题目：A sensitive orange fluorescent calcium ion indicator for imaging neural activity

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-026-74553-4

期刊：Nature Communications

摘要

基因编码钙指示剂（GECIs）是用于高空间和时间分辨率荧光可视化神经元活动的重要工具。然而，当前性能最高的GECIs主要为绿色或红色荧光类型，这限制了其多路复用选择，以及在1030纳米波长下工作的固定波长飞秒激光器的高效激发。为克服这些局限，我们研发了OCaMP，这是一种从O-GECO1改造而来的橙色荧光GECI，通过定向替换提高了钙亲和力，同时保留了mOrange2优良的光物理特性。与O-GECO1相比，OCaMP的双光子截面、响应性、光稳定性和钙亲和力均得到提升。在培养的神经元、斑马鱼和小鼠皮层中，OCaMP在灵敏度、光稳定性和信噪比方面均优于红色GECIs jRCaMP1a和jRGECO1a。本研究表明，橙色荧光GECI OCaMP是一种适用于1000纳米以上波长的高保真神经成像可靠工具，也是现有绿色和红色GECIs之间光谱空白区的实用选择。

引言

基因编码钙指示剂（GECIs）通过将细胞内钙瞬变转化为动态荧光信号，彻底改变了我们可视化神经活动的能力1-3。双光子（2P）显微镜凭借其能在脑组织中实现光学切片成像且光损伤极小的深层组织穿透能力，已成为体内钙成像的金标准4。与GECIs结合使用时，双光子成像可在单细胞水平上对完整脑组织中的神经活动进行高速记录。

传统上，双光子激发一直依赖可调谐钛蓝宝石激光器。然而，这类系统成本高昂、功率受限，且需要日常维护，这限制了其在众多实验室中的应用4,5。相比之下，固定波长激光器（如掺镱光纤激光器）是一种极具前景的替代方案，其工作波长在1000-1080纳米范围内，具有成本低、功率高的优势，且正越来越多地集成到现代成像平台中5,6。然而，能够在这些激发波长下实现最佳性能的基因编码钙指示剂仍然十分有限。

GECIs 的激发波长与其来源的荧光蛋白支架密切相关。基于 GFP 的传感器（如 GCaMP67 和 jGCaMP88）具有最高的灵敏度、动力学特性和体内适用性，但在 1000 纳米以上的双光子激发效果较差，因为其截面面积在约 950 纳米后迅速下降。红移指示剂通常利用 mApple、mRuby 或 mKate 支架构建，包括 R-GECO19 (jRCaMP1a ^{10}) 和 (K-GECO ^{11})，这类指示剂可将激发波长扩展至 1000 纳米以上，但存在光稳定性差、动力学速度慢、光开关效应以及溶酶体积累等问题12。新型变体如基于 mApple 的 XCaMP- (R^{13}) 和 (RCaMP 3^{14}) 具有更优的响应动力学和动态范围，但仍对 pH 敏感（表观结合值分别为 5.3 和 6.1，对应 (Ca2+) 和 (pKa），且光稳定性和光开关效应较差。

在1030纳米激发下扩大光谱覆盖范围和兼容性的研究促使研究人员基于替代支架开发出了基因编码钙指示剂。(jYCaMP115)是利用黄色荧光蛋白开发的，在1030纳米处实现了更优的激发效果，但相较于GCaMP6，其灵敏度仍较低。最近，研究人员又开发出了基于mScarlet的基因编码钙指示剂PinkyCaMP16，该指示剂具备高灵敏度、光稳定性强、光开关效应减弱的特点，不过存在动力学反应缓慢的问题。远红光和近红外诸如基于 mKelly2 的 FR-GECO1a17、基于 miRFP670 和 miRFP720 的 (iGECl^{18}) 以及基于 miRFP 的 NIR-GECO 变体19,20 等指示剂，其双光子激发峰值可超过 1100 纳米，但无法通过 1030 纳米固定波长激光器实现良好激发。尽管现有许多基因编码钙离子指示剂（GECIs）在技术上可在 1030 纳米波长下激发，但没有一种能在这些成像条件下实现性能的最佳组合。

这些权衡促使我们探索了mOrange2，这是一种橙色荧光蛋白，以其高量子产率、接近1030纳米的强双光子截面以及高光稳定性而著称¹⁴,²¹⁻²³。这些特性使其非常适用于需要重复或长时间成像的应用，包括高帧率记录或动态神经活动的活体成像。

(O-GECO 1^{24})是首个基于mOrange2支架工程化的橙色荧光钙指示剂21–23. 它具有较宽的动态范围（Δ (Delta F / F_{0}=146)），在1030纳米波长下具备强双光子激发能力，但对钙离子的亲和力相对较低（(K_{d}=1500 nM)），这限制了其在神经元胞质钙成像中的应用效果。凭借其高灵敏度、双光子截面和光稳定性，我们以O-GECO1为基础，旨在改造出一种适用于活体成像的优化橙色基因编码钙指示剂。我们假设，引入高亲和力钙指示剂钙结合结构域的突变，可在保留mOrange2光物理特性和O-GECO1荧光变化特性的同时，获得性能更优的钙指示剂。

本文介绍了OCaMP（也称为O-GECO2；下文简称OCaMP）的开发与特性表征，这是一种适用于活体成像的橙色基因编码钙指示剂。OCaMP在保持强荧光响应、光稳定性以及在1000纳米以上波长下具备双光子∆F/F (Delta F / F_{0})信号的同时，还具有更高的钙亲和力。我们在纯化蛋白、培养的神经元、斑马鱼中对OCaMP与jRGECO1a和jRCaMP1a进行了对比测试，并开展了体内多光子颅骨窗成像实验。综上，这些研究结果证实OCaMP是一种性能稳定的橙色基因编码钙指示剂，其性能适用于多种实验手段。

结果

基于高亲和力基因编码钙指示剂的理性设计构建OCaMP

为了在保留 O-GECO1 有利光物理特性的同时提高其钙结合亲和力（(K_{d}=1500 nM)），我们结合高灵敏度钙指示剂的序列比对进行了结构指导的诱变，这些钙指示剂具有亚微摩尔级别的钙亲和力，包括 GCaMP6s（(K_{d}=144 nM)）、jGCaMP8f（(K_{d}=334 nM)）、jRCaMP1a（(K_{d}=82 nM)）和 jRGECO1a（(K_{d}=129 nM)）。值得注意的是，jRGECO1a 与 O-GECO1 的序列相似性最高，仅在 10 个氨基酸上存在差异（补充图 1），这表明它可作为改造以提升结合亲和力的模板。

作为初步设计，我们聚焦于这十个突变中位于M13和钙调蛋白结构域内的六个，并将jRGECO1a中的相应突变引入O-GECO1（I5N、Q267D、L300F、R339K、V347E和N358K）。然而，该构建体在细菌中表达时未产生荧光。由于Q267位于钙调蛋白与环化重排荧光蛋白的界面处，我们推测该残基对正确折叠和生色团成熟至关重要。恢复该突变（D267Q）后荧光得以恢复，得到一个变体相对于 O-GECO1 进行了五次替换：I5N、L300F、R339K、V347E 和 N358K。我们将该构建体命名为 OCaMP（图 1a）。

图1. OCaMP的光物理性质。(a) 蛋白质示意图（上）和线性DNA序列示意图（下）。列出的突变均相对于O-GECO1而言。(b) 纯化蛋白形式下指示剂的钙滴定曲线。(c) 纯化蛋白形式下不同指示剂OFF速率的停流测量结果。(d) 钙饱和（10 mM）和无钙（TBS）溶液中指示剂的单光子激发与发射光谱。(e) 存在（10 mM）和不存在（TBS）钙的情况下，变体的双光子激发光谱以及Δ (Delta F / F_{0})。所有测量均进行了三次重复。

与此同时，我们通过整合来自 jGCaMP8f 的类 M13 肽（第1-19位残基，也被称为 ENOS 肽25,26）测试了一种替代设计。得到的命名为 OCaMP-fast 的变体表现出更快的衰减动力学，但动态范围大幅降低，因此未被进一步研究（补充图2）。

总体而言，这些实验指导了OCaMP的构建——它是O-GECO1的一种变体——通过在钙感应结构域中引入定向突变，在保留1030纳米激发所需关键光谱和结构特性的同时，实现了更高的亲和力。

OCaMP 作为纯化蛋白及在哺乳动物细胞中表达的特性表征

首先，我们测定了纯化的 OCaMP 与 jRGECO1a、jRCaMP1a 相比的动态范围和结合亲和力（图1b；与 jYCaMP1、XCaMP-R 和 OCaMPfast 的比较见补充图2）。OCaMP 表现出显著增强的钙亲和力（K_{d}=131 nM)，比 O-GECO1 高十倍以上，且钙依赖的荧光变化幅度较大 (in)，体外实验中 (Delta F / F_{0}=OCaMP)：46.8；jRGECO1a：11.3；jRCaMP1a：1.4；图1b），对 (Mg^{2+}) 的敏感性极低（补充图3）。

OCaMP 展现出快速的钙解离动力学（k_{off }=5.4 ~s^{-1}），与 jRGECO1a（5.8 ~s^{-1}）相似，且显著快于 jRCaMP1a（0.47 s)；图1c）。OCaMP 的单光子激发和发射峰值分别为 545 纳米和 565 纳米，与 mOrange2 荧光蛋白一致，其光谱与 jRGECO1a（激发/发射：561/589 纳米）和 jRCaMP1a（激发/发射：559/600 纳米）相区分（图1d；补充图4）。

在与(Ca^{2+})结合的状态下，OCaMP的量子产率为0.22，消光系数为(62,900 M^{-1} ~cm^{-1})，且与(Ca^{2+})结合时的单光子分子亮度为13.8（表1）。OCaMP的量子产率与jRGECO1a (Phi=0.20)相近，且低于jRCaMP1a (Phi=0.54)，而其消光系数则超过了jRGECO1a (varepsilon=58,900 M^{-1} ~cm^{-1})和jRCaMP1a (varepsilon=54,100 M^{-1} ~cm^{-1})¹）。在无(Ca^{2+})的条件下，OCaMP表现出较低的基线荧光亮度（F_{0}=0.40），而jRGECO1a为1.5，jRCaMP1a为9.8。在双光子激发下，OCaMP在1000至1120纳米范围内呈现出较宽的激发谱，并在1030纳米处出现显著的荧光峰值响应（ΔF/F (Delta F / F_{0}=42.6)，该值比jRGECO1a（14.1）高3倍以上，比jRCaMP1a（1.4）高30倍以上（图1e）。此外，在接近生理pH的环境中，OCaMP的荧光响应远高于jRGECO1a和jRCaMP1a（补充图5）。

表1. OCaMP 及其他红移 GECI 的光物理性质。OCaMP、jRGECO1a 和 jRCaMP1a 的性质在相同条件下平行测定。aOGECO1 的性质此前已有报道。b(Delta F / F_{0})O-GECO1 的数值在 HeLa 细胞中测定。

我们通过向HeLa细胞施加组胺引发细胞内钙释放，验证了OCaMP的性能（补充图7d、e）。OCaMP表现出稳定的荧光反应，与其在体外观察到的高灵敏度一致。为评估光依赖激活作用，我们在无钙和钙结合两种条件下，用450纳米的短脉冲光照射细胞。正如预期，在无钙和钙结合两种条件下，每次450纳米光脉冲后，jRGECO1a的荧光均显著增强，而jRCaMP1a仅在无钙情况下出现微弱增强。相比之下，在两种条件下，OCaMP 经反复 450 纳米光照射后，其荧光均未出现可见变化（补充图 6）。

我们接下来在人胚肾293细胞中评估了连续双光子激发（激发光：1030纳米）下的光稳定性。在连续双光子激发下，OCaMP的光稳定性远优于其他基因编码钙离子指示剂（120秒内荧光损失率：OCaMP为0.9%；jRGECO1a为21.0%；jRCaMP1a为70.4%）（补充图7a-c）。

综合这些结果表明，OCaMP 在测试的激发条件下未表现出可检测的光开关特性，且具有高光稳定性，这支持了其适用于长期成像以及在多重实验中减少光学串扰的特性。

OCaMP 对电场刺激的神经元培养物的敏感性增强

接下来，我们在培养的大鼠海马神经元中表达了OCaMP，并在场刺激后对钙瞬变进行了成像27（图2a）。表达OCaMP的神经元表现出强烈的细胞质表达和低基线荧光（OCaMP：18.79 ± 1.75 AU；jRGECO1a：40.50 ± 3.00 AU；jRCaMP1a：170.28 ± 9.28 AU；图2b、f）。

图2. OCaMP在培养神经元中的表征。(a) 原代神经元培养场刺激测定的示意图。所有指示剂均在555纳米波长下激发。(b) 表达OCaMP、jRGECO1a和jRCaMP1a的原代大鼠海马培养神经元的基线荧光图像。比例尺为200微米。所有面板均采用相同的线性查找表设置（0–1000任意单位；地狱色图）显示。(c) 施加1次场刺激后各指示剂的(Delta F / F_{0})轨迹。右侧为放大视图。(d) 5、10、20、80和160次场刺激的(Delta F / F_{0})平均轨迹。(e) 不同场刺激次数下各指示剂的(Delta F / F_{0})峰值。(f) 指示剂的基线亮度。荧光强度以任意数字单位（ADU，模数转换单位）表示。(g) 不同场刺激次数下指示剂的半上升时间。(h) 半衰减时间。每个指示剂从3个独立培养物中收集数据；各培养物中OCaMP的(n=91)累积感兴趣区域、jRGECO1a的(n=132)累积感兴趣区域以及jRCaMP1a的(n=157)累积感兴趣区域。除非另有说明，误差棒和阴影区域表示平均值±标准误均值。

针对单个动作电位（AP），OCaMP 产生的荧光响应为 (Delta F / F_{0}=0.49 pm 0.03) = 0.49 ± 0.03，超过了 jRGECO1a（0.31 ± 0.01）和 jRCaMP1a（0.13 ± 0.01）的响应（图2c；另见补充图2，与 jYCaMP1、XCaMP-R 和 OCaMP-fast 进行对比）。在整个刺激范围（1至160个动作电位）内，OCaMP 的峰值响应始终大于这两种红色指示剂（图2d-e）。例如，在160个动作电位时，OCaMP 的峰值 ΔF/F (Delta F / F_{0}) 达到 7.23 ± 0.24，而 jRGECO1a 为 4.33 ± 0.07，jRCaMP1a 为 1.51 ± 0.03。

OCaMP 也展现出与现有生物传感器相当的动力学特性，其中 OCaMP 的半上升时间为 47.36 ± 0.97 毫秒，jRGECO1a 为 43.42 ± 0.65 毫秒，jRCaMP1a 为 72.11 ± 1.91 毫秒；半衰减时间分别为 291.53 ± 9.71 毫秒、310.74 ± 7.08 毫秒和 751.60 ± 31.38 毫秒（图 2g–h）。

综合来看，这些结果表明，与现有的红移指示剂相比，OCaMP 在检测神经元钙信号方面具有更高的灵敏度、更优的动力学特性和更稳定的性能。

OCaMP 对斑马鱼幼虫的自发神经元活动具有更高的敏感性

在证实了OCaMP在培养神经元中的性能后，我们着手确定其能否在体内可靠记录神经元的自发活动。我们在斑马鱼幼体中表达了OCaMP或jRGECO1a，并利用单光子和双光子显微镜进行了自发活动成像（图3a-e）。在单光子和双光子激发条件下，这两种指示剂均标记了广泛的胞体和神经纤维网区域（图3b），且OCaMP检测到的自发光瞬变相较于jRGECO1a更为显著（图3c）。

代表性感兴趣区（ROI）上 (Delta F / F_{0}) 的热图显示，在两种激发模式下，OCaMP 的信号均持续更强（图3d）。合并的ΔF/F (Delta F / F_{0})峰值振幅的累积分布呈现出向右偏移在单光子和双光子激发下，OCaMP 相对于 jRGECO1a 的位移（图 3e；双侧 Kolmogorov-Smirnov 检验：单光子，(D=0.395)、(P<0.0001)；双光子，(D=0.358)、(P<0.0001）。

这些研究结果凸显了 OCaMP 在单光子和双光子成像条件下，对完整斑马鱼大脑中自发性神经元活动检测的灵敏度有所提升。

图3. 利用OCaMP和jRGECO1a对斑马鱼幼体进行钙自发活动成像。(a) 实验示意图，展示了对注射Tol2载体、受精后5天（dpf）且表达OCaMP或jRGECO1a的斑马鱼幼体进行的自发神经活动宽场成像。采用单光子激发（545–575 nm）或双光子激发（1030 nm），以3 Hz的帧率进行180秒成像。(b) 表达OCaMP或jRGECO1a的幼体在单光子（上）和双光子（下）激发下，中脑（mb）和后脑（hb）区域的代表性最大强度投影图。黄色虚线勾勒出鱼体轮廓；带编号的圆圈表示目标感兴趣区域（ROI）示例。(c) OCaMP（橙色）和jRGECO1a（红色）在单光子（上）和双光子（下）激发下，所选目标感兴趣区域的示例(Delta F / F_{0})信号轨迹。为清晰起见，轨迹进行了垂直偏移。(d) 单光子（上）和双光子（下）成像条件下，代表性目标感兴趣区域的(Delta F / F_{0})活动热图。每一行对应一个目标感兴趣区域，且轨迹在时间上对齐。每种激发条件下共用色标。(e) 单光子（左）和双光子（右）激发下测得的钙自发事件的ΔF/F (Delta F / F_{0})峰值振幅累积分布，对比了OCaMP（橙色）和jRGECO1a（红色）。采用双侧柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验对比合并后的ΔF/F (Delta F / F_{0})峰值分布（单光子：(D=0.395)、(P=3.50 ×10^{-8})；双光子：(D=0.358)、(P=2.40 ×10^{-26}）。

小鼠皮层自发和感觉诱发活动的体内双光子成像

为评估 OCaMP 用于体内功能成像的效用，我们在小鼠桶状皮层的2/3层锥体细胞中表达了OCaMP、jRGECO1a和jRCaMP1a，并在清醒、头部固定的小鼠中进行了双光子成像（图4a-b）。表达OCaMP的神经元在胞体和树突中均表现出稳定的自发钙瞬变（图4c）。在胞体中，事件幅度与jRGECO1a检测到的幅度相当或略大，且显著大于jRCaMP1a检测到的幅度；而在树突中，OCaMP产生的反应幅度明显大于任一红色指示剂。

在2分钟的记录中，表现出至少两次自发钙瞬变的体细胞比例在各指示剂间具有可比性（中位数（四分位距）：OCaMP：0.72（0.19），jRGECO1a：0.64（0.26），jRCaMP1a：0.71（0.26）；图4d）。体细胞事件的振幅在OCaMP（ΔF/F (Delta F / F_{0})中位数(IQR)=1.05)（0.95））与jRGECO1a（0.89（0.76））之间相似，而jRCaMP1a的振幅更低（0.27（0.14））（图4e，左图）。在树突中，与jRGECO1a（0.29（0.21））和jRCaMP1a（0.31（0.23））相比，OCaMP产生的中位数（四分位距）反应振幅更高（0.48（0.42））（图4e，右图）。我们发现了少量树突棘-树突对，其中观察到了额外的树突棘事件，而这些事件在相应的树突干中无法检测到。OCaMP检测到这类事件的频率高于jRGECO1a，且在jRCaMP1a数据集中未发现明确的实例（补充图8）。

在触须刺激期间，表达OCaMP的神经元表现出清晰的、时间锁定的钙反应，其峰值振幅超过红色指示剂（OCaMP为2.48±0.19，jRGECO1a为1.00±0.08，jRCaMP1a为0.89±0.10；补充图9）。

表达OCaMP的神经元的基线荧光强度（归一化后）更低，中位数（四分位距）为0.057(0.064)，而jRGECO1a为0.089 (0.126)、jRCaMP1a为0.156 (0.119)（图4f）。自发衰减时间常数的中位数（四分位距）为：OCaMP 0.60秒(0.45)、jRGECO1a 0.51秒(0.42)、jRCaMP1a 0.97秒(0.71)（图4g）。在连续成像过程中，OCaMP表现出极轻微的光漂白，中位数（四分位距）为−0.2% (5.9%)，而jRGECO1a和jRCaMP1a的信号损失更大，分别为27.0% (25.3%)和21.0% (6.7%)（图4h、i）。

综合这些结果，OCaMP 可作为一种稳定、光稳定且灵敏的钙指示剂用于体内成像，其信号幅度和光稳定性均优于现有的红移传感器，能够分辨自发活动和感觉诱发的活动。

图4. 小鼠2/3层桶状皮层神经元自发钙活性的活体成像。(a) 实验方案，包含表达OCaMP的神经元经运动校正后的单平面平均投影图像示例，以及从胞体、树突和轴突中提取的感兴趣区域（ROIs）。比例尺：胞体30微米，神经纤维网10微米。(b) (a)中示例的时间序列图像。(c) OCaMP的示例轨迹，jRGECO1a 和 jRCaMP1a 来自图(a)。(d) 2分钟记录期间显示(220)反应的细胞比例（最小值、第一四分位数、中位数、第三四分位数、最大值）：OCaMP 0.38、0.65、0.72、0.84、1.00（n=28)个视野、4只小鼠）；jRGECO1a 0.19、0.52、0.64、0.78、1.00（n=37)个视野、6只小鼠）；jRCaMP1a 0.19、0.54、0.71、0.80、1.00（n=20 FOVs)、3只小鼠）。单因素方差分析：(P=0.22)。(e) (Ca^{2+})事件的ΔF/F幅度(Delta F / F_{0})（最小值、第一四分位数、中位数、第三四分位数、最大值），位于L2/3胞体：OCaMP 0.18、0.73、1.05、1.68、22.99（n=494)个细胞、28个视野、4只小鼠）；jRGECO1a 0.23、0.64、0.89、1.40、36.69(n=643)个细胞、37个视野、6只小鼠）；jRCaMP1a 0.10、0.20、0.27、0.34、1.58（n=246)个细胞、20个视野、3只小鼠）。对单个事件进行Kruskal-Wallis检验(P<0.0001)；Dunn检验：OCaMP与jRGECO1a对比(P=)、(1.34 ×10^{-46})，OCaMP与jRCaMP1a对比(P<0.0001)，jRGECO1a与jRCaMP1a对比(P<0.0001)。在L1树突/轴突：OCaMP 0.16、0.34、0.48、0.76、3.71(n=765 ROls)、42个视野、5只小鼠）；jRGECO1a 0.10、0.22、0.29、0.43、2.63（n=556)个感兴趣区域、34个视野、6只小鼠）；jRCaMP1a 0.07、0.22、0.31、0.45、1.73（n=368)个感兴趣区域、26个视野、4只小鼠）。对单个事件进行Kruskal-Wallis检验(P<0.0001)；Dunn检验：OCaMP与jRGECO1a对比(P<0.0001)，OCaMP与jRCaMP1a对比(P<0.0001)，jRGECO1a与jRCaMP1a对比(P=0.91)。(f) 基线亮度（最小值、第一四分位数、中位数、第三四分位数、最大值）：OCaMP 0.005、0.032、0.057、0.096、0.603（n=494)个细胞、28个视野、4只小鼠）；jRGECO1a 0.003、0.046、0.089、0.172、1.000（n=644)个细胞、37个视野、6只小鼠）；jRCaMP1a 0.034、0.114、0.156、0.233、0.634（n=246)个细胞、20个视野、3只小鼠）。对单个细胞进行Kruskal-Wallis检验（P=5.58)、(×10^{-60})）；Dunn检验：OCaMP与jRGECO1a对比(P=2.33 ×10^{-19})，OCaMP与jRCaMP1a对比(P=9.97 ×10^{-60})，jRGECO1a与jRCaMP1a对比(P=4.77 ×10^{-22})。(g) 胞体衰减时间常数τ（单位：秒，最小值、第一四分位数、中位数、第三四分位数、最大值）：OCaMP 0.19、0.44、0.60、0.89、9.66（n=494 cells)、28个视野、4只小鼠）；jRGECO1a 0.12、0.35、0.51、0.77、9.58（n=643)个细胞、37个视野、6只小鼠）；jRCaMP1a 0.08、0.61、0.97、1.32、2.5（n=246 cells)、20个视野、3只小鼠）。对单个事件进行Kruskal-Wallis检验(P=2.32 ×10^{-12})；Dunn检验：OCaMP与jRGECO1a对比P = (P=)、(3.35 ×10^{-9})，OCaMP与jRCaMP1a对比(P=7.82 ×10^{-3})，jRGECO1a与jRCaMP1a对比(P=6.68 ×10^{-6})。(h) OCaMP（橙色）、jRGECO1a（红色）和jRCaMP1a（紫色）归一化至(t=0)的平均荧光轨迹（±均值标准误）。(i) 光漂白（变化百分比）：OCaMP -0.2%、(IQR=5.9%)(n=37 FOVs)、4只小鼠）；jRGECO1a 27.1%、(IQR=25.3%)（n=29 FOVs)、4只小鼠）；jRCaMP1a 21.3%、(IQR=6.7%))（n=28 FOVs)、5只小鼠）。对单个视野进行Kruskal-Wallis检验(P=6.65 ×10^{-13})；Dunn检验：OCaMP与jRGECO1a对比(P=3.67 times)、(10-10)，OCaMP与(jRCaMP1a P=1.26 ×10^{-9})对比，jRGECO1a与jRCaMP1a对比(P=1.00)。箱线图展示中位数、四分位距和单个数据点；须线为第一四分位数−1.5×四分位距和第三四分位数+1.5×四分位距。所有事后比较均采用经Bonferroni校正的Dunn检验。(^{*} P<0.05)、(^{* *} P<0.01)、(^{* * *} P<0.001)、(****P <0.0001)；未标记的比较无显著性差异。

OCaMP 可在体内可靠检测单个动作电位

接下来，我们通过在小鼠桶状皮层2/3层神经元中同时进行双光子钙成像和胞旁记录，评估了OCaMP在体内的性能（图5a）。在自发活动期间，记录了表达OCaMP或jRGECO1a的细胞的荧光信号。

荧光信号与单个动作电位呈时间锁定关系，在两种指示剂中均显示出清晰的钙瞬变（图5b）。响应单个动作电位时，OCaMP产生的荧光变化幅度大于jRGECO1a（图5c）。表达OCaMP的神经元中，单个动作电位对应的峰值ΔF/F (Delta F / F_{0})值（15.58±2.04%，(n=8 cells）显著高于表达jRGECO1a的神经元（7.98±1.36%，(n=15 cells)；(p=0.0061)，威尔科克森秩和检验；图5d）。响应动力学特征相近，OCaMP的半上升时间为42.25±1.98 ms，jRGECO1a为44.93±6.59 ms（p=0.42)，威尔科克森秩和检验）；半衰减时间分别为244.13±13.42 ms和210.40±26.83 ms（p=0.049)，威尔科克森秩和检验）。单峰检测的d'值在OCaMP中也显著高于jRGECO1a（OCaMP为3.38±0.33，jRGECO1a为2.18±0.37）（p=0.019)，威尔科克森秩和检验；图5d）。

为评估不同锋电位数量下的性能表现，我们记录了对不同数量动作电位锋电位事件的荧光反应。OCaMP 的 ΔF/F (AUC =0.971) 随锋电位数量呈分级式增加，且在所有测试条件下，其振幅和 d-prime 值均显著优于 jRGECO1a（图5e、f）。值得注意的是，在较高锋电位数量（2-6个动作电位）下，ΔF/F (Delta F / F_{0}) 的差异更为显著，这表明与 jRGECO1a 相比，OCaMP 具有更宽的动态范围且饱和效应更低。ROC 分析进一步证实 OCaMP 能提升锋电位检测能力，在1、2、3个动作电位条件下均获得了更高的 AUC 值（图5g；1个动作电位时 OCaMP 为 4914876f-3b8a-408a-9daa-219f5e3a27bc，jRGECO1a 为 0.918；2个动作电位时分别为 0.999 和 0.955；3个动作电位时分别为 1.000 和 0.978）。

这些研究结果表明，与 jRGECO1a 相比，OCaMP 能够在体内更灵敏地检测单次和多次锋电位活动，其荧光振幅和可分辨性均有所提升，且动力学特性保持一致。

图5. OCaMP可在体内可靠检测单个动作电位。(a) 实验装置。上图：小鼠桶状皮层2/3层表达OCaMP的神经元示例图像。下图：小鼠体内成像和刺激配置示意图。比例尺=10微米。(bar =10 mu m)。(b) 表达OCaMP（上图）或jRGECO1a（下图）的代表性神经元的荧光与电生理同步记录。轨迹下方标注了动作电位（AP）数量。星号表示单个AP事件。右侧为左侧虚线框对应的放大视图。(c) 代表性神经元的荧光响应与单个AP峰值潜伏期（垂直虚线）对齐（OCaMP：9个细胞的478次实验；jRGECO1a：17个细胞的949次实验）。灰色线条为单次实验数据，彩色轨迹为平均值。(d) 单个AP响应的定量分析。箱线图展示了OCaMP和jRGECO1a在每个细胞的试验次数下平均轨迹的峰值ΔF/F (Delta F / F_{0})、半上升时间（t/2 rise）、半衰减时间（t1/2)衰减）和d值。统计比较采用双侧Wilcoxon秩和检验；n=8个细胞(n=8)（3只小鼠，OCaMP）和15个细胞（4只小鼠，jRGECO1a）。峰值(Delta F / F_{0})、半上升时间、半衰减时间和d值分别为(p=0.0061)、0.42、0.049和0.019。星号表示p<0.05；n.s.，(p<0.05)；n.s.，无显著差异。中线为中位数；箱体边界为第一和第三四分位数。(e) OCaMP对诱发AP数量增加的整体平均荧光响应（左图；n=8、8、8、8、(n=8,8,8,8)6、7个细胞对应1-6个动作电位）或jRGECO1a（右侧；(n=15,14,11,8,3)个细胞对应1-5个动作电位）。轨迹显示各次试验的平均值±标准误。(f) 随着动作电位数量增加（1-6个），对峰值ΔF/F (Delta F / F_{0})、半上升时间、半衰减时间和d值进行定量分析。通过单因素方差分析进行统计比较：OCaMP组，p = 0.0000035、(p=0.0000035)、(p=)为0.000018、(p=0.015)、(p=0.040)；jRGECO1a组，(p=0.062)、(p=0.0025)、(p=0.23)、(p=0.34)分别对应峰值(Delta F / F_{0})、半上升时间、半衰减时间和d值。(g) 基于荧光反应检测1、2和3个动作电位的受试者工作特征曲线。曲线下面积（AUCs）：OCaMP组与jRGECO1a组相比，1个动作电位时为0.971 vs 0.918，2个动作电位时为0.999 vs 0.955，3个动作电位时为1.000 vs 0.978。

OCaMP 可在巴甫洛夫条件反射过程中作为绿色多巴胺传感器实现多重体内成像

为了评估 OCaMP 能否在体内与基因编码的神经调节剂传感器实现多路复用且不产生光谱或光学串扰，我们在小鼠的伏隔核（NAc）中与多巴胺指示剂 GRABDA3m28 共表达 OCaMP，并在巴甫洛夫条件反射任务中进行了光纤光度法检测（图 6a）。使用光谱不同的 LED（分别为 565 纳米和 470 纳米）激发 OCaMP 和 GRAB-DA3m，并选择发射滤光片以最大程度减少两个通道之间的信号重叠（图 6b）。组织学分析证实两种传感器在伏隔核内均有强烈且重叠的表达（图 6c）。

在巴甫洛夫条件反射过程中，GRAB-DA3m在奖赏呈现后表现出大的、时间锁定的荧光瞬变，这与相位性多巴胺释放一致；而OCaMP则表现出与任务事件相关的较小但可靠的钙反应（图6d）。将单个试次的荧光轨迹与条件刺激（CS） onset对齐的热图显示了一致的时间安排在所有试次中，OCaMP 报告的多巴胺信号和相应的钙动力学均对奖赏递送产生响应（图6e）。与条件刺激（CS） onset 对齐的试次平均荧光轨迹进一步显示，奖赏后 GRAB-DA3m 荧光出现快速且显著的升高，而 OCaMP 信号则表现出更慢且更温和的响应（图6f）。

在单次奖励试次中，OCaMP 与 GRAB-DA3m 反应的峰值呈正相关（R² (=0.623)、(P<0.0001)；图6g），表明钙活性与多巴胺释放存在试次间的关联。互相关分析显示，在奖励试次中 GRAB-DA3m 与 OCaMP 信号存在时间相关性，多巴胺信号领先钙反应约50毫秒（图6h）。这一发现与记录群体中多巴胺释放在钙反应上游发生的情况一致，也提示二者存在协同但非完全一致的信号动力学特征。尽管该分析表明两种记录信号间存在一致的潜在时间结构，但需注意的是，测得的时滞绝对值反映了真实生物时间节律与两种指示剂动力学特性的综合效应（t_{1 / 2}) 上升：(OCaMP =42.25 pm 1.98 ~ms)、(GRAB-DA3m =20 pm 10 ~ms），解读时需考虑这一局限性。我们进一步评估了奖励事件窗口期外 GRAB-DA3m 与 OCaMP 的动态变化，发现多次 GRAB-DA3m 活性与 OCaMP 荧光高度独立的情况（补充图10），证明两种传感器间不存在光学串扰。

综合这些结果可以证明，OCaMP 能够与 GRAB-DA3m 等绿色指示剂可靠地进行多重成像，从而在动物行为过程中同时对钙信号和神经调质动态进行体内测量，该过程中光学串扰极小，且时间结构得以保留。

图6. OCaMP 与多巴胺指示剂在小鼠伏隔核中的体内多重检测。(a)左图：伏安条件反射期间，分别用于监测(Ca^{2+})和多巴胺（DA）动态的、伏核（NAc）双侧表达OCaMP和GRAB-DA3m的小鼠多重光纤光度记录实验示意图。右图：奖励概率为90%的伏安条件反射试验结构。条件刺激（CS，1秒音调）呈现2秒后给予奖励。(b) 上图：OCaMP传感域荧光蛋白（橙色，mOrange2）和GRAB-DA3m（绿色，eGFP）的激发光谱，LED激发波长分别为470 nm和561 nm。下图：对应的发射光谱。阴影区域表示在探测器处收集的发射光部分。(c) 显示小鼠伏核中OCaMP和GRAB-DA3m共表达的冠状切片。(d) 伏安条件反射期间OCaMP（橙色）、GRAB-DA3m（绿色）和对照等吸收（蓝色）荧光的代表性轨迹（% ΔF/F0）。(e) 奖励试验中OCaMP（上图）和GRAB-DA3m（下图）的(Delta F / F_{0})热图，以条件刺激开始为对齐基准。每行代表一次试验期间的活动(N=2 mice )。(f) 来自(e)的奖励试验中OCaMP和GRAB-DA3m荧光的试验平均(Delta F / F_{0})（%）轨迹。(g) 同一奖励试验中OCaMP和GRAB-DA3m的峰值ΔF/F0响应散点图。每个点代表一次奖励试验中一个感兴趣区（每只小鼠记录2个感兴趣区）的峰值响应。红线表示双侧线性最小二乘回归拟合。显示皮尔逊相关系数（R）和对应的P值(P=5.48 ×10^{-83})⁸³）。(h) 奖励期间GRAB-DA3m与OCaMP信号之间的平均互相关，标注了时间延迟（注：时间延迟反映生物计时和传感器动力学的共同贡献）。所有数据均以平均值±标准误（SEM）表示。

讨论

本研究介绍了OCaMP，这是一种经优化的橙色基因编码钙指示剂，适用于1030纳米双光子激发下的高性能成像。研究以O-GECO1为骨架，引入jRGECO1a的定点突变，在保留mOrange2优良光物理特性的同时，将钙敏感性调节至生理相关范围。所得传感器兼具高灵敏度、光稳定性，且与固定波长工业激光器的光谱兼容性良好，解决了现有红移指示剂的关键局限性。

与O-GECO1相比，OCaMP的钙亲和力提升了10倍以上（(K_{d}=130 nM) 对应 1500纳摩尔），能够在体内检测单个动作电位。在培养的神经元、斑马鱼和小鼠皮层中，OCaMP在响应幅度、动态范围和信噪比方面均优于jRGECO1a和jRCaMP1a。与jRGECO1a和jRCaMP1a相比，OCaMP的无Ca²⁺荧光基线更低(Ca^{2+}），这使其ΔF/F值更大（Delta F / F_{0}），延长成像过程中的光漂白现象减少，且在高密度标记组织中的背景信号更低。尽管基线亮度较低，OCaMP仍能在短时间尺度（约3-6周）内实现体内的高效表达，具备实用优势。

OCaMP 在持续光照下表现出良好的光稳定性，无论是处于钙结合状态还是无钙状态，在受到450纳米蓝光脉冲反复照射时，几乎检测不到光激活现象。这种抗光诱导激活特性以及极低的光漂白特性，使其区别于OCaMP 源自多种红移指示剂，并拓展了其与涉及蓝光激发、光遗传刺激以及长时间成像实验的兼容性。

更广泛地说，我们的研究结果表明，mOrange2 是一种极具潜力且尚未被充分开发的传感器开发支架。OCaMP 与常用的绿色和红色生物传感器的光谱分离特性，使其能够同时光学检测钙信号以及其他生理过程。OCaMP 可与现有的基于 GFP 的生物传感器整合到多重体内记录中，且不会破坏时间结构或产生可检测的光学串扰，这为其在组合功能成像范式中的应用提供了支持。

综合来看，这些研究结果证实OCaMP是一种灵敏且光稳定的钙指示剂，可作为现有绿色和红移基因编码钙指示剂（GECIs）的补充。OCaMP兼具生理钙敏感性、优良的光物理特性，同时兼容1030纳米激发与多路成像技术，为脑深部及多信号光学记录提供了切实可行的选择。

方法

动物护理与使用声明。所有涉及动物的实验程序均按照各研究所机构动物护理与使用委员会批准的方案进行（卡尔加里大学：AC22-0137；日内瓦大学：GE253、GE358、GE388）。本研究已遵守所有适用的伦理法规。C57BL/6J 雄性小鼠（来自 Charles River、Janvier Labs 实验室）与同窝幼鼠一起群养，在卡尔加里大学或日内瓦大学动物设施的标准条件下，于12小时光照周期中饲养直至手术。

所有实验程序均按照瑞士联邦食品安全与兽医办公室的指导方针进行，并经日内瓦州兽医办公室批准（许可证编号：GE253、GE358、GE388）。

分子生物学。编码钙指示剂的哺乳动物表达载体由VectorBuilder公司合成，或通过现有模板经PCR扩增获得。PCR产物和目的载体（pAAV.hSyn、pAAV.CAG、pAAV.hSyn.FLEX或pAAV.FRT.FLEX）经相应限制性内切酶酶切，或通过PCR线性化后，按照制造商方案使用Gibson组装技术（NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix，New England Biolabs公司）进行组装。用于OCaMP插入片段扩增的寡核苷酸由Integrated DNA Technologies（IDT）公司合成，序列如下：正向引物5′-GAT AAG GAT CGA TGG GGA TCC CGT CGT AAG TGG -3′；反向引物5′-GAC AGC GAA GTA AGA ATT CGA AGC TTG ATC-3′。必要时，引入BamHI和EcoRI限制性内切酶酶切位点以完成克隆。最终质粒通过桑格测序进行序列验证。所有构建体均包含源自pRSET的N端RSET序列，以提高表达效率和可溶性。最终质粒通过桑格测序进行序列验证。

哺乳动物表达载体的构建。表达不同(Ca^{2+}指示剂的哺乳动物表达载体（Cre依赖型pAAV.hSyn和pAAV.CAG、Cre依赖型pAAV.hSyn.FLEX以及FLP依赖型pAAV.FRT.FLEX）均由商业合成（VectorBuilder）。所有传感器的N端均携带源自pRSET的RSET肽阅读序列。

AAV的制备与纯化。采用此前报道的方法29制备了含PHP.eB衣壳的AAV病毒载体。PHP.eB衣壳经过工程化改造，可高效转导中枢神经系统29,30。简要来说，293FT细胞（赛默飞世尔科技）在超通量培养瓶（康宁）中培养至约90%汇合度，使用PEIpro转染试剂（Polyplus）共转染129微克pHELPER载体（安捷伦）、238微克编码PHP.eB的rep-cap质粒（pUCmini-iCAP-PHP.eB，由Viviana Gradinaru馈赠，Addgene质粒编号# 103005，RRID:Addgene_103005）以及64.6微克转移质粒。在转染后第3天和第5天收集培养基，使用含40%聚乙二醇/2.5摩尔氯化钠的缓冲液（其中含500毫摩尔氯化钠、40毫摩尔三羟甲基氨基甲烷碱，以及10毫摩尔(MgCl_{2})）从培养基中沉淀AAV。将裂解液与100单位/毫升盐活性核酸酶（Arcticzymes）在37℃下孵育1小时，随后以2000倍重力离心15分钟。使用OptiSeal离心管（贝克曼库尔特），通过含15%、25%、40%和60%碘克沙醇的碘克沙醇分步梯度从所得裂解液中纯化AAV，再使用70Ti型超速离心机转子（贝克曼库尔特）以350000倍重力离心。离心后，用10毫升注射器和16号针头从40%层收集AAV，稀释于含0.001%普鲁洛尼克F68（吉布科）的1×磷酸盐缓冲液中，并用0.2微米注射器过滤器过滤。使用Amicon Ultra-15 100千道尔顿截留分子量离心过滤装置（默克密理博），通过5轮离心对AAV进行浓缩和缓冲液置换。采用qPCR腺相关病毒滴度测定试剂盒（应用生物材料公司）测定滴度，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和ReadyBlue即时凝胶染色剂（西格玛）进行总蛋白染色以验证纯度。

蛋白质纯化与体外表征。将构建体亚克隆至含有N端组氨酸标签和RSET肽的pRSET载体中。将T7Express（NEB）大肠杆菌转化后，于LB培养基中37℃培养，至(OD 600)值达到0.6–0.8。用超声裂解缓冲液（50 mM 三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 7.5；300 mM 氯化钠；10 mM 咪唑；1 mM 苯甲基磺酰氟）裂解细胞，裂解液经20,000×g离心30分钟后澄清。通过Ni²⁺(Ni^{2+})-镍柱亲和层析（Qiagen）纯化蛋白质，用含10 mM咪唑的缓冲液洗涤，再用250 mM咪唑洗脱。洗脱组分经10 kDa分子量截留离心过滤管（Amicon）浓缩并置换缓冲液至三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液（50 mM 三羟甲基氨基甲烷-盐酸，100 mM 氯化钠，pH 7.2）。蛋白质浓度通过280 nm吸光度测定（纳米分光光度计，赛默飞世尔科技）。

单光子光物理测量。在饱和钙（10 mM 钙在三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中缓冲）和无钙（仅含三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液）条件下的单光子荧光强度光谱，使用 Tecan Infinite M1000 酶标仪进行测定。对于 OCaMP 和 OCaMP-fast，激发扫描的波长范围为450至580纳米（发射波长设定为600纳米，带宽10纳米，步长2纳米），发射扫描的波长范围为500至700纳米（激发波长设定为530纳米，带宽10纳米，步长2纳米）。对于 jRGECO1a、jRCaMP1a 和 XCaMP-R，激发扫描的波长范围为450至580纳米（发射波长设定为600纳米，带宽10纳米，步长2纳米），发射扫描的波长范围为500至700纳米（激发波长设定为560纳米，带宽10纳米，步长2纳米）。对于 jYCaMP1a，激发扫描的波长范围为420至550纳米（发射波长设定为530纳米，带宽10纳米，步长2纳米），发射扫描的波长范围为460至650纳米（激发波长设定为500纳米，带宽10纳米，步长2纳米）。

使用钙校准缓冲液试剂盒#2（赛默飞世尔科技）制备了钙亲和力滴定缓冲液，其中游离[Ca²⁺]范围为0至39 μM，并将其与稀释后的蛋白质样品按1:1比例混合。通过激发记录单点激发强度：对于OCaMP和OCaMP-fast，激发波长为545 nm，发射波长为545 nm；对于jRGECO1a、jRCaMP1a和XCaMP-R，激发波长为570 nm，发射波长为600 nm；对于jYCaMP1a，激发波长为530 nm，发射波长为550 nm（所有通道的带宽均为10 nm）。

采用碱变性法测定消光系数。蛋白质在0.1摩尔每升氢氧化钠溶液中变性，以变性荧光素的消光系数为参考（在446纳米波长下消光系数ε = 44000 摩尔⁻¹·厘米⁻¹），测定变性生色团在446纳米波长处的吸光度。天然状态的消光系数通过将天然状态的吸光度除以由变性状态测定的浓度来计算。使用Quantaurus-QY分光光度计（日本滨松市滨松光子学株式会社）对三羟甲基氨基甲烷缓冲液中以及10毫摩尔每升钙离子溶液中的各类指示剂进行了量子产率（QY）测定。

对于pH滴定实验，将纯化的蛋白质稀释到一系列MOPS缓冲液（30 mM MOPS、100 mM KCl）中，pH范围为4至11，这些缓冲液要么含10 mM EGTA（无Ca²⁺），要么含10 mM Ca-EGTA缓冲液，可产生38 μM游离Ca²⁺（与(Ca^{2+})结合）。在固定的激发和发射波长下记录荧光：OCaMP为520/566 nm，jRGECO1a和jRCaMP1a为540/600 nm（激发/发射）。根据荧光值计算ΔF/F (Delta F / F_{0})，并通过为每个条件拟合S形曲线得到表观(pK_{a})值。

停止流动动力学。利用Photophysics SX20停止流动反应分析仪结合荧光检测技术测定关闭动力学，在22℃的10毫米石英流动池中，以530纳米波长激发，通过550纳米长通滤光片进行检测。该仪器的死时间为1.1毫秒。具体操作如下：将1微摩尔/升的每种钙指示剂溶解在1毫摩尔/升的([Ca^{2+}])（三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.2）中，在室温下与10毫摩尔/升的乙二胺四乙酸（三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.2）以1:1的比例快速混合。每种指示剂至少进行三到五次重复实验，对数据取平均值，随后使用GraphPad Prism软件对平均曲线拟合单指数衰减曲线，确定(k_{off })值（单位为(s^{-1}）。

双光子光物理测量。双光子测量使用配备有60倍、1.2数值孔径水浸物镜（奥林巴斯）的倒置显微镜（奥林巴斯IX81）进行。各类钙指示剂在30毫摩尔/升的3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）缓冲液中进行测量，缓冲液中游离钙浓度分别为39微摩尔（+Ca）或0微摩尔（-Ca），pH值均缓冲至7.2。激发过程采用80兆赫兹的钛蓝宝石激光器（相干公司Chameleon Ultra II），以采集710至1080纳米波段的双光子激发光谱；同时使用光学参量振荡器（OPO，相干公司Chameleon Compact OPO）采集1000至1250纳米波段的光谱。物镜收集的荧光依次经过短通滤光片（赛默飞世尔科技720SP）和带通滤光片（赛默飞世尔科技539BP278），随后由滤光耦合雪崩光电二极管（APD，珀金埃尔默SPCM_AQRH-14）检测。亮度光谱经归一化至1微摩尔浓度后，以若丹明Rhodamine (B dye ^{31})为参比，进一步计算得到作用截面光谱（AXS）。

HEK293 细胞的制备。HEK293 细胞在含 10% 胎牛血清（Sigma-Aldrich）和青霉素-链霉素的高糖杜氏改良伊格尔培养基（Sigma-Aldrich，DMEM）中于 37℃ 培养。将细胞接种于多聚-D-赖氨酸包被的玻璃底（#1.5 盖玻片）24 孔板中，按照 Lipofectamine™ 3000 转染试剂盒（Invitrogen）的标准操作流程，每孔加入 1.5 微克 DNA，共设置三个重复样本，转染 pAAV.CAG.OcaMP、pGP-CMV-NES-jRGECO1a 和 pGP-CMV-NES-jRCaMP1a。成像前，细胞于 37℃ 培养 48 小时。

HeLa 细胞的表征与分析。将细胞置于添加了 10% 胎牛血清（Sigma-Aldrich，F7524-500ML）和 1% 青霉素-链霉素（Nacalai Tesque，09367-34）的 DMEM 培养基（Nacalai Tesque，08456-65）中培养。将 HeLa 细胞（ATCC CCL-2，约 5×10⁴ 个/培养皿）接种至使用35毫米玻璃底细胞培养皿（Iwaki，3911-035），加入200微升Opti-MEMI培养基（赛默飞世尔科技，31985-070），利用4微升聚乙烯亚胺（宝赛科学，24765-1，1毫克聚乙烯亚胺稀释于1毫升超纯水中）转染2微克质粒。转染后48-72小时，使用配备pE-300 LED光源（CooILED）、40倍物镜（数值孔径(aperture =1.3)；油镜）、ImagEM X2电子倍增电荷耦合器件相机（滨松光子学）、Cellsens软件（奥林巴斯）和STR载物台培养箱（东海热研）的IX83宽场荧光显微镜对转染细胞进行成像。成像所用滤光片组分别为激发光545/20纳米、二向色镜565纳米长通二向色镜、发射光598/55纳米。为对(Ca^{2+})依赖性荧光进行成像，先将10毫米玻璃底培养皿（Iwaki，10毫米玻璃底）用汉克平衡盐溶液（+）（HBSS(+)；日水制药，09735-75）洗涤两次，在成像前即刻将缓冲液更换为37℃、含10毫米HEPES（日水制药，17557-94）的1毫升HBSS(+)。随后在成像开始1分钟后加入组胺（和光纯药，087-03533，终浓度50微摩尔）。在指定时间点停止成像，用无(Ca^{2+})的汉克平衡盐溶液（HBSS(-)）（日水制药，17461-05）洗涤培养皿两次，并加入1毫升HBSS(-)。接着加入乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸/离子霉素（终浓度2.5毫摩尔/1.5微摩尔）以淬灭(Ca^{2+})依赖性振荡。在指定时间点再次停止成像，继续洗涤培养皿两次并补加HBSS(-)。恢复成像后，即刻加入(Ca^{2+})离子霉素（终浓度5毫摩尔/1.5微摩尔），使指示剂达到饱和。

HEK293细胞中的双光子光漂白实验。将转染后的HEK293细胞置于HHBSS缓冲液（HBSS培养基，购自Gibco，添加HEPES至终浓度10 mM）中，暴露于连续双光子1030纳米激光（20 ~mW / cm^{2}）下120秒。成像采用40倍放大倍率，帧率为0.775赫兹。使用Fiji软件分析图像，通过Prism Graphpad软件拟合并得出非线性衰减曲线及tau值。

HEK293 细胞中的光开关。将转染后的 HEK293 细胞置于 HHBSS 缓冲液中，以 570 纳米波长（用于 jRGECO1a 和 jRCaMP1a）和 545 纳米波长（用于 OCaMP）进行连续成像，时长 22 分钟；期间从第 2 分钟开始，每隔 4 分钟施加一次时长 2 分钟、强度 0.0437 毫瓦的 450 纳米光脉冲，共五次。成像采用 10 倍物镜，放大倍数为 3，帧率为 0.775 赫兹。为螯合 (Ca^{2+})，向体系中加入乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）并同时添加 1.5 微摩尔离子霉素。为使荧光传感器达到饱和状态，向体系中加入氯化钙 (CaCl_{2}) 至 5 毫摩尔浓度，并同时添加 1.5 微摩尔离子霉素。荧光值通过 FIJI 软件获取。

神经元培养物的制备。将新生大鼠幼崽（出生后0天）实施安乐死；分离其大脑皮层和海马组织，将组织置于含木瓜酶（沃辛顿生物化学公司，每对皮层和海马组织约35单位）的神经解剖液（汉克斯平衡盐溶液中加入10毫摩尔/升羟乙基哌嗪乙磺酸，pH值7.4）中，于37摄氏度下解离30分钟。30分钟后，吸除酶解液，将组织块在含10%胎牛血清的最低必需培养基（MEM）中进行机械研磨。研磨完成后，将细胞悬液通过40微米滤网过滤，得到的单细胞悬液进行离心处理。将细胞沉淀重悬于铺板培养基（最低必需培养基中添加28毫摩尔/升葡萄糖、2.4毫摩尔/升碳酸氢钠、100微克/转铁蛋白、25微克/毫升胰岛素、2毫摩尔/升L-谷氨酰胺和10%胎牛血清）中，进行细胞计数。使用Lonza/Amaxa 4D核转染仪，按照制造商的操作说明进行电转染，每次转染使用500纳克质粒和5×10⁵个活细胞。随后，将转染后的细胞接种到经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃底24孔板或35毫米培养皿中，设置3个复孔，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。培养物每周更换两次培养基，每次用新鲜的NbActiv培养基替换50%的旧培养基。

神经元刺激。将钙指示剂克隆到哺乳动物表达载体（带有hSyn启动子的pAAV）中，并转染至新生（P0）大鼠的海马和/或皮质原代培养细胞中幼崽。成像在包被多聚-D-赖氨酸的35毫米玻璃底培养皿中进行。转染后12-14天，将培养基替换为1毫升成像缓冲液（145毫摩尔氯化钠、2.5毫摩尔氯化钾、10毫摩尔葡萄糖、10毫摩尔HEPES、2毫摩尔氯化钙 9a9acbe0-f445-4835-a472-c9b331deb75d、1毫摩尔 (MgCl_{2})，pH 7.3），并在1毫升成像缓冲液及抑制突触传递的药物混合物（10微摩尔CNQX、10微摩尔(R)-CPP、10微摩尔加巴喷丁、1毫摩尔(S)MCPG（Tocris公司））中进行成像。神经元以33.3赫兹的频率接受1、3、5、10、20、40、80和160个脉冲的场刺激（曝光时间30毫秒），并使用10倍物镜进行成像。对于OCaMP、OCaMP-fast、jRGECO1a、jRCaMP1a和XCaMP-R，指示剂在555纳米波长下激发（使用RFP滤光片组，发射波长605/50纳米）；对于jYCaMP1，指示剂在505纳米波长下激发（使用YFP滤光片组，发射波长535/30纳米）。成像是在室温下进行的。记录数据的分析通过定制的Python代码完成。

原代大鼠神经元培养物的表征。在 FIJI 软件中手动绘制感兴趣区域（ROIs）并提取荧光轨迹。每条轨迹的基线荧光（F_{0}）计算为刺激前10帧的平均值。计算每个感兴趣区域的ΔF/F（Delta F / F_{0}）轨迹，并量化每种刺激条件下的峰值振幅。针对每种指示剂，计算所有感兴趣区域的平均值和标准误（SEM），并通过定制R脚本绘制图表。

使用定制的 Python 代码从 ΔF/F (Delta F / F_{0}) 轨迹中提取了开启和关闭动力学特性。对于开启动力学特性，通过确定刺激起始的帧并测量达到峰值 ΔF/F (Delta F / F_{0}) 的90%所需的时间，计算出上升时间（10%–90%）。对于关闭动力学特性，将单指数衰减曲线拟合到刺激后 ΔF/F (Delta F / F_{0}) 信号的下降阶段，并通过 Python 中的最小二乘法拟合获得衰减时间常数（τ）。

斑马鱼幼虫的表达与功能成像分析。通过将Tol2转座酶mRNA（25纳克/微升）与基于Tol2的Elavl3驱动的表达构建体（40纳克/微升）共同注射到单细胞期斑马鱼胚胎中，实现了遗传编码钙指示剂的转基因表达。注射后的胚胎在E3培养基中于28.5摄氏度培养，并在受精后5天（dpf）进行成像。成像时，将幼虫背侧朝上包埋在1.5%低熔点琼脂糖中，并置于标准E3溶液中维持。

采用单光子（1P，545纳米激发）和双光子（2P，1030纳米激发）荧光显微镜以3赫兹的帧频记录神经元自发活动。使用定制的Python脚本进行图像处理和荧光分析。配准后的图像堆栈首先进行均值投影，以辅助感兴趣区域（ROI）的检测。在高斯平滑后的图像上，利用skimage.feature.peak_local_max（scikit-image v0.22.0，(sigma=1.0)，最小距离=6像素）识别感兴趣区域。采用圆形感兴趣区域（radius =5 pixels）提取原始荧光轨迹。使用10帧窗口内10百分位数的滚动基线计算(Delta F / F_{0})。排除最大ΔF/F (Delta F / F_{0})低于0.1的感兴趣区域。根据峰值ΔF/F (Delta F / F_{0})振幅，从每个文件中选取前10个感兴趣区域。使用箱线图汇总(Delta F / F_{0})峰值的分布。分析使用NumPy（v1.26.4）、SciPy（v1.13.0）和scikit-image（v0.22.0）完成，图表使用Matplotlib（v3.8.4）生成。

手术操作和病毒注射（日内瓦大学）。对8-13周龄的雄性C57BL/6小鼠，使用(O_{2})与4%异氟烷按(1-2 L min-1)的配比混合进行麻醉诱导，随后腹腔注射MMF溶液。该溶液由(0.2 mg kg^{-1})浓度的美托咪定（多咪静，奥利昂制药）、(5 mg kg^{-1})浓度的咪达唑仑（多美康，罗氏制药）以及(0.05 mg kg^{-1})浓度的芬太尼（芬太尼，西内蒂卡制药）稀释于无菌0.9%氯化钠溶液中制成。

麻醉注射15分钟后测试脚趾夹反射，以确保麻醉深度。向股四头肌肌肉注射0.02毫升浓度为4毫克/毫升的地塞米松（美法米松，美法），可减轻手术过程中的皮质醇应激反应。

将小鼠头部的毛发剃除，随后将小鼠放置在加热毯上，并将头部固定在立体定位仪中。涂抹眼药膏以保护眼睛，防止脱水和受刺激。用碘伏清洗头皮，然后在皮下注射1%利多卡因（斯特鲁利），再用剪刀剪去覆盖颅骨的约1平方厘米的皮肤瓣。用棉签轻轻刮除颅骨表面的筋膜，用记号笔标记出目标区域。对颅骨表面进行钻孔处理，以增加与牙科粘固剂的粘附面积。使用3毫米活检穿孔器去除单侧半球上方的圆形颅骨区域（直径3毫米），暴露出下方的脑组织。向脑表面涂抹无菌皮质缓冲液（125毫摩尔氯化钠、5毫摩尔氯化钾、10毫摩尔葡萄糖、1摩尔(CaCl_{2})、1摩尔(MgSO_{4}）。向开颅手术区域表面局部涂抹地塞米松（4毫克/毫升，0.02毫升）。将病毒注射到S1区右侧桶状皮质的L2/3层，位置约为C2桶状柱相关区域（从布雷格马点后移1.4毫米、外侧3.5毫米，软脑膜下300微米）。使用直径20微米的玻璃毛细管，通过油压操纵器系统（成茂MMO220A）以机械方式缓慢注射病毒，注射体积为100-200纳升，注射过程持续1至2分钟。

病毒注射通过腺相关病毒（AAV）递送的基因编码指示剂来完成。在OCaMP实验中，要么以完整滴度注射PHPEB.hSyn.OCaMP（约5×10¹²基因组拷贝/毫升，货号(~ 5 ×10^{12} GC / mL），要么将其稀释2倍、10倍、50倍、100倍后注射；或注射完整滴度的AAV1.hSyn.FLEX.OCaMP（约5×10¹²基因组拷贝/毫升，货号((~ 5 ×10^{12} GC / mL），并将其与稀释10倍或100倍的AAV1.mCaMKIIα.iCre.WPRE-hGHp(A)（VVF/ETHZ 货号v206-1，8.7×10¹³基因组拷贝/毫升，货号(1012)）混合注射。在jRGECO1a实验中，将完整滴度的AAV1.syn.FLEX.NESjRGECO1a.WPRE.SV40（Addgene质粒货号#100852，2.2×10¹³基因组拷贝/毫升，货号901d7e1-ac0d-4a63-99cd-6ff60fcb03dd）与稀释50倍或100倍的AAV1.mCaMKIIα.iCre.WPRE.hGHp(A)（VVF/ETHZ 货号v206-1，8.7×10¹³基因组拷贝/毫升，货号(8.7 ×10^{12} GC / mL）混合注射。在jRCaMP1a实验中，将AAV1.Syn.NES.jRCaMP1a.WPRE.SV40（Addgene质粒货号#100848，2.7×10¹³基因组拷贝/毫升，货号(≥1 ×10^{13} GC / mL）稀释10倍或100倍后注射。

将移液管留在原位3–5分钟后，再从脑部取出。取一片厚度约100微米、直径3毫米的盖玻片置于脑部。用氰基丙烯酸酯胶粘剂（乐泰406或百得超强凝胶）将光学窗口密封至颅骨，再用牙科丙烯酸树脂（双组分：义齿修复粉和牙科液体）覆盖颅骨所有暴露区域及盖玻片边缘。所有伤口边缘均用牙科丙烯酸树脂密封。在完整的大脑半球上方的牙科丙烯酸树脂中嵌入定制的1.6克不锈钢杆或0.54克铝杆。通过皮下注射苏醒剂来拮抗麻醉混合液（AFB），其中包括右美托咪啶拮抗剂（阿替泮唑）2.5毫克/千克、氟马西尼（拉巴泰科制药）0.5毫克/千克、丁丙诺啡（保巴q丁丙诺啡）0.1毫克/千克。苏醒过程中，将小鼠单独放置在恢复笼的加热垫上约一小时，并提供湿润的食物。术后48小时内，每天给小鼠服用5毫克/千克的镇痛剂卡洛芬（瑞美达，硕腾），并每日监测以确保其完全恢复。

此外，在术后3天，向饮水中添加第二种抗炎药布洛芬（Algifor、Verfora），剂量为每100毫升饮水含10毫升药液。随后将动物放回饲养笼中，以从手术中恢复。

双光子激光扫描显微镜（日内瓦大学）。在手术和病毒转染至少15天后，小鼠在训练装置上被固定头部10-15分钟，共处理并适应2-3天。用于(Ca^{2+})指标系统比较的成像数据，采集于腺相关病毒（AAV）注射后20至45天，其中大部分数据采集于注射后26至32天。

我们使用了一台定制搭建的双光子激光扫描显微镜，该显微镜安装在模块化活体多光子显微镜系统（https://www.janelia.org/open-science/mimms-10-2016）上，配备了8kHz共振扫描仪和25倍1.1数值孔径物镜（尼康，N25X-APO-MP）。使用调谐至(lambda=1020 ~nm)的钛蓝宝石激光器（变色龙Ultra，相干公司）激发荧光团。荧光信号通过检测路径收集，该路径包含发射滤光片ET620/60 m（Chroma公司）、二向色镜（565dcxr，Chroma公司）和GaAsP光电倍增管（10770PB-40，滨松公司）。图像通过Scanimage 2016b32采集。采集了L2/3神经元（512×512像素，225×225微米）和软脑膜下50–100微米的L1神经纤维网（256×128像素，130×65微米）的功能图像，采集频率分别为30赫兹和60赫兹，物镜前孔径处的激光功率为41至55毫瓦。所有采集过程均持续2分钟。采集了软脑膜下50-100微米的L1神经纤维网（256×128像素，67×33.5微米）的光漂白图像，采集频率为60赫兹，激光功率为59至66毫瓦。

图像处理（日内瓦大学）。利用 Suite2p 工具箱33 对时间序列进行运动校正和分割。根据检测到的感兴趣区域（ROIs）的形状，对其进行人工筛选或剔除。若体细胞型感兴趣区域呈环形或表现出明显的活性，则予以保留；树突型和轴突型感兴趣区域若呈现树突或轴突样形态，或表现出明显活性，则纳入分析。通过对单个感兴趣区域内的所有像素取平均值，测定 L2/3 神经元胞体的荧光时间进程，后续所有分析均通过定制 MATLAB 脚本（美国马萨诸塞州纳蒂克市的迈斯沃克公司）完成。对于 OCaMP 和 jRGECO1a 成像（但不包括 L1 区的树突和轴突），从 L2/3 神经元胞体的原始荧光中减去神经纤维信号，计算方式为 (F_{-} neuron =F_{-} raw -0.7) × 神经纤维荧光值；而表达更稀疏的 jRCaMP1a 则未进行神经纤维信号校正。

归一化钙信号轨迹（ΔF/F (Delta F / F_{0}）按 (F-F_{0}) / F_{0}) 计算，其中 (F_{0}) 被定义为10秒滑动窗口内单个平均基线荧光的30百分位数。随后将荧光信号(F(t))转换为z分数，用于提取自发活动的峰值，并使用Savitzky-Golay函数（2阶，366毫秒跨度）对轨迹进行额外滤波。使用findpeaks函数在每个感兴趣区域（ROI）的z分数轨迹中识别局部最大值，自适应阈值设定为中位数(X) + 2×平均绝对偏差(MAD)(X) + 标准差(STD)(X)，其中X代表z分数形式的Ca²⁺ (Ca^{2+})轨迹，平均绝对偏差计算为mean(abs(X−mean(X))。最小峰距设为300毫秒，最小峰突出度设为自适应阈值，且峰之间需至少间隔5个数据点以剔除伪影。

通过 Suite2p 识别的感兴趣区域（ROI），若在 2 分钟记录期间至少出现两次事件，则被归类为有反应的细胞。以半自动化方式统计每个视野中表达指示剂的神经元总数：利用 Suite2p 的解剖学检测功能检测到大部分细胞体，并手动添加所有视觉识别到的遗漏细胞。为测量衰减时间常数（τ），将单指数函数 (f(t)=A cdot e^{b t})（其中 A 为振幅，b 为衰减率，t 为时间）拟合至每个检测到的峰。随后将衰减时间常数 τ 计算为 1/b，仅保留决定系数（R²）值高于 0.7 的拟合结果用于测量。测定漂白率即每段120秒的录音中，从最初10秒到最后10秒的平均强度的百分比变化。

手术操作与病毒注射（卡尔加里大学）。清醒双光子成像的所有操作均按照先前发表的方案进行³⁴。简要来说，小鼠经异氟烷麻醉后，皮下注射丁丙诺啡（0.1毫克/千克）、恩诺沙星（10毫克/千克）和美洛昔康（3毫克/千克）。在无菌条件下，切除头皮并清理颅骨，使用快速胶水和牙科粘固剂（Tetric EvoFlow，帕特森牙科，阿尔伯塔省卡尔加里市）将U型金属头杆固定在颅骨上。在持续浸泡于HEPES缓冲人工脑脊液（142毫摩尔氯化钠、5毫摩尔氯化钾、10毫摩尔葡萄糖、10毫摩尔HEPES、3.1毫摩尔(CaCl_{2})氯化钙、1.3毫摩尔(MgCl_{2}）的条件下，在桶状皮层处进行开颅手术。将编码钙指示剂的AAV载体注射到桶状皮层中。注射完成后，用T型玻璃盖玻片密封开颅部位。

小鼠训练（卡尔加里大学）。手术四周后，让小鼠在空气支撑的球形聚苯乙烯泡沫球上跑动时适应头部固定。最初让小鼠自由跑动15分钟，随后对其对侧触须施加间歇性空气脉冲刺激（15次刺激，每次5秒，每60秒一次）。

双光子激光扫描显微镜（卡尔加里大学）。成像使用定制搭建的双光子显微镜完成，该显微镜由钛蓝宝石激光器（Coherent Ultra II，800 nm 处平均输出功率约 4 W，重复频率约 80 MHz）驱动。图像采集由 ScanImage 软件（3.81 版，HHMI/简利亚研究园区）控制。OCaMP 的激发波长为 1030 nm，jRGECO1a 和 jRCaMP1a 的激发波长为 1040 nm。使用的物镜为 16 倍水浸型、数值孔径 0.8（尼康）。显微镜配备了 695 nm 的主二向色镜。发射的荧光通过 560 nm 副二向色镜和 605/70 nm 带通滤光片（用于 jRGECO1a 和 jRCaMP1a）或 550 nm 副二向色镜和 585/65 nm 带通滤光片（用于 OCaMP）进一步分束和滤波（Chroma 科技公司）。

感官刺激与图像分析（卡尔加里大学）。记录了神经元对侧方触须刺激的反应。在30秒基线记录后，通过两根玻璃管向侧方触须吹气，持续30秒。使用定制的Matlab脚本分析神经元钙信号34,35。选取对应单个神经元胞体的感兴趣区域（ROIs），并通过将荧光信号（F）归一化至刺激前时期的平均信号所定义的基线荧光（F_{0}），计算出(Delta F / F_{0})轨迹。使用基于突出度的峰检测算法（SciPy的find_peaks函数，突出度阈值为0.5）在刺激窗口内识别出峰值ΔF/F (Delta F / F_{0})反应。对于刺激期间检测到的每个峰值，提取(Delta F / F_{0})值，并汇总所有感兴趣区域用于统计分析。

手术操作和病毒注射（小鼠桶状皮层的双光子成像与胞旁记录同步进行）。所有动物实验均按照日内瓦大学伦理委员会及日内瓦州当局批准的方案进行（许可证编号 GE253、GE388）。实验使用5周或17周龄的C57BL/6J遗传背景的成年雄性小鼠（Charles River公司）。为在小鼠桶状皮层表达钙指示剂，在小鼠麻醉状态下进行病毒载体的立体定向注射，麻醉由以下混合物诱导：以0.8升/分钟的流量通入氧气并使用4%异氟烷（Provet）进行麻醉，随后通过腹腔注射MMF溶液维持麻醉状态；该溶液由0.2毫克/公斤美托咪定（Orion Pharma公司）、5毫克咪达唑仑（Sintetica公司）和0.05毫克/公斤芬太尼（Mepha公司）稀释于无菌0.9%氯化钠溶液中配制而成。

使用 PHPeB.hSyn.OCaMP 病毒载体表达 OCaMP，并联合使用 pAAV.Syn.Flex.NESjRGECO1a.WPRE.SV40（AAV1）（Addgene 质粒 # 100853）与 ssAAV-1/2mCaMKIIa-iCre-WPRE-hGHp(A)（VVF/ETHZ # v206-1）来表达 jRGECO1a。将小鼠头部固定在立体定位仪（Stoelting 公司产品）上。维持小鼠体温约 37 摄氏度。涂抹眼药膏以防止眼部脱水。通过局部涂抹 1% 利多卡因（Streuli 公司产品）为小鼠提供镇痛处理。在小鼠头部皮肤处涂抹碘伏和 70% 乙醇进行消毒。剥离颅骨上方的皮肤后，使用牙科钻在右侧桶状皮层（囟门后 1.4 毫米、中线旁 3.5 毫米）处进行开颅手术。以约 60 纳升/分钟的速度，在 1-2 个位点、约 300 微米深度（2/3 层）处注入约 100-200 纳升病毒。使用皮层缓冲液（125 毫摩尔氯化钠、5 毫摩尔氯化钾、10 毫摩尔葡萄糖、10 毫摩尔 HEPES、2 毫摩尔 97a5c89-9ea2-43bb-9c07-f012ec648507、2 毫摩尔 (MgSO_{4}）或林格氏液（145 毫摩尔氯化钠、5.4 毫摩尔氯化钾、10 毫摩尔 HEPES、1 毫摩尔 (MgCl_{2})、1.8 毫摩尔 (CaCl_{2}）来维持脑部湿润或清洗创口。使用医用胶缝合伤口后，将小鼠放回饲养笼恢复。

针对OCaMP的双光子成像与电生理同步急性实验在病毒注射后约3周至1.5个月开展，针对jRGECO1a的实验则在病毒注射后约2至2.5个月开展。遵循上述相同的手术操作步骤直至暴露颅骨，使用氰基丙烯酸酯胶和牙科水泥在小鼠右侧桶状皮层固定一块金属板（约2 (x 3 ~cm^{2}）。制作直径约1-2毫米的圆形颅骨开窗术，移除硬脑膜。在颅骨开窗处上方铺设琼脂糖（林格氏液中浓度0.5-2%）和盖玻片，以减轻组织运动。

实验使用定制的双光子激光扫描显微镜（Holtmaat 等人，2009，《自然实验方案》）开展，该显微镜配备了钛蓝宝石激光器（Chameleon Ultra，Coherent 公司）、普克尔盒（Conoptics 公司）、振镜扫描镜（Cambridge Technology 公司）、GaAsP 光电倍增管（10770PB-40，滨松光子）以及 16 倍水浸物镜（数值孔径 0.8，CFI75，尼康公司）。采用波长为 1020 纳米、功率约 69-124 毫瓦（在物镜前孔径处测量）的激光激发 OCaMP 或 jRGECO1a。发射光通过 565 纳米二向色镜（565dcxr，Chroma 公司）和两个带通发射滤光片（510/50 纳米和 620/60 纳米；Chroma 公司）进行光谱分离。成像采集通过 ScanImage 软件控制（Pologruto 等人，2003，《生物医学工程在线》）。以约 30 赫兹的帧频采集软脑膜下约 79-194 微米处 2/3 层细胞的功能图像，图像分辨率为 64×64 像素，视野尺寸为 53×53 微米 (53 ×53 mu m^{2})。

采用2P引导膜片钳技术记录2/3层神经元的胞旁记录（Kitamura等人，2008，《自然·方法学》）。使用垂直微电极拉制仪（Narishige公司）从硼硅酸盐玻璃拉制出尖端电阻为5-8兆欧的膜片钳玻璃微电极。膜片钳玻璃微电极内液和开颅手术处的外部溶液均使用林格氏液。在内部溶液中加入30微摩尔的AlexaFluor-488，以便在2P成像过程中对玻璃微电极进行可视化。完成胞旁记录后（初始封接电阻范围为9-91兆欧，(n=26 cells），在电流钳或电压钳模式下结合同步功能成像，测定神经元的自发放电活动。电生理数据经Multiclamp 700B放大器（Axon仪器公司）和Digidata 1440A数字化仪（分子设备公司）以6-10千赫兹的频率滤波，并以20千赫兹的频率采样。电生理记录的数据采集为由 pCLAMP 10 软件（美谷分子仪器公司）控制，该软件可将输出信号发送至 ScanImage 软件，以触发功能成像的采集操作。

手术流程与病毒注射（艾伦脑科学研究所神经动力学部）

根据我们之前发表的方案36，对9-16周龄的雄性C57BL/6小鼠完成了腺相关病毒（AAV）的立体定向注射以及光纤植入手术。简要来说，小鼠经2%异氟烷麻醉后，去除头皮以安装头架和光纤植入物。在颅骨的前囟后（AP）+1.2毫米、内侧-外侧（ML）±1.35毫米处钻两个钻孔，以便向伏隔核核心进行双侧病毒注射和光纤植入。将两种病毒AAVPHP.eB-hSyn-OCaMP（最终滴度5×10^13 TU/mL，对应序列(5 ×10^{12} GC / mL）与AAV-PHP.eB-hSyn-GRAB-DA3m（最终滴度2.5×10^13 TU/mL，对应序列(10^{12} GC / mL）混合后，用玻璃移液管以200纳升的体积（速率120纳升/分钟）向每个钻孔的背腹侧（DV）-4.3毫米处注射。病毒注射完成后，在每个注射位点上方植入光纤探针（光纤芯径200微米，插芯直径1.25毫米，购自Neurophotometrics公司）。

光纤光度法（艾伦神经动力学研究所）

手术后至少恢复三周，小鼠接受轻度限水，体重维持在基线体重的约90%。在记录前4天，让小鼠适应抓取、光纤光度学尾纤连接和头部固定操作。为减少运动伪影对光度学信号的影响，对动物进行头部固定。光纤光度学记录采用定制的CMOS基系统，按照我们之前发表的方案37进行。有关定制硬件设置的详细信息可在此处查阅：https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.261ge39edl47/v2。有关控制LED激发时序和同步CMOS帧采集的硬件触发方案的详细信息可在此处查阅：https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.kxygx3e6wg8j/v1。简而言之，使用470纳米LED激发GRAB-DA3m，565纳米LED用于激发OCaMP，415纳米LED作为对照通道（GRAB-DA3m的近似等发射点）。通过二向色分束器（Semrock FF562）将橙色发射信号与绿色/对照发射信号分离，使橙色和绿色/对照信号分别在两个独立的CMOS传感器上采集，无需进一步进行信号分离。发射信号经过滤波（GRAB-DA3m：520±20纳米；OCaMP：630±35纳米；对照组：）并在独立的CMOS传感器上采集。三个LED也按时间交错排列，以60赫兹的频率依次激活（每个LED的有效采样率(channel =20 ~Hz)），顺序如下：（1）470纳米激发，信号由CMOS相机1捕获，反映GRAB-DA3m的活性；（2）415纳米激发，信号由同一CMOS相机1捕获，作为对照；（3）565纳米激发，信号由CMOS相机2捕获，反映OCaMP的活性。使用Teensy 4.1微控制器控制CMOS传感器和LED触发，同时通过定制的Bonsai程序38从CMOS传感器采集图像。同一Bonsai程序还用于控制巴甫洛夫条件反射行为范式，每次试验包括条件刺激“CS”音调（5千赫兹纯音，-70分贝，持续1秒），随后延迟2秒，且有90%的概率给予水奖励（2微升）。这些提示奖励试验之间的间隔时间为随机可变的试间间隔，最短为5秒。

我们使用定制的 Python 脚本对数据进行了预处理和分析，具体方法如我们之前所述³⁹。简要来说，我们先通过低通滤波器对每个时间序列去趋势，再利用一个 (4^{th }) 阶多项式拟合来校正光漂白效应，随后将其归一化为 ΔF/F 的百分比形式 (% Delta F / F_{0})。接着，我们在每次奖励试次中条件刺激（CS）出现前后的事件相关时间窗内提取处理后的信号轨迹。

为了可视化事件相关的变化，我们在条件刺激（CS）出现前后的事件窗口中提取了单次奖励试次的信号轨迹，随后通过减去CS出现前2秒内的平均信号对轨迹进行局部基线校正。在进行时间滞后和互相关分析时，我们将这些轨迹进一步标准化为Z分数（mean =0)、(SD=1），以便计算皮尔逊相关系数（R）。为评估整个记录过程中传感器动力学的独立性，我们在GRAB-DA3m轨迹中定位了所有峰值——这些峰值需至少达到5%的ΔF/F (Delta F / F_{0})阈值，且彼此间的时间间隔不低于2秒，随后我们确定了这些时间点对应的OCaMP信号。

数据分析。使用 ImageJ（https://imagej.net/ij/）和 MATLAB（MathWorks）中自定义编写的脚本对双光子（2P）图像进行处理。基于钙调蛋白结合蛋白（/jRGECO1a）信号，利用 MATLAB 中的 NoRMCorre 工具箱对双光子图像的横向漂移进行校正。使用 ImageJ 根据钙信号手动选取覆盖 patched 细胞胞体的感兴趣区域（ROIs）。通过对感兴趣区域内所有像素取平均得到每个感兴趣区域的荧光信号，且未减去胞体周围的神经纤维信号。

基于电生理记录，动作电位（AP）事件被定义为：1）间隔为(interval <0.2)秒的锋电位（也通过肉眼观察进行了验证）；2）相邻动作电位事件的第一个动作电位之间的事件间隔大于1秒。

钙信号的时间序列被归一化为ΔF/F (Delta F / F_{0}=(F(t)-F_{0}) / F_{0})。对于动作电位（AP）事件的钙信号，(F_{0})计算为从-11到-1个图像帧至第一个动作电位峰值期间的荧光平均值；对于包含多个动作电位事件的更长钙信号时间序列，(F_{0})计算为(10th)百分位数。为确定钙信号随动作电位数量变化的振幅和动力学特征，基于对应不同动作电位数量的平均钙轨迹（每个细胞≥3次试验）计算峰值、上升半时和下降半时。峰值振幅的计算方式为：第一个动作电位峰值后-0.02至0.28秒内识别到的峰值与第一个动作电位峰值前-0.12至-0.02秒内的平均钙信号基线之间的差值。上升半时和下降半时分别计算为峰值振幅的0-50%和100-50%对应的时间跨度。

为量化钙指示剂的灵敏度，基于单次实验的“信号”和“噪声”计算了d'指数和受试者工作特征（ROC）曲线。信号被定义为相对于第一个动作电位（AP）峰值在-0.02至0.28秒内的荧光峰值响应，而噪声被定义为相对于第一个动作电位（AP）峰值在-0.32至-0.02秒内的荧光峰值响应。该每个单元格的 d′ 指数（d′）均根据其均值（μsignal、μnoise）和方差（σ (sigma^{2} signal, sigma^{2} noise ）计算得出根据公式（1），来自单次实验的信号值和噪声值（每个细胞(≥3)次实验）：

通过汇总各细胞单次试验的信号和噪声，计算出每个AP编号的ROC曲线。