题目：Iron Oxide Nanoparticles Integrated in 3D-Printed Dosage Forms for Advanced Iron Supplementation

原文链接:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnanoscienceau.5c00159ACS Publications

期刊：ACS Nanoscience Au

摘要

缺铁仍是全球主要的健康负担，基于铁盐的传统口服补充剂往往受限于生物利用度差和胃肠道不耐受问题。本文报道了一种将氧化铁纳米颗粒（Fe_{3} O_{4}）整合到3D打印剂型中的创新策略将纳米颗粒（NPs）制成三维（3D）打印片剂（打印片），作为补铁的先进口服剂型。研究合成了未包覆和柠檬酸盐包覆的(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒，将其分散于甘油中，并通过热熔挤出法掺入聚乙烯醇长丝中，进而借助熔融沉积成型（FDM）技术制备出均匀的圆柱形片剂。结构和光谱分析证实纳米颗粒成功掺入聚合物基质且分布均匀；力学测试表明，相较于粉末基混合物，稳定的甘油基分散体制备的长丝具有更优异的强度和可打印性。在模拟胃和肠道环境下的溶出实验显示，两种制剂在pH 1.0条件下均能快速、完全释放铁；而柠檬酸盐功能化的纳米颗粒在pH 6.8条件下显著提升铁释放量，这与溶出过程中生成的超纳米结构胶体稳定性提升相关。斑马鱼胚胎实验进一步表明，纳米颗粒悬浮液和溶解态打印片均具有低急性毒性，柠檬酸盐包覆可缓解高浓度下出现的孵化延迟问题。综上，将氧化铁纳米颗粒与基于FDM的增材制造技术相结合，可制备出具有药学相关性、可定制化的口服剂型，该剂型不仅溶出行为得到改善，且急性毒性较低。该平台为解决传统制剂局限性的个性化补铁疗法提供了概念验证。

关键词：缺铁、补铁、氧化铁纳米颗粒、3D打印小丸、熔融沉积成型、热熔挤出

引言

缺铁是全球最普遍的营养缺乏症之一，给各卫生组织带来了重大担忧，在孕妇、儿童和慢性病患者等高危人群中尤为明显。¹ 缺铁通常无明显症状，但若不及时治疗，可能发展为贫血²，进而导致认知功能受损、头晕、头痛、免疫反应减弱，严重时还会出现血流动力学不稳定。目前的治疗策略主要依赖口服³和静脉补铁，其中口服途径是最常见且最安全的选择。

然而，基于铁盐的常规制剂（通常以片剂或混悬剂形式给药）⁴ 受限于生物利用度差以及频繁出现的胃肠道副作用。事实上，这些不良反应包括恶心、上腹部不适、便秘、腹泻和金属味是长期治疗依从性差的主要原因之一，常导致治疗中断6。此外，铁盐在胃肠道环境中的溶解度存在差异，加之其易被氧化以及会与膳食成分发生相互作用，进一步降低了吸收效率，并导致治疗效果不稳定6,7。

在这种情况下，纳米制剂——尤其是基于氧化铁纳米颗粒（NPs）的纳米制剂——已成为减轻铁相关不良反应和优化给药剂量的一种有前景的策略补充。8,9 事实上，它们的物理化学稳定性，铁含量高且生物相容性良好，使得氧化铁纳米颗粒在口服补铁方面极具吸引力，因为它们能够规避与铁盐相关的溶解度和氧化降解问题。¹⁰ 一旦被摄入，这些氧化铁纳米颗粒可通过内吞作用被肠细胞吸收，¹¹ 随后经溶酶体溶解，直接在细胞内释放出可被生物利用的铁，最大限度减少铁离子在胃肠道腔内的暴露，从而降低局部刺激性。¹⁰ 尽管存在这些优势，但将这类纳米颗粒转化为药物剂型仍面临重大挑战，包括剂量调整的必要性，以及设计能够实现更精准调控和个性化给药的递送系统等问题。

在此背景下，药物剂型的3D打印作为一项创新技术脱颖而出¹²ˏ¹³，它能够通过逐层构建的方式，利用负载药物或补充剂的聚合物基质制备个性化剂型¹⁴。通过调控打印装置的内部结构，可调节其尺寸、形状、剂量以及释放特性¹⁵ˏ¹⁶。这种结构灵活性使得能够设计出具有定制化溶出动力学、靶向递送特性的系统，甚至可在单一单元中实现联合治疗¹⁷ˏ¹⁸。在现有技术中，熔融沉积成型（FDM）技术尤为重要，原因在于其操作便捷、成本效益高¹⁹，且与多种聚合物具有良好的相容性²⁰ˏ²¹。该技术还可将热稳定性活性成分（如氧化铁纳米颗粒）直接掺入挤出物中细丝，确保均匀分布和精准定量。22 此外，熔融沉积成型技术支持缓释片剂和多药物制剂的生产，为优化治疗方案、提高患者依从性提供了机会。23 对于补铁治疗而言，该方法优势尤为显著，可定制满足个体需求的剂型并助力个性化治疗。24,25。

将氧化铁纳米颗粒与基于熔融沉积成型（FDM）的3D打印技术相结合，既融合了纳米颗粒介导铁递送的固有优势，又保留了增材制造的制造灵活性，为实现**最大化**的剂型设计铺平了道路生物利用度，同时减少不良反应。17,22 迄今为止，尚未有研究报道了这种联合策略被用于开发口服铁剂补剂剂型。

本研究介绍了含氧化铁纳米颗粒（Fe_{3} O_{4}）的3D打印片剂的研发过程，将其作为口服补铁的创新平台。该方法解决了传统制剂的关键局限性——如生物利用度低和胃肠道副作用，同时克服了将纳米颗粒均匀掺入固体剂型的技术难题。

为此，研究人员合成了具有不同表面化学性质（未包覆和柠檬酸盐包覆）的(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒，将其胶体分散于甘油中，再通过热熔挤出（HME）技术与聚乙烯醇（PVA）共混加工，得到均匀的复合长丝。随后，利用这些长丝通过熔融沉积（FDM）3D打印技术制备圆柱形片剂。打印（打印微片）。所得打印微片通过理化表征、模拟胃肠环境下的溶出度测试以及采用斑马鱼（斑马鱼）胚胎毒性模型的生物安全性评估进行了全面评价。该设计实现了对纳米颗粒表面功能化及分散介质如何影响丝材均匀性、可打印性、释放动力学以及良好的初步安全性概况的系统研究。

材料与方法

材料 六水合氯化铁（编号(FeCl_{3} cdot 6 H_{2} O, ≥99%)，纯度98%；编号(FeCl_{2} cdot 4 H_{2} O, ≥98%)，纯度98%）和柠檬酸钠三盐基（编号(Na_{3} C_{6} H_{5} O_{7} cdot 2 H_{2} O, ≥99%)，纯度99%）均购自美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司。氢氧化铵溶液（编号(NH_{4} OH)，浓度25%~30%）、盐酸（HCl，浓度37%）和丙酮（编号(≥99.5%)，纯度99.5%）由德国达姆施塔特市的Merck公司提供。聚乙烯醇（型号Parteck MXP，水解度88%，批号F1952064）和甘油（编号(≥99.5%)，纯度99.5%，ACS试剂级）同样购自德国达姆施塔特市的Merck公司。超纯去离子水（电阻率18.2兆欧·厘米）通过Milli-Q纯化系统（美国马萨诸塞州伯灵顿市的Millipore公司制备）制得，用于所有样品的制备。所有试剂和溶剂均为分析纯级别。

含氧化铁纳米颗粒的3D打印片剂的制备

3D打印释铁片剂（打印片）的制备包含三个连续阶段，如图1所示：（i）合成未包覆（FeP）或柠檬酸盐功能化（FeC）的氧化铁纳米颗粒（编号(Fe_{3} O_{4}）；（ii）以甘油为增塑剂，通过热熔挤出（HME）制备含编号(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒的聚乙烯醇（PVA）基复合长丝；（iii）采用熔融沉积成型（FDM）技术，利用挤出的长丝3D打印圆柱形片剂。对每个阶段进行优化，以确保纳米颗粒均匀分散、长丝几何形状精确可控以及片剂结构可重复制备，从而实现对材料理化性质和性能的系统性评估。各步骤的具体操作详述如下。

图1. 3D打印释铁片（打印片）制备的示意流程。(1) 氧化铁纳米颗粒的合成：通过在碱性介质中共沉淀(Fe^{2+})和(Fe^{3+})盐制得磁铁矿(Fe_{3} O_{4})，得到未包覆（FeP）和柠檬酸盐功能化（FeC）纳米颗粒，将其悬浮于甘油中。(2) 熔融挤出（HME）制备丝材：将分散在甘油中的裸纳米颗粒或柠檬酸盐包覆纳米颗粒，与聚乙烯醇（PVA）混合，通过同向双螺杆挤出机制备复合丝材（15%质量分数的(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒、20%质量分数的甘油、65%质量分数的PVA）。(3) 熔融沉积成型（FDM）3D打印：在220 ℃下，以0.4 mm喷嘴打印圆柱形打印片（13.55 mm×4.10 mm，填充率50%，交叉阴影图案），分别制得3D-FeP和3D-FeC打印片，其中裸纳米颗粒和柠檬酸盐包覆的(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒被均匀掺入。

氧化铁纳米颗粒的合成

氧化铁纳米颗粒通过共沉淀法合成，采用了此前用于制备磁铁矿（编号(Fe_{3} O_{4}）的改良方案。具体步骤为：在剧烈磁力搅拌下，将500毫升含编号21616630-33ea-440c（0.25摩尔）和编号(Fe^{3+})（0.5摩尔）的酸性水溶液（盐酸，pH=1）加入到2000毫升编号(NH_{4} OH)溶液（2摩尔）中。反应1小时后，通过磁性分离得到沉淀物，并用去离子水彻底洗涤至中性（约pH=7），得到原始（未包覆）磁铁矿纳米颗粒，记为FeP。取部分该沉淀物按照先前研究的方法进行柠檬酸盐表面功能化27。此步骤中，将1克FeP分散在50毫升含0.7克柠檬酸钠的水溶液中。混合物在持续搅拌和60℃加热条件下维持1小时，将pH调节至约7，并用丙酮洗涤产物以去除过量柠檬酸盐，得到柠檬酸盐包覆的纳米颗粒（记为FeC）。挤出处理前，将未包覆（FeP）或柠檬酸盐包覆（FeC）的纳米颗粒重新分散于甘油中，形成稳定的胶体悬浮液。为表征及后续其他测试，部分纳米颗粒在80℃烘箱中干燥处理。

热熔挤出（HME）制备长丝

以PVA为聚合物基体，以含分散氧化铁纳米颗粒（FeP或FeC）的甘油悬浮液为原料，通过热熔挤出（HME）制备长丝。配方通常包含氧化铁纳米颗粒（15质量%）、甘油（20质量%）和PVA（65质量%），首先用研钵和研杵进行均质处理，以确保各组分均匀分布。随后，将所得混合物在同向双螺杆锥形挤出机（HAAKE MiniCTW，赛默飞世尔科技公司）中进行挤出。Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市），配备1.8毫米模具和带有自动直径控制系统的长丝牵引单元（FTR1型号）。28 挤出在150℃下进行，螺杆转速为60转/分钟，无物料循环。所得长丝根据其组成分为F-FeP（未包被纳米颗粒）和F-FeC（柠檬酸盐功能化纳米颗粒）。

采用熔融沉积成型（FDM）技术制备3D打印微片

采用熔融沉积成型（FDM）技术，利用此前挤出的长丝制备了圆柱形3D打印片（打印片）。每个打印片的直径为13.55±0.12毫米，高度为4.10±0.12毫米，平均体积为(0.569 pm 0.05 ~cm^{3}) (n= 10）。内部结构设计为50%填充密度的交叉阴影图案，该结构在Tinkercad中生成，并通过Slic3r软件处理以实现打印。打印在220℃的Voolt FDM 3D打印机（巴西圣保罗）上进行，该打印机配备0.4毫米的喷嘴。打印完成后，为在理化表征和性能评估前保持其结构完整性，将打印片进行真空密封处理。打印片根据所用长丝进行命名，即未包覆纳米颗粒的为3D-FeP，柠檬酸盐功能化纳米颗粒的为3D-FeC。

材料表征

采用理学Miniflex 600型衍射仪对FeP样品进行X射线粉末衍射（XRD）分析，该衍射仪工作电压为40千伏、电流为15毫安。通过扫描电子显微镜（SEM，日本电子JSM-7001F型）和透射电子显微镜（TEM，日本电子JEM-1011型）完成形貌表征及能量色散光谱（EDS）分析。SEM测试中，将胶体样品和3D打印材料的截面干燥后进行镀金处理（徕卡EM SCD 500型镀膜仪），并在15千伏电压、10000倍放大倍数下成像。TEM测试时，将稀释后的胶体悬浮液（体积比1:300）滴涂在包被Formvar膜的铜网上，干燥后在80千伏电压、30000倍放大倍数下成像。在配备衰减全反射（ATR）附件的布鲁克Vertex 70型光谱仪上采集傅里叶变换红外（FTIR）光谱，以4厘米⁻¹的分辨率平均采集96次扫描，每次测量前均采集背景信号。采用配备共聚焦显微镜和电荷耦合器件（CCD）光栅的HORIBA Scientific LabRam HR Evolution型拉曼光谱仪获取显微拉曼光谱，使用532纳米二极管激光进行测试。通过配备5千牛测力传感器的岛津EZ Test型万能试验机对熔融挤出（HME）制备的丝材进行拉伸测试，直至丝材断裂。试样长度为60毫米，测试时夹具初始间距为30毫米，预载力为1牛。采用马尔文仪器Zetasizer Nano Series 3600型仪器，通过动态光散射（DLS）测定流体力学直径和多分散性指数（PDI），并利用电泳光散射（ELS）测定Zeta电位（ζ）。流体力学直径和PDI采用累积法计算，Zeta电位则通过Smoluchowski近似由电泳迁移率推导得出。使用马尔文仪器MPT-2型自动滴定仪，以标准氢氧化钠溶液和/或盐酸溶液为滴定剂，开展pH依赖性测试。在Multiwave PRO型微波消解系统中对丝材和打印片进行微波辅助消解后，采用原子吸收光谱法（AAS）测定其中的铁含量。称取约10毫克样品置于250毫升消解罐中，加入3毫升硝酸、盐酸和氢氟酸的混合酸（体积比1:1:1），在800瓦功率下消解，2分钟内升温至100摄氏度并保持10分钟，随后8分钟内冷却至55摄氏度。

溶出度研究

采用 Ethik 299 型装置（巴西圣保罗的 Nova Etica 公司生产）对印片进行溶出度测试，测试条件为 37 ℃、900 毫升溶出介质、搅拌速度 100 转/分钟（装置 2——旋转桨法）。29 分别使用磷酸盐缓冲液（pH 6.8）和 0.1 摩尔/升盐酸（pH 1.0）模拟肠道和胃部环境。在规定时间间隔内取样 5 毫升，并用新鲜介质替换，最长测试时间为 6 小时（pH 6.8）或 2 小时（pH 1.0）。铁样品（n=5）中的含量按照前一节所述的原子吸收光谱法（AAS）进行了定量测定。

采用在pH 6.8条件下6小时测定的溶出效率值（DE6）和在pH 1.0条件下2小时测定的溶出效率值（DE2）对溶出曲线进行对比分析。溶出效率采用梯形积分法计算为指定时间点前溶出曲线下的面积，并以相同时间间隔内对应100%溶出的理论面积的百分比表示。对3D-FeP和3D-FeC打印制剂所得的DE6和DE2值应用Student t检验进行制剂间的统计学比较，显著性水平为(alpha=0.05)。

鱼胚胎毒性（FET）测试

FET 检测依据经合组织指南 (236)（经合组织，2025 年）开展，并采用了 Schulte 等人（2021 年）描述的改良方法。斑马鱼胚胎分别暴露于裸（FeP）和柠檬酸盐包被（FeC）的 (Fe_{3} O_{4}) 纳米颗粒，以及从 3D 打印颗粒（3D-FeP 和 3D-FeC）制得的分散液中，暴露浓度为 0、0.1、0.4、1.6、6.3、25.1 和 100 毫克/升。

对于每种处理方式，60枚胚胎被分配到96孔微孔板的三个重复组中（图S1）。每个孔中加入250微升测试溶液（n=20）或作为板内对照的水（n= 10），每孔放置一枚胚胎。受精后立即开始暴露处理，并在气候培养箱（SL-24，索拉布科学公司）中持续96小时。每天使用体视显微镜，以70倍放大倍数（观察鱼卵）或40倍放大倍数（观察孵化后的胚胎）对胚胎和仔鱼进行检查。孵化前的观察指标包括鱼卵凝结、耳石形成、发育延迟、眼睛/身体色素沉着、体节形成、心跳、水肿、尾芽脱离、卵黄囊吸收、尾部畸形和孵化情况。孵化后的评估指标包括脊柱畸形和平衡丧失（胚胎侧躺）。所有参数均以存在或缺失进行记录。此外，还通过扫描电子显微镜（SEM）对暴露于样品的胚胎卵壳进行进一步分析，以评估其孔隙完整性及表面纳米颗粒的团聚情况。本研究图像的选取基于胚胎毒性测试结果（参数：孵化抑制率）。

结果与讨论

氧化铁纳米颗粒

图2a中展示的FeP样品的X射线衍射图谱呈现出特征衍射峰，与JCPDS卡片编号88-0315中标引的磁铁矿尖晶石相−(Fe_{3} O_{4})相符。利用谢乐公式通过(311)衍射峰的宽化估算晶粒尺寸，得到的平均值约为8.9纳米。图2b为FeP样品的代表性透射电子显微镜（TEM）图像，可见(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒近似球形。基于约200个颗粒的测量并假设粒径呈对数正态分布的统计分析表明，颗粒平均直径为9.7纳米，标准偏差（σ）约为0.31。

图2d展示了原始（FeP）和柠檬酸盐包覆（FeC）的(Fe_{3} O_{4})样品的傅里叶变换红外光谱。纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱在600 (cm^{-1})附近出现显著吸收带，这归因于氧化铁晶格特征的Fe−O伸缩振动。此外，(~ 1630 ~cm^{-1})处的吸收带以及(3100 ~cm^{-1})之间的宽吸收区，分别对应H−O−H弯曲振动和O−H伸缩振动。这些特征表明纳米颗粒表面存在物理吸附水和表面羟基³³。对于柠檬酸盐功能化的(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒（样品FeC），(1596 ~cm^{-1})的存在表明存在配位羧酸盐基团（−COO−Fe），证实柠檬酸盐结合在纳米颗粒表面。此外，在2850处出现弱吸收(2930 ~cm^{-1}) 被分配给 (CH_{2}) 的对称伸缩振动模式(CH_{3}) 基团，进一步支持柠檬酸盐物种的表面吸附。O−H 键的增强(3370 ~cm^{-1})，归一化至540观察到(cm^{-1})处出现峰值，同时Fe−O伸缩振动峰从538 cm⁻¹移动至555 cm⁻¹（对应(555 ~cm^{-1}），且该谱带出现明显展宽。624 cm⁻¹处的谱带（对应(624 ~cm^{-1}）仍保持未发生变化。综合来看，这些光谱特征为磁铁矿表面包覆的成功提供了有力证据负载有柠檬酸盐配体的纳米颗粒33,34。

在图2e中，展示了样品FeP和FeC的拉曼光谱及其各自的归属。识别出(506 ~cm^{-1})附近的峰，其对应于氧化物结构中的(T_{2 ~g})、(E_{g})和(T_{2 ~g})振动模式。该与磁铁矿相关的谱带（约 670 cm⁻¹，(670 ~cm^{-1}）以及磁赤铁矿（~ 720 ~cm^{-1}）表明样品可能被部分氧化（Fe_{3} O_{4} to gamma-Fe_{2} O_{3}），这一点在放大的(560-800 ~cm^{-1})区域中得到了清晰证实，在该区域中，高斯拟合能够分离出磁铁矿和磁赤铁矿的贡献（图2f）。

图2. 裸a8c18af8-14b6-499e-a0b3-192be21cf062纳米颗粒（FeP样品）的衍射图谱(a)和标尺为100纳米的透射电镜显微照片(b)——(b)中的插图为粒径分布直方图。不同pH值下裸FeP纳米颗粒和柠檬酸盐包覆的FeC纳米颗粒的Zeta电位(c)。FeP(i)和FeC(ii)(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱(d)和拉曼光谱(e)——(560-800 ~cm^{-1})拉曼区域的放大图(f)。

考虑到拉曼光谱法并非总能对磁铁矿纳米颗粒的氧化态提供完全可靠的定量结果，36 本研究采用重铬酸钾滴定法（重铬酸盐滴定法）这一经典氧化还原滴定法，对<UUID>(Fe^{2+})</UUID>和<UUID>(Fe^{3+})</UUID>的含量进行了定量测定，进而估算出纳米颗粒的<UUID>(Fe_{3} O_{4} to gamma-Fe_{2} O_{3})</UUID>氧化程度。研究不同阶段中，裸磁（FeP）和柠檬酸盐包被（FeC）<UUID>(Fe_{3} O_{4})</UUID>纳米颗粒的定量氧化度测定结果如下：合成后分别为 13.0±0.7% 和 9.5±0.5%，热熔融挤出与熔融沉积成型后分别为 14.8±0.5% 和 11.3±0.4%，片剂在水中溶解后分别为 14.2±0.7% 和 11.8±0.8%。值得注意的是，尽管在热熔融挤出过程中暴露于高温环境、在溶出度测试中处于水相环境，但不同加工步骤下纳米颗粒的氧化程度均未出现显著上升。在所有测试阶段，柠檬酸盐包被的纳米颗粒始终比裸磁纳米颗粒表现出更低的氧化程度。

不同加工阶段氧化程度未出现显著变化，这可归因于表面功能化与聚合物包封的协同稳定作用。已知柠檬酸盐功能化可减轻氧化，有利于磁铁矿相的保留，从合成阶段起便提升了化学稳定性。后续。34,37 在热熔融挤出和熔融沉积过程中在建模过程中，无论是裸纳米颗粒还是柠檬酸盐包被的纳米颗粒，都会嵌入聚合物基质中，这形成了额外的物理屏障，限制氧化铁表面与氧化环境和水相环境的接触。据报道，聚乙烯醇（PVA）等聚合物涂层可在严苛的化学或生理条件下保护氧化铁核并减轻氧化38。因此，经挤出或溶解处理后，未观察到氧化程度出现可测量的增加，而柠檬酸盐包被的纳米颗粒整体氧化程度始终更低。重要的是，在不同加工步骤中均未观察到氧化程度的显著变化，且所有制剂均在相同条件下加工，这为关于铁释放和毒性趋势的对比结论提供了有效性支撑。

在不同 pH 值下测得的裸铁氧化物纳米颗粒及柠檬酸盐包覆纳米颗粒的 Zeta 电位（ζ）值如图 2c 所示。FeP 样品中的纳米颗粒在 pH 为 2 时表面带正电（约 +30 毫伏），在中性 pH 条件下表面电荷接近零，而在碱性条件下表面负电荷逐渐增强，在 pH 为 11 时约为 -30 毫伏。这一现象与原始表面的两性性质相关，其性质随介质 pH 值的变化而改变——裸铁氧化物纳米颗粒表面的位点主要发生质子化（Fe−(OH_{2}^{+})）在酸性条件下呈质子化状态，在中性pH（equiv Fe-OH）下呈中间态，在碱性环境中则去质子化（equiv Fe-O^{-}）。图2c进一步表明，柠檬酸盐包覆的纳米颗粒（FeC样品）的Zeta电位对pH值具有很强的依赖性，随着pH值从2升高到11，其Zeta电位从约+5 mV降至−33 mV。这种现象可归因于随着pH值升高，吸附的柠檬酸盐分子表面结合的羧酸基团逐步去质子化（equiv Fe-COOH to equiv Fe-)、(COO^{-}），从而使带负电位点的密度增加，最终导致Zeta电位值更负。

HME长丝

将含裸露氧化铁纳米颗粒（FeP）或柠檬酸盐包被氧化铁纳米颗粒（FeC）的甘油基胶体悬浮液与聚乙烯醇（PVA）混合，通过热熔挤出（HME）分别制得F-FeP和F-FeC丝材，这些丝材用于制备打印片剂以及进行溶出度和毒性测定。初步测试表明，当将干燥的纳米颗粒物理混合到甘油和聚乙烯醇（PVA）中（而非以甘油基分散体的形式加入）时，所得浆料的均一性较差。研究人员还对这些物理混合物进行了丝材制备的测试。在此情况下，将FeP和FeC干燥粉末与聚乙烯醇（PVA）及甘油通过研钵和研杵混合后，在相同条件和比例下进行挤出，制得(F-FeP *)和(F-FeC^{*})样品。但如下文所述，这些丝材的质量远低于采用稳定的甘油基纳米颗粒胶体悬浮液制得的丝材。这一结果促使我们采用基于甘油基悬浮液的方法来制备丝材并进一步制得打印小丸。

事实上，掺入氧化铁纳米颗粒的聚合物长丝的应力-应变曲线（图3a）表现出典型的延性特征，首先经历初始弹性阶段，随后发生塑性变形直至达到最大应力点，之后出现急剧断裂。

由稳定的甘油基悬浮液(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒（F−FeP和F−FeC—实线）制备的长丝，其机械性能显著优于由干燥纳米颗粒粉末（F-FeP^{*})和F−FeC*—虚线）制备的长丝。未涂层纳米颗粒配方（F−FeP）展现出最高的拉伸强度（约9兆帕），断裂伸长率超过50%，这表明纳米颗粒与聚乙烯醇（PVA）之间的韧性得到增强，且界面相互作用效果良好。基质⁴¹,⁴²，可能与强氢键有关与纳米颗粒表面形成的化学键。

相比之下，采用柠檬酸盐包覆纳米颗粒制备的样品表现出略低的机械强度和延展性，这可能是由于改性表面与聚合物链之间的亲和力降低，从而限制了界面处的应力传递。另一方面，无论是否进行表面改性（虚线曲线），由干燥粉末制得的丝材其拉伸强度和伸长率均大幅下降，这很可能与分散性差以及纳米颗粒团聚有关，而纳米颗粒团聚体可充当应力集中点并导致材料过早失效⁴³。如表1总结所示，与干燥粉末配方相比，由稳定悬浮体制备的丝材具有更高的极限强度、更大的断裂伸长率，且杨氏模量相当或更高。

这些研究结果凸显了纳米颗粒分散性和界面相容性在调控挤出纳米复合丝材力学性能方面可能发挥的关键作用。尽管柠檬酸盐涂层通常能改善纳米颗粒的分散性通过静电稳定作用分散于水介质中34，它并未显著增强与PVA基体的界面附着力44。相反，甘油被证明至关重要，它同时充当分散剂和增塑剂，使纳米颗粒分布更均匀，机械性能也得到提升45,46。因此，用甘油基稳定悬浮体制备的纤维（F−FeP和F−FeC）具有更高的拉伸强度和断裂伸长率。值得注意的是，只有来自稳定悬浮体的纤维

悬浮液（F−FeP 和 F−FeC）的拉伸强度超过了可靠 3D 打印所需的最小拉伸强度阈值（8.5 兆帕），而干粉基丝材则频繁出现与送料相关的故障。基于这些结果，研究人员选取 F−FeP 和 F−FeC 用于 3D 片剂制备、生物学测试和溶出度研究。

如图 (3 b, c,) 所示，裸颗粒和柠檬酸盐包被的 (Fe_{3} O_{4}) 纳米颗粒经挤出后，形成了直径约 1.7 毫米的均匀圆柱形丝材，且整个材料呈现一致的黑色/棕色，表明纳米颗粒在聚合物基质中分布均匀。扫描电子显微镜（SEM）分析（图 3d）显示丝材表面形貌相对均匀且粗糙，存在大量孔隙是其特征。在更高放大倍数下（图 3e、f），结合能量色散谱（EDS）映射的扫描电镜显微照片（图 S2a）证实，氧化铁纳米颗粒嵌入或附着在聚合物基质中。通过原子吸收光谱法（AAS）对挤出丝材不同区段的铁含量分析表明，铁在聚合物基质中分布均匀，F−FeP 和 (F-FeC ,) 的平均铁含量分别为 8.3%（质量分数）和 9.2%（质量分数）。考虑到理论铁负载量为 15%（质量分数），这些数值表明在挤出和熔融沉积成型（FDM）工艺后，约 55%–61% 的预期金属含量得以保留。这种差异并非源于纳米颗粒掺入不均或分析误差，而是由本研究采用的多步加工工艺固有的材料损失造成的。具体而言，在热熔融挤出（HME）和熔融沉积成型（FDM）过程中，粘性且富含纳米颗粒的配方可能部分附着在挤出机机筒、螺杆、模具和丝材牵引系统的内表面，预计会出现部分铁损失。对于经热熔融挤出和熔融沉积成型加工的纳米颗粒填充聚合物体系，尤其是在高填料负载量下，已报道过类似现象⁴⁷。

图3. 由稳定甘油悬浮液制备的含裸纳米颗粒和柠檬酸盐包覆纳米颗粒的挤出丝材的典型应力-应变曲线（a）（F−FeP和F−FeC为实线），以及由含干燥纳米颗粒粉末的物理混合物制备的挤出丝材的典型应力-应变曲线（F−(FeP^{*})和F−FeC*为虚线）。典型F−FeP丝材（b）和F−FeC丝材（c）的外观。用于片剂打印的F−FeC丝材横截面的代表性SEM图像，放大倍数分别为50倍（d）、250倍（e）和5000倍（f），显示了掺入(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒的区域。通过对（f）中所示选定区域的EDS分析（图S2a）证实了铁的存在。

3D 打印微片

由含裸露 (Fe_{3} O_{4})（3D-FeP）或柠檬酸盐包被 (Fe_{3} O_{4}) 纳米颗粒（3D-FeC）的热熔挤出（HME）丝材制备的3D打印微片，呈现出均匀的黑/棕色着色，且具有一致的层状结构（图4a、b）。断裂横截面的扫描电镜（SEM）图像显示，挤出和熔融沉积成型（FDM）工艺形成了典型的丝状和层状形貌，聚合物基体的流动取向特征在整个截面上清晰可见（图4c、d）。高倍镜下的扫描电镜显微图与能量色散谱（EDS）映射（图4e和补充图2b）证实，(Fe_{3} O_{4}) 纳米颗粒既附着在表面，也嵌入在聚合物网络的互连孔隙中。通过原子吸收光谱法（AAS）对3D打印微片不同区域的铁含量进行定量分析，结果表明铁在聚合物基体中分布均匀。3D-FeP配方的平均铁含量为7.1%（质量分数），3D-FeC配方为6.8%（质量分数），同一微片的不同区域之间无显著差异。尽管实测值略低于15%（质量分数）的理论载量，但研究结果证明铁被有效掺入并均匀分散在聚合物基体中。这一结果表明，尽管加工过程中可能因热应力和机械应力造成少量损失，但挤出和熔融沉积成型工艺均保留了金属成分。

图4. 含柠檬酸盐包被的(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒（3D-FeC）的典型3D打印片剂的代表性照片（a），以及放大视图（b），该视图突出了打印工艺特有的编织状图案。片剂表面截面（c）和内部截面（d）的扫描电镜（50倍）图像。在（e）中，更高放大倍数（10000倍）下可观察到(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒嵌入聚合物基质中，所选区域的能谱分析中观察到的铁信号也证实了这一点（图S2b）。

溶出研究

铁释放型打印微片的溶出测试是评估制剂质量、药效和批间一致性的关键指标。一致性。所得的溶出曲线提供了关键的有关铁释放动力学的信息，为预测其生物利用度和治疗效果提供了支持生物利用度和治疗性能。48 图5展示了溶出曲线——溶解铁含量随时间变化的曲线用于在模拟肠液和胃液中对所制备的打印片进行测试源自含有未包被和柠檬酸盐包裹的 (Fe_{3} O_{4}) 纳米颗粒的热熔挤出长丝纳米颗粒，即分别为3D-FeP和3D-FeC样品。

两种打印片在不同模拟介质中的溶出曲线均呈现出不同模拟介质中的溶出曲线通常均呈现初始快速释放阶段释放阶段（突释效应），随后溶解速率减慢直至某一时间点达到平衡为止（图5）。然而，溶解速率会因介质不同而变化。

图5. 3D-FeP（黑色）和3D-FeC（蓝色）打印片的溶出曲线，二者分别含裸纳米颗粒和柠檬酸盐包覆的(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒，实验分别在（a）肠液pH值（6.8）和（b）胃液pH值（1.0）的模拟条件下进行。数值以平均值±标准差表示。此外，还展示了2小时和6小时溶出效率（分别为DE2和DE6）的平均值，括号内为标准差。

尽管3D-FeP和3D-FeC的溶出曲线样品在酸性介质中的溶出曲线一致，铁元素可完全溶出90分钟内介质中完全溶解，而在肠溶性介质中仅含未包衣纳米颗粒的3D打印片的铁溶解量有限约为50%。相比之下，在肠溶介质中，打印片含包衣纳米颗粒的打印片在150分钟内几乎能释放100%的铁150分钟内铁的溶出量（图5）。这些结果由溶出度分析得到了定量验证，即在pH 6.8的条件下3D-FeP 的DE6值为48.6，3D-FeC的DE6值为70.3，证实了柠檬酸盐包被纳米颗粒在肠道条件下铁释放程度更优柠檬酸盐包被纳米颗粒的条件（p=0.0005)介质（pH 1.0）中，尽管3D-FeC的溶出度表现出略高的数值21.7的DE2值，而3D-FeP为17，该差异无统计学意义（p=0.202）这表明两种配方在胃条件下的释放效率相当就胃内条件下的释放效率而言，两种制剂的表现相当。

先前的研究一致表明，聚乙烯醇（PVA）可溶解在较宽的pH值范围内溶解，但溶解动力学受其影响显著受制剂结构和聚合物性质的影响等人49证实，含有3D打印的PVA片剂卡维地洛和氟哌啶醇实现了药物的完全释放在 pH 2.0 和 pH 6.8 的条件下均持续约45分钟，这证实了聚乙烯醇（PVA）能在胃和肠道环境中实现药物释放。同样，库蒂（Couti）等人50指出，聚乙烯醇（PVA）是一种非离子型、pH 值无关的赋形剂，可在酸性和中性环境中溶解，这也解释了为何它常被选用于基于熔融沉积成型（FDM）的速释或缓释剂型中。

因此，在肠介质中裸纳米颗粒所观察到的这种差异表明，尽管聚乙烯醇（PVA）本身在不同pH值下均可溶，但纳米颗粒的表面化学性质可能在中性/碱性环境中调节溶解机制，这种效应很可能源于纳米颗粒-聚合物相互作用的本质。

通过透射电子显微镜（TEM）对含有溶解的打印片的溶液进行分析，发现了胶体纳米颗粒团簇（超纳米颗粒）的存在，这些团簇显然是由片剂分解为嵌入聚合物部分的氧化铁纳米颗粒多核结构形成的。51 这一观察结果可通过zeta电位分析以及测量这些分散体的流体动力学直径随pH值的变化来证实（图6）。对于由裸纳米颗粒和柠檬酸盐包衣纳米颗粒组成的片剂溶解所得的浆料，随着pH值从2升高至12，zeta电位的绝对值不断增大——从略微正值转变为约3D-FeP 样品约为 -10 毫伏，3D-FeC 样品约为 -20 毫伏。

图6. 含溶解打印片3D-FeP（a）和3D-FeC（b）的溶液中，流体力学粒径（Dh）和Zeta电位（ζ）随pH值的变化情况，其中3D-FeP和3D-FeC分别含裸纳米颗粒和柠檬酸盐包被的(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒。数值以平均值±标准差表示。插图为圆圈标注的打印片溶解后形成的胶体纳米颗粒团簇（超纳米颗粒）的代表性透射电子显微镜（TEM）显微照片。

这些研究结果表明，这些超纳米结构的表面电荷分布是由多种因素共同作用形成的两种组分（即 PVA 以及 (Fe_{3} O_{4}) 纳米颗粒）的贡献。52,53 尽管 PVA 不具备强可电离性对于能直接解释ζ电位随pH值显著变化的基团，有几种公认的机制可以解释为何经PVA包覆或含PVA的颗粒，其ζ电位会随pH值升高而变得更负。首先，在较高pH值下，PVA主链上的羟基基团可特异性地从水介质中吸附氢氧根离子，在滑移面处产生净负电荷。其次，颗粒的基底基质（如金属氧化物）通常存在表面羟基（equiv M-OH），这些羟基可发生质子化/去质子化反应，即便部分被PVA层覆盖，也能调节整体表面电荷。

第三，吸附的PVA链可能会改变滑移面并重组双电层，从而产生促进测得负电位提升的空间位阻效应。此外，PVA水解不完全所残留的乙酰氧基尽管含量较低，但在碱性条件下可能发生去质子化，进一步促进电荷的产生。在多种PVA-氧化物体系中已通过实验观察到这些综合效应，其中zeta电位测量结果均显示，负电位的绝对值会随pH值的升高而增大。

这些超纳米结构的流体动力学直径符合预期趋势：ζ电位（绝对值）越高，结构/聚集体越小，这主要是由于颗粒间静电斥力的引入。54 在pH 6.8条件下，打印颗粒溶解形成的超纳米颗粒的TEM图像证实了这一假设，因为柠檬酸盐包覆样品溶解后形成的团簇更小且更均一与裸露的 (Fe_{3} O_{4}) 纳米颗粒样品(<zeta_{3 D-FeC}>) (zeta_{3 D-FeP}）相比更均匀。因此，观察到的 3D 结构的溶解速率更高FeC 样品可与生成的超纳米颗粒更强的胶体稳定性相关联，这是由 (Fe_{3} O_{4}) 纳米颗粒表面（equiv Fe-COOH to equiv Fe-COO^{-}）的羧基电离产生的，而裸露纳米颗粒（Fe−OH）表面的羧基则未发生电离。

(AgNPs ^{55})的相关研究表明，消化环境会促进其聚集和形态变化，限制其穿过肠道黏液的能力，进而导致吸收效果不佳。相比之下，我们的动态光散射（DLS）和Zeta电位分析结果显示，柠檬酸盐涂层可改善纳米颗粒的分散性，尤其是在碱性条件下，这是因为表面羧基去质子化会产生静电稳定作用。这种稳定作用减少了聚集，有利于形成尺寸更小、均一性更高的超纳米结构，这类结构更易穿透肠道黏液并被肠上皮细胞摄取。胶体稳定性的提升还为溶解提供了更大的有效表面积，助力实现更高效的释放效果。56 定量分析显示，载铁3D打印片的溶出试验符合药典要求，60分钟内铁的释放量超过80%；但与快速溶解的硫酸亚铁片相比，其释放过程更趋平缓、持久通常会导致过饱和、沉淀以及含量降低生物利用度。

总体而言，溶出结果表明，3D-FeC 制剂的优异性能并非仅局限于初始动力学效应，而是反映出铁的释放在时间上得到了持续且可重复的增强。这一行为与制剂相关的结构-性能关系相符，其中柠檬酸盐官能化作用提升了纳米颗粒在溶出介质中的胶体稳定性、分散性以及有效表面可及性。

尽管溶出度测试无法完全复制生理环境的复杂性，但观察到的不同制剂之间的差异表明，这些差异可能与体内释放行为存在潜在关联。未来的研究将探索体外-体内相关性，以进一步优化制剂设计，并评估这些研究结果的转化意义。

场效应晶体管测试

根据基梅尔（Kimmel）的研究58，斑马鱼的胚胎发育从0.2小时持续到72小时，直至孵化。该实验监测了96小时，在此期间，阴性对照组未观察到显著的致死或亚致死效应。观察到的最大死亡率为1%，这与文献中的推荐值相符。

值得注意的是，不同浓度的测试样品：（ii）裸和柠檬酸盐封顶的(Fe_{3} O_{4})NPs分散体（分别来自FeP和FeC样品）和（ii）来自打印件的溶液（分别来自3D-FeP和3D-FeC溶解）在溶解时看起来均匀。图7概述了(Fe_{3} O_{4})NPs在其各种制剂中的胚胎毒性测定结果，以及在24、48、72和96小时内作为NP浓度（0.1-100 mg/L）函数对胚胎发育的影响分数。

图7. 裸(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒（FeP）悬浮液（a）、柠檬酸盐包被(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒（FeC）悬浮液（b），以及由含裸(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒的3D打印片溶解制得的悬浮液（3D-FeP）（c）、柠檬酸盐包被(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒的3D打印片溶解制得的悬浮液（3D-FeC）（d）的观察到的受影响比例。

在测试过程中，观察到低胚胎毒性的规律；然而，暴露于不同测试溶液的胚胎其绒毛膜上出现了纳米颗粒附着（绒毛膜变暗——图8a），而对照组在光学显微镜下显示绒毛膜正常（图8d)。暴露72小时后，在100毫克/升浓度的3D-FeP和3D-FeC处理组的生物体中观察到孵化抑制现象，胚胎抑制率分别约为50%和10%（图7）。该结果与以往研究中的描述一致59,60。两项研究均表明，纳米颗粒的尺寸不同，可能会对卵壳产生干扰，部分或完全堵塞其孔隙，并限制营养物质与氧气的交换。此外，纳米颗粒在卵壳表面的积聚会因缺氧和活性氧的产生，延缓胚胎发育和/或改变孵化过程。

值得注意的是，在本研究中，暴露于最高浓度（100 mg/L）的生物体在次日（96小时）未观察到上述效应（图7c）。然而，孵化时间的变化并非毒性的决定性指标，因为幼虫在后续发育阶段可正常生长。孵化行为无变化可能意味着穿透卵壳的铁纳米颗粒正在器官内积累。在这种情况下，其毒性作用仅会在斑马鱼的最终发育阶段显现发育。61

扫描电子显微镜（SEM）分析（图8b、c、e、f）展示了不同卵壳的表面。象限“(" E "-0 mg / L)呈现正常的结构构象且孔隙裸露。在(F,)区域可见孔隙。

图8. 暴露于样品3D-FeP的斑马鱼胚胎的光学显微镜图像(a)以及75倍(b)和5000倍(c)的扫描电子显微镜图像，显示(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒分布在卵膜表面。对照组斑马鱼胚胎的光学显微镜图像，未暴露于(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒(d)。对照组卵膜表面的扫描电子显微镜图像（未暴露于(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒），放大倍数为5000倍(e)。暴露于(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒后的卵膜表面，显示纳米颗粒分散在孔隙周围，如箭头所示(f)。

测试结束后，所有处理组的 (LC_{50})（96 小时）值均高于测试的最高浓度（100 毫克/升），表明铁纳米颗粒 FeP、FeC、3DFeP 和 3D-FeC 对斑马鱼胚胎的致死毒性较低，此前研究。62,63 值得注意的是，所观察到的亚致死效应（孵化延迟）可能与对部分孔隙周围，64,65 因为在其周围观察到了纳米颗粒，这些颗粒会部分或完全 （注：结合上下文语境，补充完整语义使译文通顺，符合学术文本表达习惯）覆盖毛孔。此外，暴露于3D-FeC的胚胎对孵化的影响小于暴露于3D-FeP的胚胎。已有多项研究59,66-69报道了类似的延迟现象或斑马鱼的亚致死毒性模式一直显示氧化铁纳米颗粒具有低急性毒性，包括(Fe_{3} O_{4}）、赤铁矿（alpha-Fe_{2} O_{3}）和磁赤铁矿（gamma -) (Fe_{2} O_{3}），通常仅在相对较高的暴露水平下才会观察到发育毒性；此外，柠檬酸盐包被等表面功能化方法已被证实可降低斑马鱼模型中的生物效应。这一结果表明，柠檬酸盐功能化的铁纳米颗粒可能在生物技术研究的发展中具有重要意义。

结论

本研究成功通过热熔挤出与熔融沉积成型技术，将氧化铁纳米颗粒整合至三维打印剂型中，为先进的口服补铁疗法构建了新型平台。由稳定的甘油基纳米颗粒分散体制备的丝材展现出优异的机械性能与打印适性，确保了裸纳米颗粒与柠檬酸盐包被的(Fe_{3} O_{4})纳米颗粒均能均匀掺入最终打印制剂中。溶出度研究表明，尽管两种制剂在胃环境中均实现了快速释药，但柠檬酸盐功能化的纳米颗粒在肠溶性介质中显著提升了铁的释放量，这与释放出的纳米结构胶体稳定性的改善相吻合。斑马鱼胚胎实验证实所有制剂均具有低急性毒性，且柠檬酸盐包被可在高浓度下减轻亚致死效应。综上，这些研究结果表明纳米颗粒表面化学性质与分散策略对三维打印剂型的性能具有关键影响。本方法将氧化铁纳米颗粒的固有优势与增材制造的结构灵活性相结合，可制备具有药学价值的定制化制剂，且具备低急性毒性，有望解决传统补铁剂的关键局限性。未来研究应聚焦于建立体外-体内相关性并评估临床疗效，以推动该技术向个性化补铁疗法的转化。