题目：Glutamine Depletion Induced Senescence-Associated β-Galactosidase Activity and Impaired Functional Properties of Ea.hy926 Endothelial Cells

原文链接:https://doi.org/10.3390/cells15121116

期刊：Cells

摘要

谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸，对内皮稳态具有重要作用，而内皮细胞功能障碍与谷氨酰胺代谢改变及向应激反应通路的转变相关。本研究结合支持性功能活性实验，探究了谷氨酰胺和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性在Ea.hy926内皮细胞（ECs）中的作用。研究发现，谷氨酰胺缺乏会导致内皮功能进行性下降。具体而言，谷氨酰胺缺乏的内皮细胞表现出SA-β-gal活性升高，同时增殖能力受损、细胞形态发生紊乱、早幼粒细胞黏附增加，且在斑马鱼异种移植模型中促进宿主组织增殖和内皮细胞形态发生的能力减弱。这些研究结果表明，谷氨酰胺的可利用性对维持内皮完整性和功能活性至关重要。

关键词：谷氨酰胺；衰老相关β-半乳糖苷酶活性；人脐静脉内皮细胞Ea.hy926；斑马鱼

引言

谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸，是几乎所有哺乳动物细胞的基础代谢底物。它作为生物合成过程和能量产生的主要碳源与氮供体，参与氧化还原平衡、核苷酸合成以及细胞稳态的维持。在细胞培养系统中，谷氨酰胺的添加浓度通常高于其他氨基酸，以满足增殖细胞大量的能量和生物合成需求。除代谢功能外，谷氨酰胺对免疫系统和胃肠道系统的正常运作至关重要，同时也是蛋白质、核酸及其他大分子合成的必需物质。

重要的是，谷氨酰胺已被确定为Akt-mTOR信号轴的关键调控因子，该通路整合细胞内和细胞外信号以调控细胞生长、增殖和存活。研究表明，慢性谷氨酰胺耗竭会激活mTOR信号传导，同时损害自噬溶酶体功能，这种组合会破坏自噬，最终导致内皮细胞功能障碍。相反，补充谷氨酰胺可以减弱mTOR的激活并恢复自噬通量，减轻内皮细胞功能障碍相关的损伤。

SA-β-半乳糖苷酶活性升高是血管病变的标志，也是心血管疾病的主要诱因。在内皮细胞中，这种状态以代谢退化为特征一氧化氮、内皮素1、前列腺素、血栓烷、血管内皮生长因子以及血管紧张素转换酶等内皮源性介质的表达下调与调节紊乱。这些分子调控血管张力、凝血、炎症、氧化应激、免疫细胞迁移以及代谢稳态。内皮细胞在动脉粥样硬化等心血管疾病的发病机制中发挥重要作用，动脉粥样硬化是一种以内皮损伤、脂质沉积和动脉僵硬为特征的慢性炎症性疾病。由排列在血管壁上的单层内皮细胞构成的内皮系统，在维持血管完整性方面起着关键作用。持续的内皮细胞功能障碍，加之氧化应激和慢性炎症，与血管稳态受损及心血管疾病风险升高密切相关。

评估内皮细胞中的SA-β-半乳糖苷酶活性可能为确定缓解血管疾病的策略提供有价值的信息。包括谷氨酰胺在内的几种非必需氨基酸在代谢应激、损伤或内皮功能障碍的情况下会变为条件必需氨基酸。精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、牛磺酸以及谷氨酰胺等氨基酸均与血管健康的调节和动脉粥样硬化的发生发展相关。尤其是谷氨酰胺，在心血管相关研究中展现出抗氧化、抗炎和抗凋亡的特性。此外，它可作为精氨酸及后续一氧化氮合成的前体物质，同时改善血脂异常、胰岛素抵抗、高血压和肥胖等代谢风险因素，从而促进血管健康。

内皮细胞中SA-β-半乳糖苷酶活性升高相关的一个关键代谢变化是谷氨酰胺利用的改变。在健康的内皮细胞中，谷氨酰胺主要通过谷氨酰胺分解代谢，为三羧酸（TCA）循环供能以支持能量产生。然而，当内皮细胞功能异常时，谷氨酰胺代谢会转向生物合成途径，例如己糖胺生物合成途径，该途径介导核苷酸、蛋白质和脂质的糖基化反应。这种代谢重编程会加剧氧化应激和炎症信号传导，并在心脏病理生理过程中发挥作用。该通路的失调可能进一步加重内皮功能障碍。值得注意的是，SA-β-半乳糖苷酶活性并非功能障碍的唯一驱动因素，而是与氧化应激、炎症以及代谢灵活性受损协同作用，加速血管病变的发展。事实上，谷氨酰胺代谢正被越来越多地认为是血管生成、血管重塑、内皮功能障碍和动脉粥样硬化形成的关键调控因子。

在本研究中，我们利用人源Ea.hy926内皮细胞评估了谷氨酰胺可用性在衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性中的作用。体外实验表明，谷氨酰胺是维持内皮细胞健康的关键物质。短期谷氨酰胺缺乏会导致内皮细胞出现显著的功能损伤，包括SA-β-gal活性呈剂量和时间依赖性升高。包括细胞增殖、基质胶形态发生和黏附分析在内的其他功能检测进一步证实了我们基于SA-β-gal活性得出的结论。此外，以推荐浓度（2.0毫摩尔）补充谷氨酰胺，可促进异种移植斑马鱼胚胎中形成类细胞团结构。

结果

谷氨酰胺缺失的内皮细胞中SA-β-半乳糖苷酶活性增强

SA-β-gal活性是一种在次优溶酶体pH值（6.0）下检测的应用广泛且稳定的生物标志物。这种酶活性反映了溶酶体体积的增加和代谢状态的改变。首先，我们证实了谷氨酰胺缺乏在13天内的剂量依赖性效应（图1和图2），其中图1以蓝色强度显示SA-β-gal活性，图2显示SA-β-gal阳性（蓝色）细胞在总数中的占比。其次，我们证实了谷氨酰胺缺乏在5天和10天时间点的时间依赖性效应（图3和图4），其中图3以蓝色强度显示活性，图4显示SA-β-gal阳性（蓝色）细胞的占比。

Ea.hy926 内皮细胞常规在添加了2.0毫摩尔谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基中培养。基于我们在谷氨酰胺缺乏条件下观察到内皮细胞增殖受损的显微结果，我们对用不同浓度谷氨酰胺（0.0、0.3、1.0和2.0毫摩尔）处理13天的内皮细胞进行了SA-β-半乳糖苷酶染色实验，这是一种广泛用于评估细胞功能异常的方法。选择13天这一时间点，是因为我们观察到谷氨酰胺缺乏的内皮细胞停止增殖，且部分细胞在原代传代过程中死亡并被冲洗掉，剩余细胞进入静止的非增殖状态。尽管出现这种生长停滞，剩余细胞在培养中仍保持活性，在后续2-3次传代（对应13天）中重新接种时，仍能重新黏附于培养板，与对照组内皮细胞相比无明显差异。采用多种谷氨酰胺浓度使我们能够评估其对内皮细胞潜在的剂量依赖性效应。与预期一致，我们观察到内皮细胞出现形态学改变的比例呈剂量依赖性增加，包括细胞变平、体积增大，同时细胞核变大且形状常不规则。2.0毫摩尔的最高谷氨酰胺浓度为标准培养条件，作为对照组（图1）。

图1. 随着谷氨酰胺的耗尽，SA-β-半乳糖苷酶活性呈剂量依赖性增加。(a) 在四种谷氨酰胺浓度（2.0、1.0、0.3和0.0 mM）处理13天后，对SA-β-半乳糖苷酶活性进行评估，其中2.0 mM作为对照条件。(b) 使用ImageJ软件将SA-β-半乳糖苷酶活性以像素密度进行定量分析。定量分析表明，随着谷氨酰胺浓度的降低，SA-β-半乳糖苷酶活性呈逐步升高趋势。单因素方差分析（ANOVA）后进行Student’s t检验显示，与谷氨酰胺耗尽相关的SA-β-半乳糖苷酶活性出现了显著（* (*p<0.05)）至极显著（(***p<0.001)）的升高。实验分组：2.0 mM、1.0 mM、0.3 mM和0.0 mM；每组独立实验重复次数为N=3。Scale bar =100 mu m

SA-β-Gal检测显示，随着谷氨酰胺消耗的增加，染色细胞的强度和数量明显增加（图1a）。ImageJ测量的蓝绿色细胞强度显示，不加谷氨酰胺补充的ECs表现出最强烈的着色，其次是0.3mM和1.0mM谷氨酰胺组。对照ECs（2.0 毫摩尔）组的染色强度最低。在不含谷氨酰胺的条件下培养的内皮细胞（0.0 毫摩尔谷氨酰胺），其 SA-β-半乳糖苷酶染色阳性率相较于添加 2.0 毫摩尔谷氨酰胺的对照组细胞约增加了 10 倍。同样，0.3 毫摩尔和 1.0 毫摩尔这两个中等浓度的谷氨酰胺组，与对照组相比染色阳性率分别增加了 6.4 倍和 3.4 倍（图 1b），且这种差异在 *** (***p<0.001) 和 (*p<0.05) 水平上具有统计学意义。这为 SA-β-半乳糖苷酶活性的升高与谷氨酰胺耗竭的剂量依赖性关系提供了有力证据。除了使用 ImageJ 软件检测蓝绿色细胞的染色强度外（图 1），我们还对各处理组中 SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞的百分比进行了定量分析（图 2）。对阳性细胞百分比的定量分析同样显示，在谷氨酰胺耗竭条件下（0.0 毫摩尔谷氨酰胺），SA-β-半乳糖苷酶活性有所升高，不过该检测方法的灵敏度低于染色强度的测定方法。

图2. 谷氨酰胺耗尽条件下SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量的定量分析。在ImageJ软件中对图像进行颜色反卷积并选择“阿尔辛蓝”通道后，应用统一的阈值范围（0-110）来识别和定量SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞（以红色高亮显示）。(a) 代表性图像，展示了用于定量分析的细胞检测和阈值设定参数。(b) 以总细胞数为参照，测定了SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例。定量分析结果显示，随着谷氨酰胺浓度降低，SA-β-半乳糖苷酶活性呈剂量依赖性增加。单因素方差分析（ANOVA）结合学生t检验表明，在谷氨酰胺耗尽条件下，SA-β-半乳糖苷酶活性呈极显著升高（***）。实验分组：2.0毫摩尔、1.0毫摩尔、0.3毫摩尔和0.0毫摩尔；每组进行独立实验重复。

在后续的实验中，我们旨在确定谷氨酰胺缺失在内皮细胞中诱导的变化的时间起始点和幅度。我们采用与此前实验相同的谷氨酰胺浓度，对内皮细胞进行5天和10天的谷氨酰胺缺失处理，而非13天（图3）。图3a显示，谷氨酰胺缺失处理仅5天，SA-β半乳糖苷酶活性就已升高。与在2.0 mM谷氨酰胺条件下培养的对照组相比，在0.3 mM和0.0 mM谷氨酰胺中培养5天的细胞，其SA-β半乳糖苷酶活性分别增加了近1.4倍和1.9倍，且该差异具有高度统计学意义（图3a、b）。同一图中，经10天谷氨酰胺缺失处理的细胞也呈现出与5天处理组一致的趋势。在这一时间点，内皮细胞比5天早期阶段更易受影响，在0.3 mM和0.0 mM谷氨酰胺条件下，其SA-β半乳糖苷酶活性强度相较于2.0 mM谷氨酰胺对照组分别增加了1.9倍和2.9倍（图3c、d）。这一效应具有高度统计学意义（*** (***p<0.001)）。我们检测到谷氨酰胺缺失对SA-β半乳糖苷酶活性存在剂量依赖性反应。即便是中等浓度的谷氨酰胺（0.3 mM），也表现出极显著的差异。此外，我们对5天和10天谷氨酰胺缺失处理的两个实验组中SA-β半乳糖苷酶阳性细胞的百分比进行了定量分析（图4）。两种定量方法均得出了一致的结论：在5天和10天的处理周期内，谷氨酰胺缺失以剂量依赖性方式增强了内皮细胞的SA-β半乳糖苷酶活性。这一结果证明，谷氨酰胺缺失会导致Ea.hy926内皮细胞的SA-β半乳糖苷酶活性失调。

图3.内皮SA-β-gal活性随谷氨酰胺耗尽时间延长而增加。（a，c）与5天相比，谷氨酰胺耗尽10天后SAβ-gal染色强度更大。（b，d）谷氨酰胺耗尽5天和10天后SA-β-gal活性的定量分析。单向方差分析和学生t检验显示，与对照组（2.0 mM谷氨酰胺）相比，在0.0 mM谷氨酰胺条件下10天后SA-###-gal活性增加了大约三倍，具有高度显著性（***(***p<0.001)）。在5天时，增加小于两倍，但仍然显著（**(**p<0.01)）。组：2.0 mM、0.3 mM和0.0 mM；每组N=3独立实验重复。*p<0.05。

图4.定量分析证实了谷氨酰胺耗竭对SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比具有时间和剂量依赖性效应。对SA-β-半乳糖苷酶染色的细胞进行图像去卷积和基于阈值（范围0-110）的定量分析，结果显示出与图3一致的模式，即在谷氨酰胺浓度降低的条件下，SA-β-半乳糖苷酶活性升高。对三种谷氨酰胺浓度下SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞比例的定量分析表明，随着谷氨酰胺可利用度的降低，阳性细胞比例显著升高。单因素方差分析后进行Student t检验显示，培养5天时，维持在0.0 mM谷氨酰胺环境中的细胞，其SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞比例相较于2.0 mM对照组出现极显著增加，阳性细胞占比达70%。培养10天后，这一效应更为显著，SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞比例接近90%（*** 组别：2.0 mM、0.3 mM和0.0 mM；每组独立实验重复数）。

谷氨酰胺耗竭可诱导Ea.hy926内皮细胞中SAβ-半乳糖苷酶活性显著且呈剂量和时间依赖性升高，该现象最早可在5天内检测到，至10天和13天时酶活性显著增强。与2.0 mM的对照组相比，谷氨酰胺可利用性降低（0.0–1.0 mM）可显著提高SA-β-半乳糖苷酶染色强度以及SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例，同时还伴随细胞生长停滞和形态学改变。这些研究结果表明，谷氨酰胺耗竭可快速破坏Ea.hy926内皮细胞的稳态，并促进溶酶体相关的SA-β-半乳糖苷酶活性升高，而这一酶活性是内皮功能障碍的公认标志。

内皮细胞中谷氨酰胺缺乏导致增殖活性降低

血管生成内皮细胞具有较高的糖酵解和谷氨酰胺分解速率，这两条途径均可为出芽生长和细胞增殖提供大部分所需的生物合成中间产物与能量。因此，我们着手探究谷氨酰胺缺失对内皮细胞增殖的影响（图5）。谷氨酰胺是哺乳动物细胞培养基中常用的重要氨基酸补充剂，同时也是辅助能量来源，尤其在细胞快速分裂时作用显著。将人Ea.hy926内皮细胞置于谷氨酰胺缺失条件下培养5天和10天后，细胞数量出现显著减少（图5a、b）。将对照组（2.0 mM谷氨酰胺）和谷氨酰胺缺失组（0.0 mM谷氨酰胺）的相同数量细胞接种至96孔板中，并在在含5%二氧化碳的37摄氏度条件下培养，于第2天和第4天使用图像细胞仪（ImageXpress Pico，Molecular Devices公司）进行计数。在内皮细胞传代过程中，谷氨酰胺耗尽的细胞增殖能力下降，而在每两周更换培养基时，会常规去除脱落或无活性的细胞。虽然培养过程中一定程度的细胞死亡是常见现象，但在谷氨酰胺耗尽条件下细胞死亡显著增加。需重点说明的是，用于实验的这些内皮细胞均为贴壁且有活性的；值得注意的是，在增殖实验前每周进行两次重新铺板后，谷氨酰胺耗尽的细胞仍能重新贴附到培养板上。结果显示（图5c、d），在2天和4天的增殖实验中，对照组内皮细胞（2.0毫摩尔谷氨酰胺）的细胞数量分别增加了1.3倍和3.2倍。相比之下，谷氨酰胺耗尽5天的细胞无法增殖；在2天和4天的细胞增殖实验中，其细胞数量分别降至初始第0天的56%和72%。谷氨酰胺耗尽10天的细胞也呈现出类似趋势。对照组细胞（2.0毫摩尔谷氨酰胺）在2天和4天的细胞增殖实验中，细胞数量分别增加了1.7倍和2.6倍，而谷氨酰胺耗尽的细胞在2天和4天的细胞增殖实验中，细胞数量分别降至初始第0天的63%和71%。细胞增殖实验显示，2天组（**(**p<0.01)）和4天组（(***p<0.001)）存在统计学上的显著差异（图5d）。

图5. 谷氨酰胺缺乏条件下内皮细胞的增殖显著降低。(a,c) 用于在DAPI和Hoechst染色后定量总细胞数的96孔板中内皮细胞的代表性图像。(b,d) 源自图(a,c)的内皮细胞计数图表。在第5天和第10天两个时间点，未添加谷氨酰胺的培养物中细胞增殖均大幅减少，细胞数量仅有轻微增加或逐渐下降。相比之下，维持在2.0 mM谷氨酰胺中的对照组内皮细胞随时间推移呈现稳定的增殖扩增。对同一时间点下不同谷氨酰胺条件进行单因素方差分析，随后进行Student t检验。分组：2.0 mM和0.0 mM；独立实验重复组N=4 per和Scale bar =700 mu m

谷氨酰胺缺失的内皮细胞表现出血管生成缺陷

谷氨酰胺是体内含量最丰富的循环氨基酸，也是内皮细胞（ECs）的关键代谢底物，可支持蛋白质合成、三羧酸（TCA）循环回补反应、氧化还原平衡及增殖能力。部分研究表明谷氨酰胺代谢谷氨酰胺对于内皮细胞的短期迁移并非必需，但也有研究表明其对于顶端-柄细胞动态变化及迁移行为至关重要，这使得该领域存在尚未解决的争议。为解决这一问题，本研究利用基于基质胶的管状结构形成实验探究了谷氨酰胺缺乏对内皮细胞形态发生的影响，该实验是成熟的体外血管生成模型，内皮细胞可在细胞外基质信号和血管生成因子的刺激下形成毛细血管样网络。通过评估内皮细胞在谷氨酰胺缺乏5天和10天后形成管状结构的能力（图6和图7），本研究旨在为阐明谷氨酰胺在内皮细胞形态发生调控中的作用提供新见解，并明确其对内皮细胞形态发生行为的贡献。

图6.谷氨酰胺缺乏会损害内皮细胞管状结构的形成。(a,c) 内皮细胞在暴露于谷氨酰胺缺乏环境5天和10天后进行的管状结构形成实验。对照组内皮细胞（2.0 mM谷氨酰胺）形成了特征性的中空管状网络，而谷氨酰胺缺乏的培养物形成有序结构的能力下降。(b,d) 对(a,c)图中的管状结构面积进行定量分析。谷氨酰胺缺乏5天后，维持在0.0 mM谷氨酰胺条件下的细胞，其中空管状面积降至对照组的约41% (b)。未铺覆Matrigel基质的细胞未形成管状结构 (a)。谷氨酰胺缺乏10天后，内皮细胞基本丧失了管状结构的形成能力 (d)。红色轮廓区域展示了使用ImageJ通过像素密度定量的代表性中空管状面积 (c)。采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Student's t检验，(***p<0.001)）。每种谷氨酰胺条件均分析了5个培养板，无Matrigel组除外（3个培养板）。5天实验：2.0 mM组（独立实验重复样本 N=5）、0.0 mM组 (N=5) 以及无Matrigel组 (N=3)。10天实验：2.0 mM组 (N=5)、0.0 mM组 (N=5)及 Scale bar =100mum

我们通过两种方法评估了内皮细胞（EC）的形态发生能力。首先，我们使用ImageJ测量了管状结构面积（空心管状面积）的密度。最初，我们观察到在谷氨酰胺缺失5天的内皮细胞中出现了部分管状结构。然而，在5天处理组中，对照组内皮细胞（2.0毫摩尔谷氨酰胺）在整个孔板中呈现出广泛的空心管状区域，这是内皮细胞在基质胶中发生形态发生的标志。作为阴性对照，我们在无细胞外基质的条件下培养内皮细胞，以确认在缺乏基质支持的情况下不会形成管状结构（图6a）。与对照组（2.0毫摩尔谷氨酰胺）相比，谷氨酰胺缺失5天的细胞在管状结构形成过程中下降至41%，该差异具有统计学显著性（*** (***p<0.001)（图6b）。当内皮细胞在谷氨酰胺缺失的条件下长时间培养（10天）后，谷氨酰胺缺失（0.0毫摩尔谷氨酰胺）组细胞的管状结构几乎完全消失（图6c）。与对照组（2.0毫摩尔谷氨酰胺）相比，这些细胞的管状结构形成面积减少至3%，这种微弱的反应表明其无法对基质胶产生形态发生反应（图6d）。本研究旨在专门测定Ea.hy926内皮细胞形成管状结构的能力，这是血管生成的基本特征。在该实验中，内皮细胞以近乎汇合的单层形式培养，并使用基质胶诱导腔样结构形成。该方法与其他内皮细胞实验方法不同，后者以低密度接种细胞，无法形成汇合层，最终形成类似“渔网”模式的相互连接网络。这些网络以分支点和伸长的细胞-细胞聚集体为特征，模拟管状连接但缺乏腔样结构。本研究提供了一种独特的实验方法来评估内皮细胞的腔样结构形成，并对腔样面积进行了定量检测（图6）。其次，我们还在同一实验中测定了不同的内皮细胞形态发生参数，以量化管状结构的总长度和作为节点的分支点数量，并将这些分析整合至图7中。同样，10天的谷氨酰胺缺失几乎使内皮细胞丧失了在基质胶中发生形态发生的能力。综上，这些谷氨酰胺缺失（0.0毫摩尔）的内皮细胞表现出β-半乳糖苷酶活性升高、细胞增殖活性丧失以及血管形态发生缺陷，这些均指向功能异常的内皮细胞表型。基于这些观察，我们进一步在异种移植模型中检测了谷氨酰胺缺失对早幼粒细胞-内皮细胞黏附以及内皮细胞与斑马鱼宿主细胞相互作用的影响。

图7. 谷氨酰胺长期耗竭导致管状结构形成能力丧失。(a) 管状结构网络定量示意图，展示了总管长度（蓝色线条）和分支节点（红色数字）的测量方法。使用ImageJ软件对管长和节点数量进行定量分析。(b,c) 处理5天后，对照组（2.0 mM谷氨酰胺）与谷氨酰胺耗竭组（0.0 mM）在总管长度和节点数量上均未观察到显著差异。然而，谷氨酰胺耗竭10天后，内皮细胞的管状结构形成能力几乎完全丧失，节点形成极少，总管长度出现极显著降低(*** (***p<0.001))。5天和10天实验均采用以下条件：2.0 mM谷氨酰胺组（独立实验重复 N=3）和0.0 mM谷氨酰胺组 (N=3)。Scale bar =100 mu m

谷氨酰胺缺失促进早幼粒细胞与内皮细胞的黏附

谷氨酰胺是免疫功能的主要调节因子，对髓系细胞和淋巴样细胞均有影响。淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞会高速消耗谷氨酰胺。正因如此，谷氨酰胺可被视为谷氨酰胺可作为免疫系统的能量来源，其在血液循环中的含量可能调节免疫功能并影响临床结局。2019年冠状病毒病（COVID-19）患者体内的谷氨酰胺耗竭与免疫细胞和血管细胞功能障碍相关，且与致命性肺及血管并发症的发生风险有关；同时，谷氨酰胺耗竭也是重症监护病房患者住院死亡的独立预测因素。其他针对需要肠外营养（静脉输注）的重症监护病房患者的研究也证实，补充谷氨酰胺可降低患者死亡率。

我们进一步研究了谷氨酰胺缺乏对早幼粒细胞与内皮细胞黏附的影响（图8），这可能对病理生理状态具有潜在意义。谷氨酰胺缺乏的内皮细胞表现出HL-60细胞黏附能力增强。对照组内皮细胞（2.0毫摩尔谷氨酰胺）的黏附数为5786个HL-60细胞，而谷氨酰胺缺乏组（0.0毫摩尔谷氨酰胺）的黏附数显著增加，有15307个HL-60细胞结合在内皮细胞单层上，相较于对照组（2.0毫摩尔谷氨酰胺）增加了2.7倍。因此，内皮细胞的谷氨酰胺缺乏会导致早幼粒细胞与内皮细胞的黏附增强。

图8. 谷氨酰胺缺乏的内皮细胞表现出HL-60早幼粒细胞黏附能力增强。将早幼粒细胞系HL-60与在不同谷氨酰胺条件下培养的等量内皮细胞共孵育。(a) 明场和荧光代表性图像显示，与对照组（2.0 mM谷氨酰胺）相比，0.0 mM谷氨酰胺条件下培养的内皮单层对HL-60细胞的黏附能力有所增加。(b) 定量分析证实了这一现象，结果显示谷氨酰胺缺乏的内皮细胞结合的HL-60细胞数量比对照组高出2.6倍以上(*** (***p<0.001))。分组：2.0 mM和0.0 mM；每组独立实验重复N=4。Scale bar =700mu m

谷氨酰胺缺失降低斑马鱼异种移植中内皮细胞促进异位组织生长的能力

谷氨酰胺发挥着关键且多样的作用，它不仅为氨基酸和核苷酸的生物合成提供氮源，还为三羧酸循环补充以及脂质生物合成途径提供碳源。上述大部分数据均来自体外实验（图1-8）。鉴于斑马鱼与人类约70%的基因相同，且拥有相似的器官和生物系统，它们是研究相关生命活动的重要模型。本研究建立了一种可靠的体内模型，用于探究内皮细胞（EC）谷氨酰胺缺乏的生理相关性。为此，研究采用了斑马鱼异种移植实验（图9和图10），结果显示谷氨酰胺缺乏的Ea.hy926内皮细胞丧失了诱导宿主组织向外生长并伴随血管生成的能力。本研究检测了斑马鱼异种移植模型中移植谷氨酰胺缺乏内皮细胞与正常对照组内皮细胞的效果。受精后3小时（3 hpf）的卵用于显微注射，受精后6天（6 dpf）对这些异种移植胚胎进行成像（图9a）。异种移植胚胎中，任何外部向外生长的组织和细胞团块均被视为人类内皮细胞（红色荧光）或斑马鱼组织的诱导增殖（(Tg(f l i 1: e g f p)^{y 1})所示的血管组织呈绿色荧光，非血管组织无荧光）。异种移植实验结果表明，在2.0 mM谷氨酰胺中培养的正常内皮细胞形成类细胞团生长的胚胎数量，是谷氨酰胺缺乏（0.0 mM谷氨酰胺）组的五倍以上（图9b），这与谷氨酰胺作为血浆中含量最丰富的氨基酸，是快速增殖细胞在代谢应激条件下生长和存活所利用的已知营养物质这一观点一致。血管内皮生长因子等诱导因子可促进组织过度生长，这种生长可能是恶性的，也可能是良性的。在2.0 mM谷氨酰胺中培养的人类Ea.hy926内皮细胞能够在斑马鱼宿主体内增殖和迁移。为更清晰地展示细胞团形成及相关血管生成过程，图10以更高放大倍数呈现了同一胚胎。分析显示，将图10b下图的图像叠加后，红色荧光的Ea.hy926内皮细胞与斑马鱼血管组织（绿色荧光）可清晰区分且空间分离。实验表明，移植2.0 mM谷氨酰胺培养的正常内皮细胞的斑马鱼异种移植模型，能够诱导人类内皮细胞（红色荧光）和斑马鱼血管组织（绿色荧光）向外生长（图10a、b）。向外生长的组织内部可见内皮细胞形态发生过程，该组织主要由斑马鱼细胞构成，可能还包含迁移的人类内皮细胞（图10b）。对照组（2.0 mM谷氨酰胺）中，斑马鱼胚胎出现类细胞团结构的比例显著更高，而谷氨酰胺缺乏组（0.0 mM谷氨酰胺）的该比例相较于对照组降至19.8%（图9b）。这些发现表明，在谷氨酰胺缺乏条件下，内皮细胞的形态发生及诱导组织增殖的能力显著丧失。在2.0 mM和0.0 mM谷氨酰胺两种条件下，CM-DiI标记的内皮细胞发出的红色荧光均证实成功移植的人类内皮细胞存在于异种移植胚胎中。然而，0.0 mM谷氨酰胺条件下培养的内皮细胞诱导外部向外生长或细胞团形成的能力显著丧失。人类内皮细胞通过红色荧光鉴定，斑马鱼血管组织通过(Tg(f l i 1: e g f p)^{y 1})所示的绿色荧光显示，非血管组织无 detectable 荧光。值得注意的是，内皮细胞形态发生、向外生长和细胞团形成的诱导现象几乎仅出现在移植2.0 mM谷氨酰胺培养的内皮细胞的斑马鱼胚胎中。

体外实验中观察到，谷氨酰胺耗尽的内皮细胞丧失了形态发生特性，这些细胞无法形成管状结构（图6和图7）。相比之下，用2.0毫摩尔谷氨酰胺培养的对照组内皮细胞保留了形态发生潜能，表现出正常的细胞迁移和腔样结构形成。这种独特的血管形态发生模式与我们体内斑马鱼移植实验的结果一致。在对照组斑马鱼/内皮细胞异种移植物（2.0毫摩尔谷氨酰胺）中，头部区域后方可见内皮细胞形态发生和细胞团形成。然而，在移植了谷氨酰胺耗尽内皮细胞的斑马鱼/内皮细胞异种移植物中，这些过程均未出现。

图9. 维持在生理谷氨酰胺浓度下的内皮细胞促进斑马鱼胚胎中异种移植细胞团的形成增加。(a) 囊胚期移植先前在0.0 mM或2.0 mM谷氨酰胺条件下培养的内皮细胞的斑马鱼胚胎的代表性图像。接受在2.0 mM谷氨酰胺条件下培养的内皮细胞的胚胎在后脑区域频繁出现局部细胞团形成。白色箭头指示2.0 mM谷氨酰胺组中与异种移植物相关的异位绿色斑马鱼血管。(b) 对(a)中异种移植物的定量分析显示，与0.0 mM组相比，2.0 mM谷氨酰胺组中显示细胞团结构的胚胎数量增加了五倍以上，这代表极显著差异(*** (***p<0.001) )。组别：2.0 mM（独立实验重复 N=3，每组84个胚胎）和0.0 mM（N = 3，每组93个胚胎）。Scale bar =100 mu m

图10.显示细胞团形成的斑马鱼/内皮细胞异种移植。(a,b) 与图9a为同一6天受精后胚胎的代表性图像，该胚胎注射了维持在2.0毫摩尔谷氨酰胺浓度的内皮细胞，通过脊椎动物自动筛选技术VAST生物成像仪（联合生物计量学公司）及Metamorph软件（基础版，7.8.6.0版本）在明场和荧光通道下成像。(b) 明场图像的放大倍数是(a)中图像的两倍。明场图像（上图）中，箭头指示细胞团的位置。dsRed/明场叠加图像（中图）中，箭头指示CM-DiI标记的内皮异种移植细胞。GFP/dsRed/明场合成图像（下图）中，箭头标注了(Tg(f l i 1: e g f p)^{y 1})斑马鱼胚胎内的绿色斑马鱼血管。(b)中的头部区域叠加图显示，注射的内皮细胞向异位细胞团及胚胎其他区域迁移。三重叠加图像（细胞团内的下图）显示，该团块结构主要由斑马鱼细胞（非绿色荧光蛋白标记）构成，且可见迁移的人内皮细胞（dsRed标记）可能参与其中，同时提示存在与移植的内皮细胞组织相关的局部斑马血管生成。(b) Scale bar =100 mu m

讨论

谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸，在细胞代谢、增殖和存活过程中发挥关键作用。尽管它可由机体内源合成，但在生理应激或病理状态下，机体对其的需求往往超过供给，使其在特定情况下成为必需氨基酸。重要的是，谷氨酰胺缺乏与多种内皮功能障碍相关疾病的发病机制有关。周等人的研究表明，慢性谷氨酰胺缺乏会激活Akt-mTOR信号通路，通过溶酶体功能受损抑制自噬流，进而促进细胞功能障碍。同样，对果蝇的研究显示，谷氨酰胺缺乏会加速与细胞功能衰退相关的表型变化。在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中，已有研究在患者脑组织中发现谷氨酰胺缺乏的现象，而补充谷氨酰胺可减轻阿尔茨海默病小鼠模型的神经炎症，并延长共济失调毛细血管扩张突变基因缺陷小鼠的寿命。综上，这些研究结果凸显了谷氨酰胺的可获得性与内皮功能障碍之间新出现的关联。

图1至图4所示的结果表明，在谷氨酰胺缺乏的条件下，Ea.hy926内皮细胞的SA-β-半乳糖苷酶活性显著升高。我们针对Ea.hy926内皮细胞的研究结果与以往研究一致，这些研究证实，可通过细胞化学染色检测到溶酶体SA-β-半乳糖苷酶活性的升高，以此评估细胞功能障碍。当在pH值为6.0的含β-半乳糖苷底物的弱酸性溶液中进行染色时，该酶的积累量会达到可检测的、高于背景值的水平。在pH值6.0条件下检测SA-β-半乳糖苷酶活性，已被广泛用作与细胞功能障碍及衰老样表型相关的标志物。在某些情况下，内皮功能障碍与表型改变相关，其中包括衰老相关分泌表型的特征。SA-β-半乳糖苷酶的酶活性最初由朱迪思·坎皮西（Judith Campisi）发现，其最初是在皮肤成纤维细胞和表皮角质形成细胞中于pH值4.0条件下被观察到的。坎皮西还证实，在pH值6.0条件下也可检测到SA-β-半乳糖苷酶活性。此外，正常体细胞在经过有限次数的分裂后，会发生不可逆的生长停滞和功能状态转变。这一机制是一种肿瘤抑制策略，也是机体衰老的主要诱因之一。

本研究证实，即便是短期的谷氨酰胺缺失也足以诱导SA-β-半乳糖苷酶活性升高，斑马鱼异种移植模型中内皮细胞的增殖、细胞形态发生、细胞黏附以及促细胞生长活性等方面的其他缺陷也佐证了这一点。既往研究表明，补充谷氨酰胺可减轻氧化应激诱导的表型变化。细胞功能异常与特征性的形态改变（细胞体积增大、形态变扁）、抗凋亡能力、染色质重塑以及SA-β-半乳糖苷酶的表达相关。Dimri等人于1991年首次报道了在pH 6.0条件下检测SA-β-半乳糖苷酶活性的方法。人脐静脉内皮细胞是研究血管生物学、心血管疾病和血管生成的经典且广泛应用的内皮细胞模型。有研究指出，谷氨酰胺缺失可通过抑制细胞增殖和迁移，以及破坏三羧酸循环活性，严重损害人脐静脉内皮细胞的功能。与本研究结果一致，既往研究报道谷氨酰胺缺失7天后，人脐静脉内皮细胞的SA-β-半乳糖苷酶活性会升高。本研究结果与此前一项在人脐静脉内皮细胞传至40代后检测到SA-β-半乳糖苷酶活性升高的研究相符。与这些研究结果一致，本研究发现谷氨酰胺缺失条件下，SA-β-半乳糖苷酶活性呈剂量和时间依赖性升高。

谷氨酰胺对于细胞的持续增殖和功能维持不可或缺，而其缺乏会导致细胞生长停滞甚至死亡。尽管其具体机制尚未完全阐明，但已有研究表明谷氨酰胺可调控细胞周期进展，尤其是G1期到S期的转换以及有丝分裂的进入。本研究结果与相关文献一致，即谷氨酰胺可用于为嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成提供前体物质，而这些前体物质是能量载体、核酸以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和S-腺苷甲硫氨酸等核苷酸辅因子的关键组成部分。因此，谷氨酰胺可作为底物，在细胞增殖和细胞周期进程中为脱氧核糖核酸的合成提供支持。谷氨酰胺能够调节内皮细胞的一氧化氮生物合成、维持血管的完整性以及脑组织的正常功能。由于一氧化氮是内皮细胞中重要的舒张因子和信号分子，因此谷氨酰胺有望在调节心血管系统功能中发挥关键作用。Malakar等人报道，谷氨酰胺缺失24-48小时会显著降低永生化人宫颈癌HeLa细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞系的增殖能力。与之相符的是，本研究数据显示，内皮细胞经谷氨酰胺缺失处理5天或10天后，增殖能力明显下降，即便在增殖检测期间重新暴露于富含谷氨酰胺（2.0毫摩尔）的环境中48-96小时，增殖能力也未得到有效恢复。

除代谢作用外，谷氨酰胺还通过增强内皮功能、作为精氨酸前体促进一氧化氮合成以及发挥抗氧化和抗炎作用来促进心血管健康。补充谷氨酰胺与心血管危险因素的改善相关，包括脂质代谢、胰岛素敏感性、高血压和肥胖。相反，谷氨酰胺耗竭会导致内皮功能障碍和免疫失调，这两者都是心血管疾病的核心驱动因素。谷氨酰胺耗竭与免疫反应受损有关，因为谷氨酰胺是淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞的关键能量来源。未来的研究将探究免疫细胞中的谷氨酰胺耗竭是否会影响内皮细胞功能并导致心血管疾病。在我们的基质胶实验中，谷氨酰胺耗竭的内皮细胞在细胞形态发生方面表现出严重缺陷，表明血管生成能力受损，从而支持了功能异常的内皮细胞可能尤其易受心血管病理影响的观点。

新出现的证据也将谷氨酰胺耗竭与新冠病毒感染（COVID-19）中的内皮功能障碍联系起来。临床研究表明，新冠病毒感染患者的循环谷氨酰胺水平降低，且与疾病严重程度相关。这种缺乏可能损害免疫和内皮功能，进而引发炎症、凝血病和多器官衰竭。为佐证这一点，我们使用HL-60细胞系（一种可分化为单核细胞样细胞的早幼粒细胞白血病模型）进行的早幼粒细胞黏附实验显示，在谷氨酰胺耗竭条件下，早幼粒细胞对内皮细胞（EC）的黏附增加了两倍以上。这些结果与谷氨酰胺耗竭在重症新冠病毒感染中促进内皮炎症和功能障碍的报道一致。我们的研究结果与此前证据相符，即与早期传代的内皮细胞相比，晚期传代的内皮细胞以及从老年小鼠肺部分离的内皮细胞中细胞间黏附分子-1的表达发生了改变。这些发现支持了以下假设：细胞间黏附分子-1的激活和聚集改变可能会扰乱细胞间相互作用相关的信号通路，从而促进免疫细胞的黏附。

血管生成是一个高度受调控的过程，其依赖于内皮细胞代谢、细胞外基质相互作用以及生长因子信号传导。尽管葡萄糖代谢在此过程中已被长期研究，但谷氨酰胺代谢直到最近才被认为是关键因素。抑制谷氨酰胺酶1或耗尽谷氨酰胺会破坏内皮细胞的增殖和迁移，从而损害血管出芽。与以往研究一致，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的谷氨酰胺消耗量增加，而抑制谷氨酰胺酶会降低人脐静脉内皮细胞的增殖能力并诱导其SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性。在我们的研究斑马鱼异种移植模型中，在谷氨酰胺充足的条件（2.0 毫摩尔）下培养的内皮细胞表现出强劲的增殖、迁移能力以及向宿主组织的生长延伸，其中包括血管组织。相比之下，谷氨酰胺缺乏的内皮细胞无法诱导宿主组织的生长延伸，这反映出其生理状态受损。

美国食品药品监督管理局（FDA）2017年批准谷氨酰胺补充剂用于治疗镰状细胞病急性并发症，这进一步证实了我们的研究发现。在镰状细胞病中，谷氨酰胺补充剂可降低红细胞与内皮细胞的黏附能力，从而改善微血管功能。不同疾病模型中证据的一致性，凸显了谷氨酰胺在维持内皮完整性和预防功能障碍方面的核心作用。

使用内皮细胞系和斑马鱼模型开展的谷氨酰胺耗竭研究存在若干局限性，包括使用永生化细胞系、人工完全谷氨酰胺耗竭条件、物种特异性差异，以及发育阶段而非成年期的生理背景。这些因素限制了其与人类血管生物学的直接转化相关性。尽管如此，这些模型仍为揭示谷氨酰胺在内皮细胞存活、代谢稳态和功能完整性中的作用提供了重要见解，同时也增进了对与细胞退化及衰老相关血管功能障碍相关通路的理解。

结论

综上所述，本研究表明谷氨酰胺耗竭会严重损害Ea.hy926内皮细胞的功能，具体表现为斑马鱼/内皮细胞异种移植物中SA-β-半乳糖苷酶活性升高、细胞增殖能力下降、早幼粒细胞黏附增强、形态发生紊乱以及细胞团形成能力降低。这些研究结果凸显了谷氨酰胺在维持内皮细胞稳态和功能完整性方面的关键作用。观察到的这些变化进一步表明，在代谢应激条件下，谷氨酰胺的可利用性是决定内皮细胞功能的关键因素。鉴于血管病理生理学中内皮功能障碍、免疫失调和代谢失衡之间存在密切关联，调控谷氨酰胺代谢有望成为未来心血管研究的重要方向。综合来看，本研究数据证实谷氨酰胺代谢是内皮细胞功能的重要调控因子，也是维护血管健康的潜在治疗靶点。未来仍需开展进一步研究，以明确真实的细胞衰老机制并阐明其背后的作用原理。

材料与方法

细胞培养

Ea.hy926 人内皮细胞系最初由北卡罗来纳大学教堂山分校的科拉-琼·S·埃杰尔（Cora-Jean S. Edgell）博士构建并惠赠。L-谷氨酰胺（简称谷氨酰胺）是一种非必需氨基酸，性质不稳定。在液体培养基中，谷氨酰胺会发生自发的非酶促分解，产生氨和焦谷氨酸作为降解副产物。为避免这一情况，我们使用了杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s）采用粉末状的改良伊格尔培养基（DMEM，Corning 公司，货号 90-013-PB，美国纽约州），不含 L-谷氨酰胺，且根据实验要求，额外单独添加了 Glutamax（Gibco 公司，货号 35050-061，美国佛罗里达州迈阿密市）作为稳定的 L-谷氨酰胺替代物。因此，本研究全文中提及的 0.0 mM 或 2.0 mM 谷氨酰胺，均指添加至 DMEM 中的 L-谷氨酰胺替代物浓度。由于胎牛血清（FBS）中平均 L-谷氨酰胺浓度通常在 0.5 至 1.0 mM 之间，向 DMEM 中添加 10% FBS 会为培养基额外提供约 0.05–0.1 mM 的残留谷氨酰胺。该残留谷氨酰胺存在于所有实验条件下，包括添加了 2.0 mM、1.0 mM、0.3 mM 和 0.0 mM L-谷氨酰胺替代物（GlutaMAX，Gibco 公司，美国佛罗里达州迈阿密市）的培养基组。配置好的培养基搭配 10% 胎牛血清（FBS，Gemini Bioproducts 公司，货号 900-108，美国加利福尼亚州西萨克拉门托市）和 2% 青霉素-链霉素（MP Biomedicals 公司，货号 1670049，美国加利福尼亚州欧文市），用于内皮细胞（EC）的培养。本研究未进行支原体检测，但本研究使用的 Ea.hy926 内皮细胞未表现出任何支原体污染的迹象。在 2 mM 谷氨酰胺对照条件下培养的细胞展现出正常的增殖能力和活性。此外，在细胞增殖实验中进行的赫斯特（Hoechst）和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色结果显示，细胞表面未检测到可察觉的核外、丝状或颗粒状 DNA 结构，而这类结构可能是支原体污染的信号。

SA-β-Gal测定

将解离（使用 Accutase，购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的 Invitrogen 公司）后的细胞进行计数，随后在每块经细胞培养处理的60毫米培养板中接种(6 ×10^{5})个细胞。将细胞在各自的培养基中培养过夜以使其重新贴壁。次日，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）洗涤细胞，并用4%多聚甲醛在室温下固定5分钟。固定后的细胞再次用磷酸盐缓冲液（先使用pH 7.0的PBS，随后使用pH 6.0的PBS）洗涤，向每块培养板中加入2毫升过滤后的染色液。1×SA-β-半乳糖苷酶染色液的成分为：在密理博（Millipore）体系中，包含40毫摩尔柠檬酸/磷酸钠溶液（pH 6.0）、150毫摩尔氯化钠、2毫摩尔氯化镁、1毫克/毫升5-溴-4-氯-β-D-半乳糖吡喃糖苷溶液、5毫摩尔铁氰化钾以及5毫摩尔亚铁氰化钾。去离子水。将细胞置于染色液中，在37摄氏度下孵育6至7小时并进行监测用于使蓝色显色。反应最终通过用去离子水替换染色溶液来终止。将细胞置于去离子水中以进行成像。染色后的细胞在配备有尼康相机（DS-Fi3）（美国纽约州梅尔维尔市尼康公司）的尼康体视显微镜（SMZ1500）下进行成像。成像使用的是NIS-Elements D 5.30.01 64位软件。每个实验中的所有图像均采用相同的曝光参数拍摄，并在ImageJ（1.52e版本）中对所有实验组使用相同的阈值设置进行分析。如图例所述，采用统一的阈值范围（0–110）来识别和定量SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞（以红色高亮显示）。

内皮细胞增殖检测

将来自 2.0 mM 或 0.0 mM 谷氨酰胺培养体系的内皮细胞以每孔 10,000 个的总量预铺板过夜，接种至 96 孔板中。次日（第 0 天），增殖实验开始时，将培养基更换为含 2.0 mM 谷氨酰胺的完全 DMEM 培养基。从第 0 天开始，随后在第 2 天和第 4 天，用 Accutase（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）从 96 孔板中消化并收集内皮细胞样本，用于 DAPI（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）/Hoechst（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）染色。染色后的细胞重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，转移至黑壁 96 孔板，随后使用 ImageXpress Pico（美国加利福尼亚州圣何塞市美谷分子仪器公司）进行细胞计数。将板以 500 转/分钟（50 ×g）离心 2 分钟，使悬浮细胞沉至孔底。使用 ImageXpress 软件的“细胞计数”功能，结合明场和 DAPI 荧光设置已完成。放入 ImageXpress 成像系统内后，按照制造商说明书的要求，在选定的细胞大小范围内对 DAPI/霍赫斯特荧光标记的内皮细胞进行细胞计数。对计数得到的细胞进行分析，并为每组的内皮细胞总数绘制图表。

基质胶形态发生实验

将24孔板和Matrigel基质胶（货号BD#354234，购自美国加利福尼亚州圣何塞市BD生物科学公司）的分装样品在4℃冰上放置48小时后再进行铺板操作。铺板前一天，使用预冷的移液器吸头向每孔中加入150微升Matrigel基质胶。将经Accutase酶消化解离的细胞进行计数，随后向每孔中已铺有Matrigel基质胶的表面接种(3 ×10^{5})个细胞（体积为200微升）。次日，细胞形成管状结构，使用尼康体视显微镜、尼康相机以及NIS-Elements D 5.30.01 64位软件（美国纽约州梅尔维尔市尼康公司）对管状结构进行成像观察。

内皮细胞-HL-60细胞黏附实验

内皮细胞（EC）首先在添加了2.0毫摩尔谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养两周。随后，一组内皮细胞继续在含2.0毫摩尔谷氨酰胺的培养基中培养一个月，作为对照组。另一组内皮细胞则在无谷氨酰胺培养基（0.0毫摩尔谷氨酰胺）中继续培养一个月。

在与人早幼粒细胞系HL-60进行共培养实验时，在加入HL-60细胞前一天，将等量的对照组内皮细胞（ECs）和谷氨酰胺缺失的内皮细胞接种至96孔板中。共培养前，让内皮细胞过夜贴壁。通过预实验确定各处理组的细胞接种密度，以确保洗涤后每孔约保留(4 ×10^{4}-4.5 ×10^{4} ECs)个细胞。每个处理条件均设置六个生物学重复。次日，用伊斯科夫改良杜氏贝科培养基（IMDM，Gibco公司，美国佛罗里达州迈阿密市）（含20%胎牛血清）培养的生长状态良好的HL-60细胞，用Vybrant氯甲基-1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳菁碘化物（CM-DiI）（Invitrogen公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）（dsRed荧光）染料（培养基中浓度为5微摩尔，不含胎牛血清）进行标记。标记过程在含5%二氧化碳的培养箱中进行1小时。将细胞上的染料洗涤干净后，向每块含内皮细胞的96孔板中加入(1.5 ×10^{4})个染色后的HL-60细胞。共培养3小时后，用400微升培养基缓慢吸移，小心洗涤细胞两次。使用图像细胞计数仪（ImageXpress Pico，Molecular Devices公司，美国加利福尼亚州圣何塞市）对染色后的HL-60细胞进行计数。

内皮细胞向斑马鱼胚胎的移植

斑马鱼（斑马 Danio  rerio）种群饲养于 zRack 独立系统（美国加利福尼亚州圣马科斯市 Aquaneering 公司），饲养环境采用14小时光照、10小时黑暗的循环周期。斑马鱼AB野生型以及转基因品系(Tg(f i i 1: e g f p)^{y 1})已有相关文献报道。本研究选用经鉴定为杂合杂交AB野生型的成年斑马鱼携带者(Tg(f l i 1: e g f p)^{y 1})，胚胎的分期与培养均参照标准流程执行。所有实验方案与操作流程均获北卡罗来纳中央大学（北卡罗来纳州达勒姆市）动物护理与使用委员会批准（北卡罗来纳中央大学机构动物护理与使用委员会协议编号：TCL-07-14-2008）。依据北卡罗来纳中央大学机构动物护理与使用委员会的指导原则，采用4毫克/毫升的三卡因（MS222）对斑马鱼胚胎实施安乐死，以减轻其痛苦。斑马鱼胚胎的发育阶段以受精后小时数（hpf）或受精后天数（dpf）划分，在28.5摄氏度、昼夜周期为10小时/14小时的标准条件下培养。斑马鱼鱼卵在28.5摄氏度的0.3倍丹氏溶液（19.3毫摩尔/升氯化钠、0.23毫摩尔/升氯化钾、0.13毫摩尔/升硫酸镁、0.2毫摩尔/升硝酸钙、1.7毫摩尔/升4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸，pH值7.0）、受精后3小时（hpf）的条件下，将鱼卵排列在琼脂平板上进行显微注射。移植实验前一天，用5微摩尔的CM-DiI细胞示踪染料对细胞进行标记。每个鱼卵的注射体积和细胞悬液均校准为200-300个细胞/注射。移植后，鱼卵在0.3倍达诺氏液（Danieau’s solution）中培养至受精后8小时（hpf），随后更换为含1倍1-苯基-2-硫脲（30微克/毫升）的0.3倍达诺氏液，以抑制色素沉着的发育。受精后24小时（hpf），用150毫克/毫升的胰蛋白酶（Sigma公司，美国密苏里州圣路易斯市）对斑马鱼胚胎进行脱膜处理1小时，之后将胚胎保存在0.003%的苯硫脲中备用。受精后6天（dpf），使用配备有脊椎动物自动筛选技术（VAST BioImager，Union Biometrica公司，美国马萨诸塞州霍利斯顿市）的奥林巴斯MVX10体视显微镜（Olympus公司，美国宾夕法尼亚州中心谷市）对斑马鱼胚胎进行分析。

统计分析

采用单因素方差分析（One-way ANOVA）来判断三个及以上独立组之间是否存在显著差异。当方差分析显示存在显著效应时，随后进行Student's t检验，以确定组间特定的成对差异。数据以每次实验中生物学重复的平均值±标准误（SEM）表示。结果经两次独立实验重复验证。若计算得到的双尾 (p)、*p<0.05、**p<0.01 及 ***p<0.001 值满足相应标准，观察到的差异被视为显著。