模型的建立

将HaCaT细胞以(1 ×10^{5})的密度接种于含2 mL DMEM培养基的六孔板中，设置对照组、模型组、阳性对照组和实验组。每孔加入2 mL细胞悬液，于37℃、5% (CO_{2})的培养箱中培养24 h后，吸弃上清液。对照组加入2 mL DMEM基础培养基；模型组、阳性对照组和实验组分别加入2 mL高糖DMEM基础培养基、含10 µg/mL Vc的高糖DMEM基础培养基以及含不同浓度荷花与百合发酵液的高糖DMEM基础培养基，继续培养24 h。随后再次吸弃上清液，对照组补加2 mL高糖DMEM基础培养基，其余各组补加2 mL 0.5 mmoL/L (H_{2} O_{2})溶液，继续培养4 h。

观察结束后，用1毫升胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗涤两次，以1000转/分钟的速度离心10分钟，吸弃上清液后用1毫升PBS重悬细胞沉淀，在4摄氏度下超声处理5分钟（功率100瓦，每个周期5秒，间隔20秒），随后使用Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。将样品置于4摄氏度下保存，用于后续检测，以测定莲子百合发酵液对HACAT氧化细胞的抗氧化活性。

测定细胞的HACAT总抗氧化能力（T-AOC）

将10 mM的Trolox溶液稀释至0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 mM的不同浓度梯度。使用这些梯度溶液与试剂IV应用液和ABTS工作液反应，以测定HACAT细胞样本指标。空白管中加入10微升蒸馏水、20微升试剂IV应用液和170微升ABTS工作液。标准管中加入10微升不同浓度的标准应用液、20微升试剂IV应用液和170微升ABTS工作液。室温下反应6分钟后，在405纳米波长下测定吸光度（OD）值。最后取10微升细胞样本加入96孔板，依次加入20微升试剂IV应用液加入溶液和170微升ABTS工作液。在室温下反应6分钟，然后在405纳米波长下测定吸光度。将吸光度代入标准曲线，计算样品浓度。

过氧化氢酶活性（CAT）的HaCaT细胞测定

使用紫外分光光度计在240纳米波长下测定吸光度，以蒸馏水作为空白进行校准。向比色皿中加入20微升细胞样品，随后迅速加入3毫升预热至25摄氏度、吸光度（OD值）在0.5至0.55之间的底物溶液。立即记录240纳米波长下的吸光度并记为OD1，1分钟后记录OD2。将这两个数值代入公式2中计算过氧化氢酶（CAT）活性。 [Total antioxidant capacity = frac{ Amearing tube - Acontrol tube }{0.01} ÷ 30 × 3.7 quad (2)]

人永生化角质形成细胞（HaCaT）中丙二醛（MDA）含量的测定

按照MDA试剂盒说明书配制试剂。使用涡旋振荡器混匀试剂，将反应体系置于95℃水浴中反应40分钟。冷却后，以4000转/分钟的转速离心10分钟，取上清液。在532纳米波长下测定吸光度值，并通过公式（3）计算含量。 [begin{gathered} MDA content =frac{ Measurde OD values of control }{ Standard OD values - Blank OD value } \ × Concentration of standard \ div Protein concentration of the samples tobemeasured end{gathered}]

超氧化物歧化酶（SOD）活性的HaCaT细胞测定

试剂的制备方法详见总超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒说明书。反应结束后，根据公式（4）计算总SOD活性。 [begin{aligned} T-SOD viability = & frac{ Control OD - Measured OD value }{ Blank OD value } ÷ 50 % \ & × frac{ Total volume of reaction solution (mL)}{ Sample size (statistics )(mL)} \ & ÷ protein content end{aligned}]

发酵产物对B16-F10细胞模型体外美白活性的研究

B16-F10细胞培养

将储存在−80摄氏度的B16-F10细胞解冻并重悬，以获得细胞悬液。随后对这些细胞进行接种接种至含有3毫升完全RPMI-1640完全培养基的T25培养瓶中，在37℃、5%二氧化碳及(CO_{2})的条件下培养。当细胞汇合度达到80%-90%时进行观察，吸弃状态良好的HaCaT细胞悬液。按1:1的比例向细胞计数板中加入0.4%台盼蓝溶液。将细胞密度调整至(1 ×10^{5} cells / mL)，并制备相应的B16-F10细胞悬液。用RPMI-1640培养基稀释荷花和百合发酵液，使其浓度达到40%、30%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%和0.625%。

B16-F10细胞中酪氨酸酶活性的测定

将细胞以(1 ×10^{5})的密度接种于含2 mL RPMI-1640培养基的六孔板中。将培养板分为对照组、阳性对照组和实验组，每孔加入2 mL细胞悬液。将培养板置于37℃、5% (CO_{2})的细胞培养箱中培养24 h，随后去除上清液。对照组为正常细胞，阳性对照组加入500 µg/mL曲酸，实验组加入发酵液。将六孔板继续置于37℃、5% (CO_{2})的条件下培养24 h。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，然后在4℃下超声处理5分钟（功率100 W，每次循环5秒，间隔20秒）。收集上清液并离心20分钟，得到酶液。使用BCA蛋白测定试剂盒对蛋白含量进行定量分析，将蛋白浓度调节至20 µg。将含2.5 mM L-多巴和0.1 M磷酸盐缓冲液（100 µL）的裂解液转移至96孔板孔中，37℃孵育1小时。立即用酶标仪在475 nm波长下测定吸光度，每组重复三次（Guo等人，2020）。采用公式（5） [begin{aligned} & left.begin{array}{l} Tyrosine activity inhibition rate =1-ODa / ODb × 100 % \ & ODb : absorbance of the experimental group \ & ODb : absorbance of model group end{array}right.] 计算细胞间酪氨酸酶活性的抑制率。

B16-F10细胞黑色素生成抑制率的测定

用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，将离心后得到的沉淀物（((12,000 times)，10分钟）重悬于含10%二甲基亚砜（DMSO）的1摩尔/升氢氧化钠溶液中，在80摄氏度水浴中孵育30分钟。使用酶标仪在490纳米波长下测定每孔的黑色素含量，每组设置三个重复。根据公式（6）计算各组对黑色素生成的抑制作用。

莲子百合发酵液体内生物活性研究

选取发育正常的AB品系斑马鱼胚胎。将荷花百合发酵液稀释为低、中、高三个浓度。在24孔板的每孔中放入10枚胚胎，加入1mL样品溶液，在体视显微镜下观察72小时胚胎期（hpf）胚胎的存活率、孵化率和畸形率。使用公式（7-9）计算72小时胚胎期的存活率、孵化率和畸形率，以筛选出适用于后续实验的合适浓度。 [Mortality rate (%)=100-left{frac{ Number of dead embryos }{ Total number of embryos } × 100right}] [Hatching rate (%)=left{frac{ Number of embryos hatched }{ Total number of embryos }right} × 100 %] [Deformity rate (%)=left{frac{ Number of deformed embryos }{ Total number of embryos }right} × 100 %]

斑马鱼检测样品的制备

选取发育正常的斑马鱼胚胎，置于6孔板中，每孔20枚胚胎。设置对照组、阳性对照组、模型组和实验组。对照组和模型组均加入4 mL培养液，实验组加入4 mL不同浓度的荷花百合发酵液；阳性对照组加入4 mL含10 µg/mL维生素C的培养液。72小时胚胎期（hpf）后，除对照组外，其余各组均加入4 mL浓度为2 mmol/L的2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐（AAPH）溶液，孵育6小时。以生理盐水为匀浆介质制备组织匀浆，于4℃、12000转/分钟条件下离心15分钟，收集上清液，测定蛋白质浓度后开展后续实验。

总抗氧化能力的测定

根据总抗氧化能力试剂盒比色法操作指南，收集HaCaT细胞和斑马鱼样本各10微升，加入20微升试剂四应用液和170微升ABTS工作液，于室温反应6分钟。在405纳米波长下测定各孔吸光度值，通过标准曲线计算得到各样本的吸光度值。

丙二醛含量的测定

根据戊二醛试剂盒中TBA法的操作说明，混合各种试剂，反应在95°C水浴中进行40分钟，然后冷却并以4,500rpm离心10分钟，收集上清液并测量每个样品在532 nm波长下的吸光度。

将数值代入公式（3），计算每个样品组中的戊二醛含量。乙二醛的含量参照空白值的标准值以及待测样品中蛋白质的标准浓度进行测定。

超氧化物歧化酶活性测定

T-超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的测定按照T-SOD试剂盒的操作说明进行（采用WST-1法）。反应完成后，通过公式（4）计算各样本组的T-SOD活性。

莲子百合发酵液在斑马鱼模型中的美白活性研究

斑马鱼黑色素相对含量的测定

实验分为空白组、阳性对照组（PTU）和实验组（设置低、中、高浓度的莲百合发酵液）。将斑马鱼胚胎置于6孔板中，每孔20枚胚胎。每孔加入2毫升对应溶液，培养48小时，每12小时更换一次培养基。使用光学显微镜观察并记录各组斑马鱼胚胎的黑色素生成情况，通过Image J软件进行数据分析，计算同一区域内不同组别黑色素斑点的总面积。以对照组的黑色素总面积为100%，计算各处理组的相对黑色素含量。每组重复测试三次。

斑马鱼中酪氨酸酶的活性影响

研究了斑马鱼胚胎对不同试剂的反应，包括未添加试剂的对照组、添加PTU试剂的阳性组以及添加发酵液试剂的实验组。经过72小时的发育培养后，对斑马鱼胚胎进行酶提取，并在−20℃下保存。随后，将酶提取物与1毫摩尔/升左旋多巴（L-DOPA）和磷酸盐缓冲液（PBS buffer）反应，在475纳米波长下测定其吸光度。每个实验均重复三次，利用公式（5）计算酪氨酸酶活性抑制率。

莲子百合发酵液对斑马鱼模型的体内抗炎活性研究

发酵液对硫酸铜致炎的影响

在显微镜下，挑选发育正常的3天龄Tg(corola:EGFP)转基因斑马鱼幼鱼并将其转移将其加入6孔板中，每孔放置20条斑马鱼。设置对照组、模型组、地塞米松阳性组以及高、中、低浓度发酵液实验组。对照组和模型组不施加药物处理，实验组与阳性组则用药物处理1小时。之后，除对照组外，其余各组均用20微摩尔/升的硫酸铜处理2小时，以构建炎症模型。随后，在荧光显微镜下观察斑马鱼体内的炎症细胞情况并拍照记录，同时统计炎症细胞的数量。

莲子百合发酵液对痤疮致病菌的抑制作用

硫代乙醇酸盐固体培养基的制备

准确称取2.90克硫乙醇酸盐流体培养基粉末至耐压玻璃瓶中，随后加入1.50克琼脂和100毫升蒸馏水。加热搅拌至沸腾溶解后，置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20分钟。在超净工作台的无菌条件下接种至培养皿，待其冷却凝固后倒置平板，用玻璃纸密封，置于4℃冰箱中保存备用。

菌株活化与冷冻保存

在超净工作台的无菌条件下，将金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌接种至装有5 mL马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）液体培养基的试管中，于37℃有氧培养18–24小时。将痤疮丙酸杆菌接种至装有5 mL硫乙醇酸盐液体培养基的试管中，放入厌氧袋中，于37℃厌氧培养48小时。培养结束后，用接种环挑取菌悬液，采用三区划线法划线接种至固体平板上，继续培养至单菌落出现。随后培养单菌落，使细菌浓度达到OD600为(nm=0.8 ~ 1.2)，制备种子菌液。采用麦氏浊度法，用液体培养基将菌悬液调整至0.5麦氏浊度((1.5 ×10^{8} cfu / mL))，作为后续实验用菌悬液。该菌悬液于4℃保存，且需在4小时内使用。

最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法（卡尔等人，2022年）测定莲与百合发酵液对供试细菌的最低抑菌浓度。将浓度为0.5麦氏浊度的细菌悬液加入96孔板，分别设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和实验组。在阴性对照组、阳性对照组和实验组的每孔中，均加入50微升细菌悬液与50微升的肉汤培养物混合（戴等人，2021年）。空白对照组不添加任何试剂或细菌悬液，阴性对照组补充100微升无菌0.9%生理盐水溶液，阳性对照组补充100微升浓度为100微克/毫升的米诺环素（拉奥夫等人，2020年）。

实验组加入100微升生理盐水，稀释后最终浓度分别为莲与百合发酵液的100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%和10%。将金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌置于37摄氏度培养箱中培养24小时，将痤疮丙酸杆菌放入厌氧袋中，再置于37摄氏度培养箱中培养48小时。培养结束后，加入20微升0.2%的TTC溶液，避光培养4小时后观察颜色，以测定最低抑菌浓度。每组实验均重复测试三次。

抗菌活性测定

采用K-B纸片法测定莲子百合发酵液对三种供试菌的抗菌活性。将0.5麦氏浊度的菌悬液涂布于固体培养基上，静置5分钟。随后将饱和抗生素纸片浸泡于相应浓度的发酵液中，放置在平板表面，倒置放入恒温培养箱中培养。培养结束后，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。每组实验均进行三次重复。