题目：Circadian clocka regulates the zebrafish central neuronal Mauthner-cell axon regeneration via phosphodiesterase family pde4a

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41536-026-00488-5

期刊：npj Regenerative Medicine

摘要

轴突再生是修复脊髓损伤的关键。昼夜节律在轴突再生中发挥调控作用。内源性分子钟是昼夜节律产生和精准维持的分子基础。CLOCK是内源性分子钟中最核心的转录因子之一。然而，CLOCK在轴突再生中的作用目前仍不明确。因此，本研究探讨了昼夜节律基因clocka如何调控斑马鱼中枢神经元Mauthner细胞（M细胞）的轴突再生。利用M细胞轴突再生模型，我们发现M细胞轴突在双光子激光消融后表现出昼夜节律相位依赖性再生，而在clocka突变体中，M细胞的昼夜节律相位依赖性再生被剥夺，其再生能力也受到抑制。随后，结合单细胞电穿孔、单细胞捕获、转录组测序和咯利普兰治疗的实验结果表明，clocka是M细胞轴突再生所必需的，并对轴突再生发挥调控作用。通过磷酸二酯酶PDE4A-cAMP轴。综上，这些研究结果表明内源性分子钟基因clocka通过PDE4A-cAMP通路调控斑马鱼中枢M细胞轴突再生，并为中枢神经修复的节律调控提供了新的见解。

关键词：斑马鱼、clocka、pde4a、毛特讷细胞、轴突再生

引言

脊髓损伤（SCI）因轴突再生能力有限会导致永久性神经功能障碍¹²。近年来，鲜有研究表明昼夜节律对轴突再生具有调控作用³⁴。昼夜节律是生物体内约24小时的生理和行为周期，可调控众多生命过程⁵⁶。内源性分子钟是这些节律产生与精准维持的分子基础⁷⁸。哺乳动物昼夜节律钟的核心机制依赖于由正向核心调控元件CLOCK-BMAL1和负向核心调控元件PER-CRY构成的转录-翻译反馈环路。这一循环过程驱动并维持内源性分子钟，产生自主性昼夜节律振荡。已有研究证实，背根神经节（DRG）神经元具备内在的分子钟机制，且损伤后轴突再生具有昼夜依赖性³⁴。在机制方面，研究主要探讨了BMAL1缺失在DRG神经元再生过程中的作用³⁴。然而，其他昼夜节律调控基因在轴突再生中的调控作用及其下游机制仍 largely 未知。作为分子钟的另一核心组分，CLOCK被报道在异染色质稳定中发挥非经典作用，促进组织和软骨再生。尽管已证实 clocka 基因对维持斑马鱼的昼夜节律至关重要，但其在调节轴突再生中的作用，以及能够支持神经元损伤后轴突再生的潜在机制仍不清楚。

斑马鱼作为昼行性动物，因与哺乳动物共享保守的昼夜节律，已成为研究昼夜节律的理想模型。毛特纳细胞（M细胞）是位于斑马鱼后脑的一对中枢神经元，其特征是具有定型的胞体形态，且轴突交叉后在脊髓中下行，同时在轴突损伤后展现出强大的再生能力。多项研究利用轴突切断后的M细胞再生模型，探究了中枢神经系统（CNS）神经元损伤后修复的内在机制。与哺乳动物坐骨神经损伤模型中数千条混合轴突群体再生的模式不同，M细胞具备精准的胞体-轴突匹配特性，其再生表型与胞体之间呈现严格的一一对应关系。这使得在单细胞水平进行基因操作成为可能，从而能更精准地探究内在因子影响轴突再生。此外，由于M细胞仅支配斑马鱼的快速逃逸回路，不同的轴突再生表型直接决定了运动功能恢复的差异。

这些内在特性克服了传统中枢神经系统轴突再生模型中固有的细胞异质性挑战，从而为探索轴突再生的内源性调控因子提供了理想模型。本研究首先分析了与M细胞再生能力相关的单细胞转录组26，揭示了M细胞内核心生物钟基因的完整组成型表达。值得注意的是，正向调控因子可能促进轴突再生。因此，我们探究了M细胞轴突再生是否由内源性生物钟调控a。通过共聚焦活体成像技术，我们证实研究发现，M细胞在24小时内接受双光子激光轴突切断术后，表现出依赖于一天中不同时间的轴突再生能力。然而，这种依赖于昼夜节律阶段的轴突再生在clocka突变体中被消除，同时其再生能力显著受损。通过单细胞电穿孔技术恢复突变体M细胞中的clocka表达后，M细胞的轴突再生能力得到部分恢复，这进一步证明了clocka参与轴突再生过程。从机制层面来看，以往研究表明磷酸二酯酶4（PDE4）家族成员参与调控脊髓损伤后的轴突再生，我们发现clocka突变会消除pde4a的振荡表达并提高其表达水平。结合单细胞过表达、shRNA介导的pde4a敲低实验以及体内单细胞捕获分析，我们证实正是clocka突变体M细胞中升高的pde4a表达抑制了轴突再生能力。最后，行为学分析显示，clocka突变体幼体在轴突损伤后运动功能恢复速度更慢。此外，使用Pde4抑制剂咯利普兰处理可恢复突变体的M细胞轴突再生，并进一步促进其运动功能的恢复。

本研究共同证实，M细胞在轴突再生中表现出昼夜相位依赖性。昼夜节律基因clocka通过pde4a–cAMP–Creb轴参与调控再生过程。这些新发现表明，昼夜节律在中枢神经系统轴突再生中发挥重要作用，为理解昼夜节律紊乱如何损害再生以及设计脊髓损伤后依赖于昼夜节律的治疗策略提供了新的见解。

结果

激光消融后M细胞表现出随时间变化的轴突再生 我们首先旨在确定M细胞是否具有内源性分子钟，并探究其潜在作用在轴突再生中的作用。我们使用具有特定 M 细胞标记的 Tg(Tol 056: EGFP) 转基因斑马鱼品系，在受精后6天（dpf）进行双光子激光轴突切断术。对轴突再生情况进行了评估损伤后2天（dpi），根据再生表型将细胞分为再生组（Re）和非再生组（NRe）。对每组的M细胞胞体进行体内捕获后，开展单细胞转录组测序（scRNA-seq）（图1 昼夜节律是M细胞轴突再生的调控因子）。我们此前已获得与M细胞轴突再生能力相关的单细胞转录组测序数据²⁶。单细胞转录组测序分析显示，首先，所有核心节律基因均在M细胞中普遍表达（图1 昼夜节律是M细胞轴突再生的调控因子）。我们进一步验证了它们在轴突再生过程中的作用。结果表明，损伤后2天时，再生组中正向调控因子bmal1b和clocka的表达量显著高于非再生组。相应地，负向核心调控基因per1b和cry2在非再生组中的表达量显著升高（图1 昼夜节律是M细胞轴突再生的调控因子）。此外，再生组中bdnf、bhlhe40和mycbp2的表达量也高于非再生组（图1 昼夜节律是M细胞轴突再生的调控因子）。其中，bdnf是一种公认的神经营养因子，可保护神经元存活并促进损伤后轴突再生，其表达与昼夜节律密切相关³¹,³²。碱性螺旋-环-螺旋家族成员bhlhe40（也称为dec1）可被CLOCK和BMAL1激活，进而启动负反馈调控³³,³⁴。此外，有研究表明E3泛素连接酶mycbp2可降解Rev-erbα，从而调控昼夜节律³⁵。这些结果共同表明，昼夜节律可能是M细胞轴突再生的潜在调控因子，且正向反馈调控或许能促进轴突再生。因此，我们提出假设：内源性分子钟可能会根据损伤发生的时间，影响M细胞轴突的再生能力。基于此，我们在光照周期14小时、黑暗周期10小时的环境中，于 Zeitgeber 时间（ZTs）1、5、9、13、17和21（即光照开始后的第1、5、9、13、17和21小时，对应上午9点、下午1点、下午5点、晚上9点、凌晨1点和凌晨5点），每4小时对6天龄（dpf）斑马鱼幼虫M细胞轴突在泄殖腔正上方进行双光子激光轴突切断术，并在两天后的同一时间点观察轴突再生情况（图1 昼夜节律是M细胞轴突再生的调控因子）。共聚焦成像结果显示，M细胞轴突再生在白天表现出一定的昼夜时间依赖性，与其他时间点相比，ZT9时损伤的轴突再生长度最长，而ZT21时损伤的轴突再生长度最短（图1 昼夜节律是M细胞轴突再生的调控因子）。此外，统计结果表明，M细胞轴突的平均再生能力在光照阶段整体上高于黑暗阶段（图1 昼夜节律是M细胞轴突再生的调控因子）。但年龄是影响轴突再生的因素之一，研究发现即使是年龄差异最大的ZT1和ZT21组，其轴突再生能力也无显著差异（图1 昼夜节律是M细胞轴突再生的调控因子）。为直接探究年龄差异对轴突再生的影响，我们在ZT1对5天龄和7天龄斑马鱼幼虫的M细胞轴突进行双光子激光轴突切断术，并在两天后的同一时间点观察轴突再生情况（补充材料：补充图S1A）。成像结果显示，5天龄、6天龄和7天龄的幼虫在损伤后轴突再生长度无显著差异（补充材料：补充图S1B）。这些结果排除了20小时年龄差异对M细胞轴突再生的影响。

综合来看，这些结果表明内在的昼夜节律钟调控了M细胞的轴突再生，并证实M细胞在双光子激光照射后表现出昼夜节律相位依赖性的轴突再生。

图 1 昼夜节律调控 M 细胞轴突再生。（A）Mauthner 单细胞轴突再生转录组测序实验时间线。图由 Figdraw 绘制。（B）M 细胞内核心生物钟基因的基础表达水平。横轴为每百万转录本数（TPM），横线代表均值。（C）再生组（Re）与无再生组（NRe）相比，生物钟正向调控基因bmal1b、clocka及负向核心调控基因per1b、cry2的表达统计柱状图。（D）相较于无再生组，再生组中昼夜节律相关基因bdnf、bhlhe40、mycbp2表达显著上调的统计柱状图（曼 - 惠特尼检验，p＜0.05）。（E）活体 M 细胞双光子激光轴突切断实验时间线。图由 Figdraw 绘制。（F）受损 M 细胞轴突代表性成像图。星号标记损伤位点，该位点位于泄殖孔上方。（G）双光子激光消融处理后，ZT9、ZT21 两个时间点 M 细胞轴突再生代表性成像图。星号标注损伤位点，箭头指示再生轴突末端；比例尺：100 微米。（H）24 小时不同时间点下，M 细胞轴突自损伤位点起再生长度统计柱状图（单因素方差分析；ZT1 与 ZT5 对比p=0.9991，ZT1 与 ZT9 对比p=0.9541，ZT1 与 ZT13 对比p＞0.9999，ZT1 与 ZT17 对比p=0.9995，ZT1 与 ZT21 对比p=0.2796；ZT5 与 ZT9 对比p=0.8196，ZT5 与 ZT13 对比p=0.9976，ZT5 与 ZT17 对比p＞0.9999，ZT5 与 ZT21 对比p=0.4912；ZT9 与 ZT13 对比p=0.9697，ZT9 与 ZT17 对比p=0.8399，ZT9 与 ZT21 对比p=0.0420；ZT13 与 ZT17 对比p=0.9985，ZT13 与 ZT21 对比p=0.2421；ZT17 与 ZT21 对比p=0.4649；p＜0.05，ns 代表无统计学差异；每组包含 12 尾生物学独立幼鱼）。柱状图数值为平均值 ± 标准误（ZT1：488.4 ± 37.02 微米，ZT5：474.7 ± 24.64 微米，ZT9：520.4 ± 27.83 微米，ZT13：491.4 ± 21.44 微米，ZT17：476.2 ± 20.36 微米，ZT21：408.9 ± 22.55 微米）。（I）光照期与黑暗期 M 细胞轴突自损伤位点再生长度统计柱状图（独立样本 t 检验，p＜0.05；白天组 48 尾、夜晚组 24 尾生物学独立幼鱼）。柱状图数值为平均值 ± 标准误。

clocka突变体斑马鱼的构建

时钟基因在人类中仅为单拷贝存在，而在斑马鱼中则有两个拷贝。由于单细胞RNA测序（scRNA-seq）结果显示clocka基因在M细胞中的基础表达水平更高，我们随后重点研究了其在轴突再生中的作用。首先，我们利用CRISPR-Cas9技术构建了clocka基因突变的斑马鱼。通过在线设计工具CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）³⁶，我们在clocka基因核心编码序列的第三个外显子上设计了靶向sgRNA序列（图2. clocka基因突变斑马鱼的构建）。体外合成后，我们将其与Cas9蛋白混合，显微注射到单细胞阶段的胚胎中进行基因组编辑（图2. clocka基因突变斑马鱼的构建）。基因组测序结果显示，F2代斑马鱼的第三个外显子中插入了38个碱基，导致翻译提前终止（图2. clocka基因突变斑马鱼的构建）。为了验证clocka基因的敲除效果，我们在clocka基因第三个外显子的靶位点上下游设计了特异性引物。引物对1位于第三个外显子两侧的内含子区域，因此扩增产物片段1包含了整个编辑区域（补充材料：补充图S2A）。相比之下，引物对2的反向引物跨越了靶区域内的突变位点，在野生型斑马鱼中可正常扩增，而靶位点发生突变则会导致扩增失败（补充材料：补充图S2B）。利用这些引物，我们进行PCR扩增，以扩增从野生型和clocka基因突变斑马鱼中提取的基因组DNA。随后，通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。电泳结果清晰显示，clocka基因突变斑马鱼中扩增的片段1比野生型/AB斑马鱼的片段1长约40个碱基对。而片段2在野生型/AB斑马鱼中成功扩增，在clocka 突变体是通过在目标区域发生突变获得的（图2 clocka 突变体斑马鱼的构建）。

此外，利用生物信息学工具（https://smart.embl.de/smart/change_mode.cgi）进行的分析显示，clocka 突变体中存在一个提前终止密码子，导致产生的截短蛋白仅含68个氨基酸，同时表明其完整的关键功能结构域HLH-PAS发生了缺失（图2. clocka 突变体斑马鱼的构建）。这些结果表明，我们成功构建了clocka纯合突变斑马鱼品系。我们进一步验证了clocka基因突变对斑马鱼幼虫昼夜节律的影响，并额外证实了clocka突变体的成功构建。以往研究表明，clocka基因突变会导致斑马鱼幼虫的昼夜节律紊乱¹²，我们的结果再次验证了这一发现。我们首先通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了clocka突变型斑马鱼中核心昼夜节律基因的表达聚合酶链式反应。我们每四小时进行一次采样，结果显示，与对照组相比，clocka 突变体在24小时内的特定时间点，核心生物钟调控基因per1b、per2、cry1ba和bmal1b的表达水平存在显著差异，其中per1b和cry1ba的表达水平在一天内均呈下降趋势（图2 clocka 突变体斑马鱼的构建）。通过JTK-CYCLE方法进一步分析发现，突变体中这四个生物钟基因的振荡表达振幅均显著降低（图2 clocka 突变体斑马鱼的构建），且bmal1b的振荡周期缩短。除了改变时钟基因的表达模式外，昼夜节律紊乱还会影响正常的睡眠-觉醒周期13-15。因此，我们分析了clocka突变体在48小时内的自由游动行为（图2）。clocka 突变体斑马鱼的构建）。结果显示，与野生型/AB 品系相比，clocka 突变体的活动量显著降低（图 2. clocka 突变体斑马鱼的构建）。值得注意的是，clocka 突变体表现出减弱的光敏感性，其日间活动显著减少，但在夜间活动（图2. clocka突变体斑马鱼的构建）。综上，这些结果表明clocka突变体成功构建，并证实clocka在斑马鱼幼虫昼夜节律中发挥作用。

图 2 clocka 突变型斑马鱼的构建。（A）clocka 基因第三外显子上 Cas9-sgRNA 靶向位点示意图。红色方框标注靶向序列；突变株序列比对中，插入碱基以红色字体标注，缺失碱基用红色虚线表示。（B）sgRNA-Cas9 复合物显微注射操作示意图。图由 Figdraw 绘制。（C）野生型 AB 品系（WT/AB）与 clocka 突变斑马鱼株系的桑格测序结果。突变体测序结果显示该位点插入 38 个碱基对。（D）PCR 扩增片段琼脂糖凝胶电泳结果，证实突变斑马鱼体内 clocka 基因敲除成功。clocka 突变体扩增出的片段 1 长度较野生型 AB 株长约 40 个碱基对；片段 2 可在野生型 AB 株中正常扩增，但突变体因靶向区域发生突变无法扩增出该片段。（E）生物信息学分析（工具网址：https://smart.embl.de/smart/change_mode.cgi）表明，该突变会破坏 Clocka 蛋白的 HLH-PAS-PAS 功能结构域。clocka 突变体仅能翻译出 68 个正常氨基酸，而野生型 AB 斑马鱼 Clocka 蛋白全长共 892 个氨基酸。（F）实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）统计柱状图，展示 24 小时内核心生物钟基因bmal1b、per1b、per2、cry1ba的 mRNA 表达水平，基因表达量以 β- 肌动蛋白（β-actin）为内参标准化；采用 JTK-CYCLE 算法分析基因 mRNA 表达节律。实验条件：标准光暗周期下，分别每隔 4 小时收集受精后 6 天（6 dpf）野生型 AB 与 clocka 突变幼鱼总 RNA，持续采集 24 小时（双因素方差分析，**p＜0.01，***p＜0.001，**p＜0.0001；每组 3 份生物学独立样本，每份样本包含 50 尾幼鱼）。柱状图数值为平均值 ± 标准误。（G）核心生物钟基因bmal1b、per1b、per2、cry1ba表达振荡幅度统计柱状图（独立样本 t 检验，****p＜0.0001；每组 3 份生物学独立样本，每份样本包含 50 尾幼鱼）。（H）标准光暗周期下，自受精后 6 天上午 9 点起，连续 48野生型斑马鱼与 clocka 突变体幼鱼在（J）白天、（K）夜间的运动活力统计（独立样本 t 检验，***p＜0.001，ns 代表无统计学差异；每组包含 8 尾生物学独立幼鱼）。柱状图数值为平均值 ± 标准误（SEM）。

clocka 体内调控 M 细胞轴突再生

为探究clocka基因突变对M细胞轴突再生的影响，我们将Tg(T056: EGFP)品系与clocka突变体杂交，获得Tg(T056: EGFP); clocka-/-斑马鱼，实现了对突变型M细胞的体内可视化（图3. clocka基因突变减弱M细胞轴突再生及其运动功能恢复）。随后，我们检测了6 dpf时Tg(T056: EGFP); clocka-/-斑马鱼的体长、M细胞胞体大小以及泄殖腔处的轴突长度。结果显示，clocka突变体与对照组在体长、胞体面积或轴突长度上均无显著差异（附加文件：补充图S3）。这些数据表明，clocka基因突变对M细胞轴突自身的形态发育无可检测到的影响。此后，我们分别在ZT9和ZT21时段对幼虫泄殖腔背侧的M细胞轴突进行双光子激光轴突切断术，并在损伤后2天进行成像以量化再生长度（图3. clocka基因突变减弱M细胞轴突再生及其运动功能恢复）。体内共聚焦成像结果显示，clocka突变体幼虫的M细胞轴突再生长度缩短，表明clocka突变体的再生能力显著低于对照组。值得注意的是，clocka突变体中ZT9损伤与ZT21损伤的M细胞轴突在再生长度上无显著差异（图3. clocka基因突变减弱M细胞轴突再生及其运动功能恢复），这表明分子钟的敲除消除了M细胞轴突再生的昼夜节律依赖性，进一步提示M细胞的再生能力受内源性分子钟调控。

M细胞支配斑马鱼快速逃逸行为，这是单细胞决定一种行为的罕见例子之一16,25。由于这种逃逸行为的形态类似字母C，因此被称为C型起始逃逸反应。为此，我们使用高速摄影技术分析clocka突变体在轴突损伤后的C型起始反应，以探究运动功能的恢复情况（图3 clocka突变抑制M细胞轴突再生及其运动功能的恢复）。结果显示，与对照组相比，clocka突变体在损伤后2天（2 dpi）的C型起始反应最大转向角显著减小（图3 clocka突变抑制M细胞轴突再生及其运动功能的恢复），且达到最大转向角的时间明显延长（图3 clocka突变抑制M细胞轴突再生及其运动功能的恢复）。

图3. clocka突变减弱M细胞轴突再生及其运动功能恢复。（A）转基因品系杂交：将Tg(Tol 056: EGFP)与clocka突变体连续两代杂交，获得Tg(Tol 056: EGFP); clocka -/-品系。由Figdraw绘制。（B）体内双光子激光轴突切断术的时间线。由Figdraw绘制。（C）野生型/AB型和clocka突变体M细胞在ZT9和ZT21时轴突再生的代表性图像。星号表示损伤部位，箭头表示再生的轴突末端。比例尺为100微米。（D）野生型/AB型和clocka突变体M细胞在ZT9和ZT21时从损伤部位开始的轴突再生长度统计图（双因素方差分析，* (^{k} p<0.05) . (* * p<0.01) . (添添添添) 0.0001，(n=12) 0.0001，每组n=12条生物学独立的幼体）。柱状图表示平均值±标准误。（E）C-start反应行为学测试的时间线。由Figdraw绘制。(F) 未受伤组（编号(theta, alpha）和受伤组（编号(theta', alpha')，θ’、α’）中WT/AB和clockg突变体幼鱼原始朝向及最大转向角度位置的代表性图像。红线表示行进方向。比例尺为1毫米。(G) WT/AB和clocka突变体C-start反应最大角度的统计图（双因素方差分析，**(* * * p<0.001)，(* * * p<0.0001)，无显著性差异，(n=9)无显著性差异，每组n=9条生物学独立幼鱼）。柱状图表示平均值±标准误均值。(H)WT/AB 野生型和 clocka 突变体斑马鱼幼虫在未受伤和受伤组中的一系列运动轨迹代表性图像。星号表示最大转向角位置。比例尺，1 毫米。(I) WT/AB 野生型和 clocka 突变体幼虫达到最大转向角时间的统计图（双因素方差分析，* (* * p<0.01) . (*** p<0.0001)，ns 表示无显著差异，每组各 (n=9) 个生物学独立幼虫）。柱状图表示平均值±标准误均值。

为进一步验证 clocka 在M细胞轴突再生中的作用，我们通过单细胞电穿孔对clocka进行单细胞水平的特异性挽救，以观察其对轴突再生的影响。本研究采用CMV-GAL4和UAS-clocka-mCherry双质粒表达系统（图4. clocka的单细胞互补挽救对M细胞轴突再生的影响）。首先，通过显微注射验证clocka过表达质粒的有效性：将双质粒共同注射到单细胞期胚胎中（附加文件：补充图S4A），在4天龄幼鱼的脑部观察到报告基因mCherry的红色荧光表达（附加文件：补充图S4B）。结果显示脑部出现明显的点状红色荧光，qRT-PCR结果证实clocka成功过表达（附加文件：补充图S4C）。验证质粒效力后，我们利用单细胞电穿孔将无内毒素的双质粒系统共转染到4天龄幼鱼单侧M细胞胞体中。电穿孔12小时后，筛选出成功表达红色荧光的轴突。随后，进行双光子激光消融在受精后6天（6 dpf），于泄殖腔背侧的mCherry阳性轴突上进行操作，并在受精后8天（8 dpf）通过活体共聚焦成像观察轴突再生情况（图4. clocka的单细胞互补可挽救M细胞轴突再生）。活体共聚焦成像结果显示，尽管clocka的单细胞互补增强了clocka突变体中M细胞轴突的再生能力，但再生轴突的长度仍显著短于野生型（WT）对照组（图4. clocka的单细胞互补可挽救M细胞轴突再生）。此外，我们想探究clocka的挽救是否能恢复轴突再生的昼夜节律相位依赖性。为验证这一点，我们在受精后6天的ZT9和ZT21时间点，对clocka突变体中成功被挽救的轴突进行双光子激光消融，并在受精后8天的对应时间点通过活体共聚焦成像观察轴突再生（附加文件：补充图S4D）。然而，在ZT9和ZT21时间点，被clocka挽救的M细胞轴突的再生长度并无显著差异（附加文件：补充图S4E）。

上述结果表明，clocka 调控 M 细胞中的轴突再生。clocka 突变显著损伤了损伤后轴突的再生能力以及 M 细胞功能的恢复。clocka 的单细胞恢复部分挽救了突变型 M 细胞的轴突再生能力，但无法恢复其昼夜节律相位依赖性再生。

图4. clocka的单细胞互补可挽救M细胞轴突再生。(A) clocka 表达系统的构建。仅表达 mCherry 的质粒作为对照载体。由 Figdraw 绘制。(B) 单细胞电穿孔、轴突切断和再生成像的时间线。由图draw。(C) 毛特纳细胞单细胞电穿孔中阳性表达（红色）的代表性共聚焦图像。(D) clocka突变体M细胞轴突再生中单细胞clocka挽救与空载体的代表性图像。星号表示损伤部位，箭头表示再生的轴突末端。比例尺为50微米。(E) 单细胞clocka补全后M细胞轴突再生长度的统计图（单因素方差分析，用于补全实验的生物学独立幼体数量为(* p<0.05)、(* * p<0.01)、(n=7）。

clocka 调控与第二信使代谢过程相关的基因

为探究clocka对轴突再生的影响及其潜在下游机制，本研究采用6天受精后（dpf）的clocka突变体与野生型/AB斑马鱼进行高通量RNA测序。火山图分析显示，与对照组相比，clocka突变体中有709个基因显著上调、939个基因显著下调（图5）。clocka调控与第二信使相关的基因代谢过程）。此外，GO 富集分析显示，clocka 突变体中与细胞内信号转导、环状化合物结合以及嘌呤核苷酸结合相关的基因发生了显著变化（图5. clocka 调控与第二信使代谢过程相关的基因），并揭示了多个显著富集的生物学过程。排名靠前的类别包括：免疫系统过程、环状核苷酸代谢过程调控、氧化还原酶活性、第二信使介导的信号传导、昼夜节律、水解酶活性调控以及对环腺苷酸（cAMP）的响应（图5. clocka 调控与第二信使代谢过程相关的基因）。KEGG 分析同样检测到相关信号通路的富集（附加文件：补充图S5A）。其中，既往研究已报道，clocka 突变体中免疫和氧化还原酶相关过程以及昼夜节律相关过程发生显著改变10,12，这进一步证实了本测序结果的可靠性。其余排名靠前的生物学过程均与环状嘌呤核苷酸代谢相关。关键的是，第二信使环腺苷酸（cAMP）和环鸟苷酸（cGMP）在神经发生、生长锥导向以及轴突生长中发挥关键作用37,38。特别是有研究报道，在斑马鱼M细胞损伤后，环腺苷酸（cAMP）可促进轴突再生和运动功能恢复18。因此，本研究推测clocka突变可能通过环腺苷酸（cAMP）代谢影响轴突再生。既往研究表明，特异性水解环腺苷酸（cAMP）的磷酸二酯酶4（PDE4）家族是中枢神经系统（CNS）中发挥作用的主要亚型，并参与调控轴突再生过程27-29,39。这些研究结果与本研究的测序数据一致。基于此，本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）再次验证了测序结果，发现轴突再生相关的pde4a、pde4ba和pde4d的mRNA水平均显著升高（图5. clocka 调控与第二信使代谢过程相关的基因）。为进一步验证磷酸二酯酶4（PDE4）家族在M细胞中的表达情况，本研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了M细胞中磷酸二酯酶4（PDE4）家族基因的表达情况。分析结果显示，磷酸二酯酶4（PDE4）的所有亚型在M细胞中表达（补充文件：补充图S5B）。此外，以往研究表明，CREB通路的激活是环磷酸腺苷（cAMP）调控轴突再生的关键步骤40,41。蛋白质印迹结果还显示，clocka突变体的Creb信号通路活性显著降低（图5. clocka调控与第二信使代谢过程相关的基因）。综合来看，这些结果表明clocka突变可能通过斑马鱼中的Pde4-环磷酸腺苷（cAMP）-Creb轴调控轴突再生。

图 5 clocka 调控第二信使代谢过程相关基因。（A）火山图展示 clocka 突变斑马鱼中上调与下调的差异表达基因。（B）差异表达基因（DEGs）的 GO 功能富集分析，将基因划分至各类特定功能条目。（C）clocka 突变体中富集程度排名靠前的生物学过程条目。横轴为负对数 P 值（-lg Pvalue）。（D）实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）验证野生型 AB 株与 clocka 突变体中 pde4 家族基因表达的统计柱状图；基因表达量以 β- 肌动蛋白（β-actin）作为内参校正。提取受精后 6 天（6 dpf）野生型 AB 及 clocka 突变幼鱼总 RNA 进行检测（独立样本 t 检验，**p＜0.01，***p＜0.001，ns 代表无统计学差异；每组 3 份生物学独立样本，每份样本含 50 尾幼鱼）。柱状图数值为平均值 ± 标准误（SEM）。（E）对比野生型 AB 株，验证 clocka 突变体内磷酸化 Creb（p-Creb）蛋白表达水平。（F）图 E 中 p-Creb 蛋白表达定量统计。以甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（Gapdh）为蛋白内参校正 p-Creb 表达量；使用 Image J 软件定量蛋白条带灰度值（独立样本 t 检验，**p＜0.01；每组 3 份生物学独立样本，每份样本含 50 尾幼鱼）。

clocka 突变消除了 pde4a 的节律性表达并上调其表达

磷酸二酯酶Pde4家族已被确定为脊髓损伤的治疗靶点，但其节律性表达的相关研究尚少。我们首先分析了6天龄斑马鱼幼鱼的24小时转录组测序数据。结果显示，在pde4家族的轴突再生相关亚型中，仅pde4a表现出振荡性表达（图6；clocka突变通过上调pde4a抑制M细胞轴突再生；补充文件：补充图S5C）。因此，我们通过实时荧光定量PCR验证了这一分析结果。JTK-CYCLE分析表明，pde4a信使RNA在24小时内确实呈现显著振荡。随后，我们检测了clocka突变体中pde4a的表达水平。实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，突变体中pde4a的表达失去了振荡特性，且在全天范围内均显著上调（图6；clocka突变通过上调pde4a抑制M细胞轴突再生）。此外，我们向胚胎中注射clocka质粒以回补突变体中clocka的表达，实时荧光定量PCR分析显示，该处理可显著下调clocka突变体中pde4a的表达水平（补充文件：补充图S5D）。这些结果表明，pde4a可在体内受clocka调控斑马鱼。

我们此前开发了一种类似膜片钳的实验方案，可在体内从M细胞中捕获高质量的单个胞体样本²⁶。为进一步验证clocka突变体M细胞中pde4a的表达水平，我们采用该方案在感染后2天（2 dpi）对clocka突变体的M细胞胞体进行了体内单细胞捕获（图6. clocka突变通过上调pde4a抑制M细胞轴突再生）。成像结果显示，原本肿胀发亮的胞体被特制的捕获电极吸管完全吸走（图6. clocka突变通过上调pde4a抑制M细胞轴突再生）。捕获的单细胞样本先进行裂解，随后开展体外逆转录。捕获的单细胞样本经裂解后进行体外逆转录，再完成cDNA完整性检测。之后，对cDNA完整性合格的样本进行严格的污染筛查（附加文件：补充图S5E）。通过比较M细胞标记基因nefmb、胶质细胞标记基因mbp与红细胞标记基因hbae³的表达比例，开展细胞类型纯度分析。最终保留了M细胞标记基因表达比例超过97%的样本（附加文件：补充图S5F）。最后，我们检测了质控合格的单细胞样本中的pde4a mRNA水平。qRT-PCR结果显示，在轴突再生过程中，clocka突变体M细胞的pde4a表达显著上调（图6. clocka突变通过上调pde4a抑制M细胞轴突再生）。值得注意的是，M细胞中pde4d的表达也有所升高，但pde4ba的表达水平无显著差异（附加文件：补充图S5G）。这些结果进一步证实，clocka突变会导致M细胞中pde4a的表达增加。

图 6 clocka 突变通过上调 pde4a 抑制 M 细胞轴突再生。（A）幼鱼 24 小时转录组测序分析得到的 pde4a 节律性表达统计柱状图；采用 JTK-CYCLE 算法检测表达节律（p=0.0053）。（B）实时荧光定量 PCR 验证受精后 6 天幼鱼 24 小时周期内 pde4a mRNA 表达水平，红色曲线为 clocka 突变体，黑色曲线为野生型 AB 株；基因表达以 β- 肌动蛋白为内参校正。JTK-CYCLE 节律分析结果：野生型 AB 株 p=0.00019，clocka 突变体 p＞0.05。实验条件：标准光暗周期下，每隔 4 小时收集受精后 6 天幼鱼总 RNA，持续采集 24 小时（双因素方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；每组 3 份生物学独立样本，每份样本包含 50 尾幼鱼）。（C）M 细胞胞体活体单细胞捕获流程示意图，由 Figdraw 绘制。（D）M 细胞胞体活体单细胞捕获代表性成像图。（E）单细胞水平 qRT-PCR 统计柱状图，以 β-actin 为内参，对比野生型 AB 株与 clocka 突变体 M 细胞内 pde4a mRNA 表达量（独立样本 t 检验，**p＜0.01；clocka 突变体 10 份生物学独立样本，野生型 AB 株 7 份生物学独立样本，每份样本均取自单个 M 细胞胞体）。（F）pde4a 过表达质粒系统构建示意图；仅表达 mCherry 荧光蛋白的空载质粒作为对照，由 Figdraw 绘制。（G）单细胞电转、轴突切断、再生成像检测的实验时间线，由 Figdraw 绘制。（H）野生型 AB 株 M 细胞单细胞过表达 pde4a 后轴突再生代表性成像图；星号标记损伤位点，箭头指向再生轴突末端，比例尺：50 微米。（I）野生型 AB 株 M 细胞单细胞过表达 pde4a 后轴突再生长度统计柱状图（独立样本 t 检验，***p＜0.001；pde4a 过表达组 7 尾生物学独立幼鱼，空载对照组 6 尾生物学独立幼鱼）。（J）野生型 AB 株与 clocka 突变体 M 细胞单细胞敲低 pde4a 后轴突再生代表性成像图；星号标记损伤位点，箭头指向再生轴突末端，比例尺：100 微米。（K）（两种品系）M 细胞轴突再生长度统计柱状图（原文截断）对野生型 AB 斑马鱼及 clocka 突变体实施单细胞 pde4a 敲低处理后的轴突再生长度统计（双因素方差分析，**p＜0.01，***p＜0.001，每组包含 6 尾生物学独立幼鱼）。所有柱状图数值均为平均值 ± 标准误（SEM）。

clocka突变通过上调pde4a抑制M细胞的轴突再生

鉴于PDE4A是唯一与轴突再生相关的亚型振荡表达，我们进一步验证了PDE4A对M细胞轴突再生的影响。同样，我们在体外构建了PDE4A过表达质粒，并通过显微注射验证了其有效表达（图6；时钟基因突变通过上调PDE4A抑制M细胞轴突再生，补充资料图S6A、B）。我们采用单细胞电穿孔法，将其与CMV-GAL4质粒共转染至4天龄幼虫的单侧M细胞胞体。随后，我们对电穿孔阳性的M细胞轴突进行双光子激光轴切，并在损伤后2天对再生长度进行成像（图6；时钟基因突变通过上调PDE4A抑制M细胞轴突再生）。成像结果显示，在野生型M细胞中过表达PDE4A可显著缩短轴突再生长度（图6；时钟基因突变通过上调PDE4A抑制M细胞轴突再生）。而在时钟基因突变体中，进一步过表达PDE4A则显著降低了轴突再生成功率。与过表达空载体相比，过表达PDE4A导致三分之二的轴突在损伤后两天内未能成功再生（补充资料图S6C-E）。为进一步明确PDE4A对轴突再生的抑制作用，我们使用短发夹RNA（shRNA）特异性敲低M细胞中PDE4A的表达[22,42]。为检测shRNA的敲低效率，我们通过显微注射将表达miR-shRNA的质粒注入斑马鱼单细胞胚胎的动物极。四天后，我们在荧光显微镜下选取脑部有红色荧光的幼虫，提取总RNA，通过实时荧光定量PCR检测PDE4A的表达。结果显示，shRNA2可显著降低PDE4A的mRNA表达（补充资料图S6F-H）。随后，我们通过单细胞电穿孔法将其转染至4天龄幼虫的M细胞。两天后，我们对mCherry阳性轴突进行双光子激光轴切，并在8天龄时量化再生长度。体内成像结果表明，shRNA可显著提高M细胞的轴突再生能力，而时钟基因敲除则削弱了这种促进作用（图6：clocka 突变通过上调 pde4a 抑制 M 细胞轴突再生）。综上，这些结果表明 pde4a 的表达对 M 细胞轴突再生具有负调控作用。此外，敲低 pde4a 可部分挽救 clocka 突变体的 M 细胞轴突再生缺陷，这说明 clocka 是通过 pde4a 来调控 M 细胞轴突再生的。

Pde4抑制剂Rolipram可挽救clocka突变体M细胞轴突再生并促进其运动功能恢复

为进一步验证clocka-pde4a轴对M细胞轴突再生的调控作用，我们用咯利普兰43,44（Pde4家族的特异性抑制剂）处理斑马鱼。既往研究表明，咯利普兰可穿过血脑屏障，通过抑制PDE4活性减少cAMP降解，在体外和体内均能促进大鼠脊髓损伤后的轴突再生和功能恢复27。我们首先对6天胚胎期（dpf）的幼虫M细胞轴突进行双光子激光消融，并在损伤后立即用不同浓度的咯利普兰处理。处理两天后，对轴突再生长度进行定量分析（图7：Pde4抑制剂咯利普兰可挽救clocka突变体M细胞轴突再生缺陷，并促进其运动功能恢复）。体内成像结果显示，与溶剂对照组相比，30微摩尔和50微摩尔的咯利普兰均能显著促进损伤后轴突再生，其中30微摩尔咯利普兰的治疗效果最佳（附加文件：补充图S7A-C），因此后续实验选用该浓度。据此，我们在6天胚胎期的野生型/AB品系和clocka突变体M细胞上，于光照周期9时（ZT9）和光照周期21时（ZT21）进行双光子激光消融，损伤后立即通过浸泡方式给予30微摩尔咯利普兰，并在两天后的对应时间点对再生长度进行定量分析。体内成像结果证实，咯利普兰处理显著增强了M细胞轴突的再生能力，且挽救了clocka突变体的轴突再生能力。不过，值得注意的是研究指出，Rolipram 处理消除了 M 细胞轴突再生的昼夜节律相位依赖性，且无法在 clocka 突变体中恢复这种昼夜节律依赖性（图 7：Pde4 抑制剂 Rolipram 可挽救 clocka 突变体的 M 细胞轴突再生缺陷并促进其运动功能恢复）。

我们同样评估了罗利普兰处理的clocka突变体中M细胞轴突消融后的运动功能恢复情况。我们对6天胚胎期（dpf）的clocka突变体M细胞进行了双光子激光轴突切断术，损伤后立即通过浸泡方式给予30微摩尔（μM）罗利普兰，并在损伤后2天（dpi）通过高速摄影检测C型起始反应行为（图7。磷酸二酯酶4（Pde4）抑制剂罗利普兰可挽救clocka突变体M细胞轴突再生缺陷并促进其运动功能恢复）。结果显示，罗利普兰处理显著增加了clocka突变体C型起始反应中的最大转向角度（图7。磷酸二酯酶4（Pde4）抑制剂罗利普兰可挽救clocka突变体M细胞轴突再生缺陷并促进其运动功能恢复），并缩短了达到最大转向角度的时间（图7。磷酸二酯酶4（Pde4）抑制剂罗利普兰可挽救clocka突变体M细胞轴突再生缺陷并促进其运动功能恢复）。这些结果进一步证实，clocka通过磷酸二酯酶4a（pde4a）调控M细胞轴突再生。

图7. 磷酸二酯酶4抑制剂咯利普兰可挽救clocka突变体M细胞轴突再生缺陷并促进其运动功能恢复。(A) 咯利普兰处理的时间线。幼虫在激光消融M细胞后立即暴露于咯利普兰48小时，直至成像。由Figdraw绘制。(B) 30μM咯利普兰处理后，WT/AB型M细胞轴突再生在ZT9和ZT21时的代表性图像。星号表示损伤部位，箭头表示再生的轴突末端。比例尺为100μm。(C) 咯利普兰处理的WT/AB型轴突从损伤部位开始的再生长度统计图（双因素方差分析，* (* * p<0.01)、(水水水水 p<0.0001)，ns表示无显著差异，每组n=9条生物学独立幼虫）。(D) 30μM咯利普兰处理后，clocka突变体M细胞轴突再生在ZT9和ZT21时的代表性图像。星号表示损伤部位，箭头表示再生的轴突末端。比例尺为100μm。(E) 咯利普兰处理的clocka突变体轴突从损伤部位开始的再生长度统计图（双因素方差分析，*** (* * * * p<0.0001)、ns表示无显著差异、(n=9)表示显著差异，每组n=9条生物学独立幼虫）。(F) 咯利普兰处理clocka突变体的C型起始反应行为学测试时间线。由Figdraw绘制。(G) 咯利普兰处理的clocka突变体在未损伤组(theta, alpha)和损伤组(theta', alpha')中原始朝向及最大转向角度位置的代表性图像。红线表示行进方向。比例尺为1mm。(H) 最大角度统计图咯利普ram处理的clocka突变体的C型起始反应（双因素方差分析，** (* * * p<0.001)，ns，无显著差异，每组(n=9)个生物学独立幼虫）。(I) 咯利普ram处理的clocka突变体在未损伤组和损伤组中运动轨迹的系列代表性图像。星号表示最大转向角位置。比例尺，1毫米。(J) 咯利普ram处理的clocka突变体达到最大角度时间的统计图（双因素方差分析，* (^{*} p<0.05)，ns，无显著差异，每组(n=9)个生物学独立幼虫）。所有柱状图均表示平均值±标准误均值。

讨论

本研究揭示了昼夜节律基因clocka在体内M细胞轴突再生中的作用。多项研究结果表明，内源性分子生物钟参与调节机体多种组织的再生过程，包括皮肤45、46、肠道47和造血系统48。近年来，已有研究证实内源性昼夜节律对轴突再生具有调控作用3,4，但相关研究仅局限于外周神经元。这主要是由于哺乳动物中枢神经系统轴突的内在再生能力有限，且损伤后会发生相关改变在外周微环境中49，从而丧失轴突再生能力。相比之下，鱼类中枢神经系统的轴突对再生具有支持性18,49,50，这为探究内源性昼夜节律对中枢神经系统轴突再生的调控提供了可能性，也为克服哺乳动物中枢神经系统再生的固有局限性提供了新的思路。既往研究发现，在与背根神经节感觉神经元再生能力相关的转录组数据集中，昼夜节律调控是富集最显著的通路3，这证实了其内在的分子生物钟以及昼夜依赖性的再生能力。本研究中，M细胞单细胞RNA测序同样揭示了所有核心昼夜节律基因的表达，并证实了昼夜依赖性的轴突再生表型，从而将我们对昼夜节律调控神经修复的认知拓展至中枢神经系统运动神经元。

关于特定昼夜节律基因调控轴突再生的研究仅聚焦于Bmal1的作用3,4。因此，探究其他时钟基因在轴突再生中的调控作用同样具有重要意义。研究表明，CLOCK参与调控小鼠的组织和软骨再生9。此外，敲除bdnf会减弱斑马鱼clocka的振荡表达31，这提示clocka与轴突再生之间存在密切关联。本研究将小鼠外周神经元中Bmal1介导的昼夜依赖性轴突再生研究结果，拓展至斑马鱼中枢运动神经元M细胞轴突的再生过程。我们也不出所料地发现了一些显著差异。首先，De Virgiliis等人证实，小鼠背根神经节感觉轴突的再生能力在ZT8（下午3点）最弱，在ZT20（凌晨3点）达到峰值，且已有独立研究证实，夜间再生能力强于白天3,4。有趣的是，这一模式与我们在M细胞中的研究结果截然相反，M细胞轴突的再生在ZT9（下午5点）达到峰值，在ZT21（凌晨5点）降至最低点。这种差异可能源于不同的昼行性/夜行性特征小鼠与斑马鱼的习性差异51，也可能是由中枢轴突和外周轴突固有的再生能力差异导致的，这一点需要进一步研究。其次，我们的研究结果表明，在突变体中通过单细胞恢复clocka基因，无法恢复其依赖昼夜节律相位的再生能力。我们认为这一差异主要源于实验范式的不同。此前的拯救实验是在体外培养的小鼠背根神经节神经元中进行的，这种方式本质上将神经元脱离了其原生细胞环境，属于理想化的实验设置，不受其他细胞的干扰。相比之下，我们的clocka基因拯救实验是在体内原位进行的，M细胞轴突再生发生在更为复杂的微环境中，这使得节律性再生的恢复更具挑战性。第三，与我们发现的clocka基因突变会显著损害斑马鱼M细胞轴突再生的结果相反，哈拉瓦尼（Halawani）等人证实，Bmal1基因的缺失可通过Tet3介导的表观遗传调控促进轴突再生⁴。我们提出，这一差异主要源于小鼠Bmal1与斑马鱼clocka基因之间的功能分化。在小鼠中，Bmal1被认为是唯一具有非冗余功能的核心节律基因，这表明其在分子节律网络中可能占据更高的层级位置。然而在斑马鱼中，节律基因家族表现出更强的功能冗余性，形成了更为复杂的调控网络。此外，该研究证实，Bmal1通过一种表观遗传机制调控背根神经节（DRG）神经元的轴突再生，该机制涉及对Tet3表达及5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）修饰的调控。鉴于中枢神经系统（CNS）与周围神经系统（PNS）之间已被充分证实的表观遗传差异⁵²,⁵³，损伤诱导的表观遗传反应可能存在显著不同，最终导致了不同的调控结果。从更广泛的角度来看，物种间差异也是造成再生表型出现差异的原因。值得注意的是，clocka基因的突变会消除昼夜节律相位依赖性的再生过程，并损害M细胞轴突的整体再生能力，这与在Bmal1fl/fl小鼠背根神经节中观察到的表型相似。

神经元3. 对clocka基因的单细胞恢复部分挽救了突变M细胞的轴突再生能力。我们认为主要原因是，M细胞的单细胞恢复是在clocka基因全局敲除的背景下进行的，因此无法挽救clocka突变在胶质细胞、炎症细胞等其他细胞中对全身或局部微环境产生的影响。此外，clocka基因敲除可能已导致下游通路发生不可逆变化，例如表观遗传修饰以及潜在的发育缺陷。即便后续恢复clocka基因的表达，也为时已晚，无法弥补这些功能缺陷。然而，仅靠单细胞恢复就能部分恢复轴突再生这一事实，进一步证明了内源性clocka基因在M细胞轴突再生中的重要性。综上，我们的研究结果再次证实，轴突再生是一个受昼夜节律调控的复杂过程。这些研究发现也为轴突再生的节律调控提供了新的见解。

作为中枢神经系统轴突再生的独特模型，M细胞轴突在双光子激光消融后表现出强劲的再生能力。双光子激光轴突切断术可对M细胞轴突的单侧造成极高精准度的损伤，且不会损伤轴突以外的其他组织，因此损伤后的炎症反应非常轻微且局限，这与我们的观察结果一致（附加文件：补充图S8A、B）。此外，我们检测了损伤部位的巨噬细胞是否呈现时间依赖性募集。我们分别在受精后2天的幼虫的ZT9和ZT21时间点，对募集至M细胞损伤部位的巨噬细胞进行了成像。成像结果显示，两个时间点的巨噬细胞募集量无显著差异（附加文件：补充图S8C、D）。因此，我们未进一步探究炎症反应对再生节律的影响，而是聚焦于内源性分子钟对M细胞轴突再生的作用。然而损伤微环境还包含许多其他分子，例如细胞外基质成分和炎症因子。受模型条件限制，我们目前无法对损伤部位进行精准取样。因此，我们无法充分证明损伤微环境是否受昼夜节律的调控。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建了斑马鱼的纯合clocka突变体品系。与此前报道的clocka突变体研究结果一致¹²，clocka突变并未导致斑马鱼幼鱼出现早期存活缺陷和形态发育异常。进一步的体内成像结果也显示，敲除clocka不会影响M细胞的形态与发育。与此前clocka突变体中中性粒细胞迁移增强但迁移节律未消失的研究结果¹²不同，clocka突变不仅削弱了M细胞轴突的再生能力，还消除了其昼夜相位依赖性再生。这可能与不同细胞类型对内源性分子钟的依赖程度存在差异有关。轴突再生是一个复杂过程，严格依赖内源性基因的精准表达程序。clocka突变会破坏核心节律，导致相关再生程序无法正常激活，必然会造成轴突再生过程中丧失昼夜相位依赖性的优化调控。

以往研究已证实环磷酸腺苷（cAMP）在M细胞轴突再生中发挥重要作用¹⁸。环磷酸腺苷水解特异性磷酸二酯酶4（PDE4）家族特异性抑制剂咯利普兰可通过抑制PDE4A、PDE4B和PDE4D亚家族的表达²⁸，在体外和体内促进大鼠脊髓损伤（SCI）后的轴突再生²⁷。基于以往研究结果和本研究的发现，我们推测clocka突变可能通过Pde4家族调控M细胞的轴突再生。通过对24小时内幼虫的高通量转录组测序结果进行分析并结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证，我们意外地发现，仅pde4a基因出现了PDE4家族成员在损伤后呈现出不同的调控模式。其中，pde4a、pde4ba和pde4d的表达水平上调，而pde4cb的表达则显著下调。这种模式很可能反映了PDE4家族内部的功能特异性55。在以往一项关于PDE4家族在甲状腺癌（THCA）中作用的研究中，结果显示PDE4C在甲状腺癌组织中显著上调，而其他PDE4亚型则显著下调56。这一发现与我们的研究结果一致，表明PDE4C与其他PDE4亚型可能存在不同的表达调控机制。此外，以往的研究通过过表达和敲低实验证实，PDE4C的表达与TP53的表达及TP53信号通路活性呈正相关57，而仅TP53就足以在体内促进感觉轴突和视神经的再生58,59。因此，clocka突变除了会导致与再生负相关的pde4a、pde4b和pde4d显著上调外，还可能通过显著降低pde4cb的表达，抑制非经典的Tp53通路，进一步损害M细胞轴突的再生。值得注意的是，Pde家族的振荡表达并非孤立存在。以往研究表明，pde6c和pde6h在斑马鱼幼体中也存在振荡表达60。但由于Pde6家族主要在视觉系统中表达，本文未对其进行深入探讨。此外，有研究报道PDE4家族在神经退行性疾病61、皮肤疾病62,63等多种疾病中发挥核心作用，自身免疫性疾病63, 64。这些结果表明，生物钟也可能在这些疾病中发挥作用。

本研究表明，咯利普兰治疗可促进M细胞轴突的再生，这与以往在啮齿类动物中获得的结果一致27-29。值得注意的是，本研究发现药物治疗虽能增强M细胞轴突的再生能力，但也会消除轴突再生的昼夜依赖性。这可能是因为咯利普兰治疗期间下游信号分子环磷酸腺苷（cAMP）水平持续升高，从而抵消了轴突再生的昼夜节律精细调控。在clocka突变体中，尽管咯利普兰能够挽救轴突再生能力的缺陷，但无法恢复再生的节律，这进一步表明cAMP水平可能是产生和维持轴突再生昼夜生物学特性的关键。一旦神经元内源性昼夜调控受损，昼夜依赖性再生便无法恢复。关键的是，这些结果证明咯利普兰在增强轴突再生的同时，是以牺牲自发性昼夜依赖性再生为代价的。具体而言，这些结果与我们对M细胞轴突clocka进行单细胞挽救的研究结果相似，即后期干预可恢复基线再生能力，但无法恢复昼夜节律相位依赖性再生，这凸显了实现精准神经修复的挑战。这种内源性昼夜调控的丧失可能会引发不可预见的神经疾病风险，进一步强调了节律紊乱对轴突再生的危害，值得进一步研究。

然而，本研究也存在一定局限性。首先，尽管我们明确并验证了M细胞轴突再生的昼夜节律调控，且具有显著的昼夜时间依赖性，但该模型固有的技术局限性——包括体内单细胞捕获的难度以及无法建立体外培养体系——阻碍了我们获取M细胞轴突再生的24小时单细胞转录组测序数据时间维度上的再生。其次，将构建一种在M细胞中条件性敲除clocka的斑马鱼品系，以研究其在轴突再生中的特定作用。最后，尽管我们为clocka通过pde4a调控轴突再生提供了直接证据，但尚未阐明clocka与pde4a之间精确的相互作用机制，这需要在未来开展进一步研究。

综合来看，我们发现内源性分子钟是调控斑马鱼中枢运动神经元M细胞轴突再生的重要因素。本研究为昼夜节律核心调控基因clocka通过pde4a调控轴突再生及运动功能恢复提供了直接证据（图8  clocka通过pde4a调控M细胞轴突再生的机制概览）。本研究旨在更深入地理解中枢神经系统的轴突再生机制，并为基于昼夜节律的神经修复新靶点的探索与开发提供新的思路。

图8. clocka通过pde4a调控M细胞轴突再生的示意图。clocka突变体提高了M细胞中Pde4a的表达水平，从而削弱了轴突再生能力和运动功能恢复能力。单细胞互补实验和Pde4家族抑制剂能够挽救clocka突变体中M细胞的轴突再生能力。由Figdraw绘制。

方法

斑马鱼饲养与动物实验流程

本研究使用的斑马鱼品系包括野生型（WT）/AB品系、Tg(Tol 056: EGFP)品系（亦称Et(T2KHG)zf206，购自日本理化学研究所）30，该品系可通过绿色荧光蛋白（EGFP）标记M细胞，用于体内双光子激光消融实验；以及Tg(mpeg1: mCherry)品系，该品系可在体内用红色荧光蛋白（mCherry）标记巨噬细胞。成年斑马鱼饲养在恒温28.5℃、光暗周期为14/10（14小时光照、10小时黑暗）的鱼类养殖系统中。斑马鱼自然产卵后，将胚胎收集于培养基（5毫摩尔/升氯化钠、0.17毫摩尔/升氯化钾、0.33毫摩尔/升(CaCl_{2})、0.33毫摩尔/升(MgSO_{4})以及0.1%亚甲蓝，pH值7.0）中，并置于28.5℃的恒温培养箱内孵育。从受精后第1天（1 dpf）至受精后第2天（2 dpf），向培养基中添加0.003%的N-苯基硫脲（PTU，购自美国西格玛-奥尔德里奇公司）。添加到培养基中以抑制色素沉着。用于实验的幼虫通过低温休克处死65，完全浸没在冰水混合物中超过60分钟，随后转移至次氯酸钠溶液（500毫克/升）中。中国科学技术大学动物资源中心及学校动物护理与使用委员会制定了所有实验需遵循的规章制度。所有实验步骤均按照ARRIVE 2.0指南执行，并获中国科学技术大学动物实验伦理委员会批准（批准号：USTCACUC1103013）。

基因组编辑

本研究采用CRISPR-Cas9技术进行基因组编辑，以制备斑马鱼clocka基因突变体。研究人员借助在线设计工具CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）³⁶，在clocka核心编码序列的第三个外显子上设计了靶向sgRNA序列，序列为GCCGGGCAACACCCGCAAGA。随后，通过PCR扩增获得包含T7启动子、靶序列和支架序列的体外转录模板。接着，使用MEGAshortscript™ T7转录试剂盒（AM1354，赛默飞世尔科技，美国）以该模板合成sgRNA。将sgRNA（300纳克/微升）与Cas9蛋白（300纳克/微升）（PC1350，Inovogen，中国）在37℃下孵育10分钟，形成sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物。随后，将该核糖核蛋白复合物显微注射到野生型斑马鱼的单细胞胚胎中，获得clocka突变嵌合体。最后，通过杂交育种培育出纯合子clocka突变斑马鱼。

clocka 突变体的鉴定

我们使用Phanta Flash Master Mix（P510，Vazyme，中国）的PCR试剂盒，通过设计的上下游特异性引物，对从野生型和clocka突变体斑马鱼中提取的基因组DNA进行扩增实验。位于clocka基因第三外显子的靶位点。随后，通过2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。然后，使用凝胶成像系统（GenoSens 2100，上海勤翔科学仪器有限公司，中国）对凝胶进行成像。所用的所有引物均列于附加文件：补充表S1中。

质粒构建

每个过表达系统均由两种质粒组成，即CMV-Gal4和UAS-mCherry。UAS-clocka-mCherry与UAS-pde4a-mCherry均为体外构建所得。利用Phanta Flash Master Mix高保真快速预混酶（货号P510，南京诺唯赞生物科技，中国）从斑马鱼cDNA文库中扩增出目的基因的编码序列（CDS）。将扩增得到的CDS序列通过同源重组试剂盒（货号CU201，法国转基因公司）连接至经EcoRI限制性内切酶（货号AI11964A，日本宝生物工程）酶切的空UAS-mCherry质粒中。

为敲低pde4a的表达，我们基于shRNA设计工具（https://www.genscript.com），以miR-30核心序列为骨架设计了短发夹RNA（shRNA）。所用的所有引物均列于附加文件：补充表S1中。

体内单细胞电穿孔

4天龄的斑马鱼幼虫用160毫克/升的3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222，美国Sigma-Aldrich公司）麻醉，随后置于特制琼脂板上的1%低熔点琼脂糖（中国生工生物公司）中固定。使用SUTTER P-97拉制仪（美国Sutter Instrument公司）拉制的特制微量移液器吸嘴装填无内毒素质粒，通过电动交叉滚子轴承显微操作器（美国Siskiyou公司MX7600型）在显微镜下将其移至M细胞胞体一侧。随后，经功率放大器（中国艾科特公司ATA-304C型）放大的正弦电压施加到固定在针座（美国Molecular Devices公司Axoporator 800A型）上的玻璃电极，以递送浓度均为300纳克/微升的质粒。进入胞体。电穿孔12小时后在荧光显微镜下筛选阳性轴突，并为后续激光消融做准备。

双光子激光轴突切断术

在体内激光消融之前，将6天龄的斑马鱼幼鱼用MS222麻醉，并固定在1%低熔点琼脂糖中。使用配备双光子激光器的激光扫描共聚焦显微镜（德国卡尔蔡司公司，LSM980型），在800纳米波长、18%至30%强度的参数下，通过25倍油浸物镜精准消融泄殖腔上方的M细胞轴突。

活体成像

经MS222麻醉的幼虫被包埋在1%低熔点琼脂糖中，在共聚焦显微镜（日本奥林巴斯FV1000）上使用40倍水浸物镜对M细胞轴突和胞体进行成像。以每3微米的间距拍摄Z轴堆叠图像。对于轴突再生实验，幼虫在损伤后2天进行成像。轴突再生长度定义为轴突损伤位点到最长再生轴突分支末端的直线距离。

体内单细胞捕获实验

本实验室近期研发的活体单细胞捕获技术可获取高质量的幼虫M细胞单细胞样本。单细胞捕获实验的可行性分析及详细流程如先前研究所述²⁶。首先，将感染后2天的幼虫用MS222麻醉，并固定于装有2%低熔点琼脂糖的培养槽中。随后，在60倍水浸物镜下使用特制微量移液器，通过负压完全抽吸消融后的轴突胞体。之后，对捕获的单细胞样本进行裂解和体外逆转录，检测样本的cDNA完整性通过生物分析仪系统（美国安捷伦公司 2100 型）进行检测。随后，cDNA 完整性合格的样本采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）进行严格的污染分析。该污染分析通过对比 M 细胞标记基因 nefmb 与胶质细胞标记基因 mbp、红细胞标记基因 hbae3 的占比来开展。最终，保留 M 细胞标记基因表达占比超过 97% 的样本。

自由游动行为测定

为检测幼体的运动节律，研究人员于28.5℃下使用Viewpoint系统（法国ZebraBox公司，Viewpoint）在48小时内评估了其自由游动能力。行为测试于上午9点开始，6天龄的幼体在测试前30分钟放入系统以适应环境。测试程序设置为正常光周期（14小时光照/10小时黑暗），并保持在28.5℃。采用自动视频追踪系统连续两天监测幼体的运动情况，并通过Zebralab 3.11软件（法国Viewpoint公司）对运动数据进行记录。

C型起始反应行为测定

使用高速相机（M230，瑞维勒，中国）以1000帧每秒的帧率记录幼鱼的C型启动反应行为。将2日龄幼鱼置于装有28.5℃养殖水的培养皿中，并先转移到配有适宜环境光的实验平台上进行环境适应。通过电脑控制的扬声器发出声音刺激来触发C型启动反应，利用相机软件（瑞维勒，中国）记录整个运动过程，包括最大转向角度以及达到最大转向角度的时间。最大转向角度定义为幼鱼中线在逃逸行为前后的旋转角度。

转录组测序分析

在6天龄（dpf）时，从clocka突变体以及野生型/AB品系斑马鱼中提取总RNA，每个样本包含50条幼鱼，且进行三次生物学重复。利用寡聚（dT）磁珠富集总mRNA，随后通过裂解缓冲液将其切割为短片段，并使用NEB Next Ultra RNA文库建库试剂盒（货号#7530，美国新英格兰生物实验室公司）逆转录合成cDNA。cDNA文库由生工生物工程（上海）股份有限公司在Illumina测序平台上进行测序。以参考基因组为参考序列，利用HISAT2将经过质量控制的测序读数比对至参考基因组，再通过RSeQC对比对结果进行统计分析。后续使用DESeq进行差异表达分析，差异表达基因（DEGs）的筛选阈值设定为：(qValue <0.05) 以及 (FoldChange >2) 的绝对值。利用clusterProfiler对差异表达基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。

与M细胞轴突再生相关的单细胞转录组测序流程及结果均参考前文的描述²⁶。

RNA提取与实时荧光定量聚合酶链式反应

使用TRIzol试剂（日本Takara公司）从50只幼虫中提取总RNA。随后，将样品在EP管中进行超声破碎，加入氯仿后提取总RNA。接着，使用HiScript II qRT SuperMix II（货号R223，中国Vazyme公司）将1微克总RNA逆转录为cDNA。采用ChamQ通用SYBR qPCR预混液（货号Q711，中国Vazyme公司），在实时定量系统（瑞士Roche公司Light Cycler 96）上构建10微升体系，进行qRT-PCR扩增。mRNA的表达采用(2^{-Delta Delta C t})方法将靶基因水平标准化为持家基因β-肌动蛋白的水平，以计算相对表达水平。每个样本进行三次技术重复检测，三次技术重复的平均值代表每个基因的表达水平。所用全部引物详见附加文件：补充表S1。

蛋白质提取与蛋白质印迹法

收集6天龄（dpf）的WT/AB型和clocka突变型斑马鱼幼虫，使用添加了蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（中国生工生物）对其进行裂解。裂解液经离心处理后，收集上清液并置于冰上。使用BCA蛋白定量试剂盒（中国碧云天生物技术）在酶标仪上测定各蛋白样品的浓度。将样品煮沸4分钟，与5×上样缓冲液混合后在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶上进行电泳，随后转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜在室温下于5%牛血清白蛋白（BSA）和三羟甲基氨基甲烷-吐温20缓冲液（TBST）中孵育1小时，之后用TBST洗涤一次，再与磷酸化环腺苷酸反应元件结合蛋白（p-Creb）抗体（1:1000，中国安木特生物）或甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）抗体（1:2000，中国华安生物）孵育。接着，将膜在室温下与山羊抗兔二抗（1:5000，中国Proteintech公司）孵育1小时。用TBST洗涤印迹三次，通过增强化学发光（ECL）系统（美国赛默飞世尔科技）进行显影。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）对条带密度进行定量分析，并以Gapdh蛋白为参照进行标准化。

药物处理

研究人员使用PDE4抑制剂咯利普兰（abs817932，Absin，中国）对幼虫进行了持续浸泡处理。在对M细胞进行双光子激光消融后，6天龄（dpf）的幼虫立即暴露于10、30或50微摩尔（μM）的咯利普兰中，持续48小时，直至进行活体成像。对照组则使用相同浓度的载体二甲基亚砜（D12345，赛默飞世尔科技，美国）。

统计学分析

使用GraphPad Prism 9（美国圣地亚哥）、Adobe Photoshop 2023和Figdraw（中国科研之家）对图形绘制、数据统计及统计学显著性进行分析。本研究采用非配对双尾t检验、单因素方差分析（ANOVAs）、双因素方差分析（ANOVAs）以及Mann-Whitney检验。样本量、实验方法等详细统计数据均在图例中说明。通过JTK-CYCLE分析评估数据的节律性。M细胞的单细胞转录组测序数据分析方法与之前的研究一致。将幼虫随机分配至不同实验组。所有实验均至少重复三次。显著性阈值设定为(p<0.05)，统计学显著性标记如下：* (^{*} p<0.05)、(^{* *} p<0.01)、(* * * p<0.001)、(* * * * p<0.0001)，ns表示无显著差异(p>0.05)。误差棒代表平均值±标准误（SEM）。