题目：Towards modelling mental disorders in zebrafish. Neurexins severely modulate anxiety, affiliative social behaviour and aggression

原文链接：Molecular Psychiatry; https://doi.org/10.1038/s41380-026-03721-1

期刊：Molecular Psychiatry

摘要

神经连接蛋白（neurexin，简称 nrxn）基因编码突触细胞黏附分子，这类分子反复被证实与神经发育及精神疾病相关。斑马鱼动物模型在解析神经发育/功能方面具有显著优势，但目前尚无 nrxn 基因完全功能缺失（LOF）的斑马鱼模型。本研究首次构建了针对每个 nrxn 基因的斑马鱼敲除品系，突变类型涵盖跨膜结构域缺失至全基因组位点缺失。令人意外的是，所有纯合子品系均正常发育，未出现明显的神经发育缺陷或早期行为异常。然而，早期表型的缺失并未阻碍其在发育后期出现显著的旁系特异性行为改变。所有神经连接蛋白敲除品系均会影响交配行为，这使得纯合子品系的培育与维持变得困难。除这一共同行为改变外，仅 nrxn1 基因缺失会导致亲和社交行为与攻击性发生显著变化，而 nrxn2、nrxn3 基因缺失则无此效应。相反，nrxn2 突变体表现出严重的焦虑样行为，包括偏好底层栖息、反复僵滞及癫痫样发作。值得注意的是，nrxn1 全基因位点缺失突变体则表现出相反的行为特征，大部分时间都停留在水体表层。二者在开放/封闭环境转换实验中也呈现相反的反应：封闭环境可缓解 nrxn2 突变体的焦虑，却会增强 nrxn1 突变体的表层栖息倾向。而 nrxn3 突变体在所有初始测试中均表现正常。综上，本研究构建了覆盖整个 nrxn 基因家族的完整斑马鱼突变体库，这些突变体虽无明显的早期发育缺陷，却在成年期表现出显著的行为改变，这与精神分裂症等人类精神疾病的迟发发病特征相呼应。本研究证实了斑马鱼在精神疾病研究中的应用价值，并为揭示神经连接蛋白的致病作用以及驱动精神疾病发生的潜在神经发育细微变化与时间机制提供了全新的研究平台。

引言

人类中的神经毒素蛋白基因NRXN1、NRXN2和NRXN3编码跨膜细胞黏附分子，这些分子对于突触的形成、维持和信号传导至关重要。这些基因反复与多种精神疾病和神经发育障碍相关，如精神分裂症（SCZ）、孤独症（ASD）、双相情感障碍（BD），甚至近年来还与帕金森病（PD）存在关联。在过去二十年中，研究人员构建了大量啮齿动物模型，这些模型为深入了解这一复杂基因家族的生物学特性提供了重要见解。尽管付出了巨大努力，但其致病作用以及与上述疾病的关联仍不明确。因此，拓展研究工具以增强我们探究这些基因的能力依旧十分关键。令人意外的是，尽管斑马鱼已成为研究这些基因功能的优选模型，尤其是在探究其在发育大脑中的作用方面，但目前仍缺乏用于研究的完全功能丧失（LOF）模型。

事实上，作为啮齿类动物研究的补充，斑马鱼为研究神经发育提供了一套独特的工具，为药物发现提供了更大的多样性。它们还具有体外发育能力，且光学透明度极高，即便在发育极早期也能直接观察和操作其脑部。此外，光遗传学和钙成像技术在该生物体内的应用，为深入研究这一基因家族在发育中和成熟大脑中的正常及致病作用提供了独特方法。尽管具备这些显著优势，目前尚无完整的功能缺失型斑马鱼神经毒素模型可供研究。这种小动物拥有高度保守的神经毒素同源基因，这些基因经祖先复制形成——神经毒素1（nrxn1a和nrxn1b）、神经毒素2（nrxn2a和nrxn2b）以及神经毒素3（nrxn3a和nrxn3b）[10]。虽然已有两项斑马鱼研究对单个神经毒素基因进行了探究，但这些模型通过传统的小片段插入缺失技术靶向有限的基因组区域，无法消除神经毒素同工型的全部类型。

事实上，由于存在多个启动子以及复杂且目前仍知之甚少的机制，这些基因会被转录成数百种异构体。可变剪接。这种复杂性使得获得稳定的功能丧失突变颇具挑战。传统的小插入缺失突变会产生提前终止密码子和截短蛋白，这类突变极易通过从头剪接和/或隐蔽剪接发生遗传补偿。且不说遗传补偿效应，由于存在多种启动子，会产生多种α长亚型和β短亚型，因此无法一次性靶向所有亚型。斑马鱼相关研究的实例就体现了这些问题：现有研究仅制备了影响长α亚型的突变体，而β亚型保持完整。Koh等人还发现，其引入的插入缺失突变激活了隐蔽剪接位点，导致携带突变的外显子大部分被剔除——这证实了复杂可变剪接的存在，而该现象会增加研究这些基因功能的难度。尽管异常剪接和补偿机制可能参与疾病发生发展，值得进一步研究，但本研究首先旨在构建一系列稳定的斑马鱼基因敲除品系，确保其相关基因/蛋白功能被有效敲除；随后进一步评估这些敲除品系对斑马鱼发育和行为的影响，为未来开展机制研究和复杂遗传分析奠定坚实基础。

本研究采用创新的CRISPR/Cas9策略，构建了覆盖神经毒素基因家族全部成员的完整斑马鱼突变体文库，并对每一条纯合突变体品系从胚胎期到成体期开展了首次系统性的表型分析对比。研究发现，这些基因的缺失不会显著影响斑马鱼的早期发育过程或基础运动功能，但会导致成体阶段出现显著且因旁系同源基因而异的行为改变。鉴于大多数精神健康疾病（如精神分裂症）在发病时无明显可检测的发育或解剖/结构异常，而普遍被认为起源于神经发育过程，本研究数据表明，斑马鱼可作为一种有价值的模型，用于探究症状出现前发挥作用的致病机制。此外，本研究也验证了斑马鱼是揭示神经毒素在大脑发育和功能中复杂作用的有力工具。

结果

斑马鱼神经毒素（nrxn）突变体的构建

为构建LOF型斑马鱼nrxn突变体，我们采用了实验室先前建立的CRISPR/Cas9技术方法，以实现全基因组靶向大片段缺失的制备。我们将该方法应用于所有斑马鱼nrxn基因，包括nrxn1a、nrxn1b、nrxn2a、nrxn2b、nrxn3a和nrxn3b，并建立了双突变体品系用于表型研究。我们对已发表的技术/方法进行了小幅优化，仅使用四条向导RNA（例如，去除了用于作为筛选标记的酪氨酸酶基因靶向第五条向导RNA）；如图1A所示，在目标缺失区域的两侧各放置两条向导RNA。为避免通过可变剪接产生的遗传补偿效应，同时实现对这些基因组位点非编码区的研究，我们计划删除：i）整个基因组区域（包含所有内含子，本研究中此类缺失命名为“full”），或ii）每个跨膜区（位于各基因的最后一个外显子上；此类缺失命名为“tmr”）。对于nrxn1，我们还额外构建了一条缺失/突变品系，其缺失范围从α亚型启动子延伸至第7外显子（命名为“part”），该区域不与短亚型nrxn1-异构体（nrxn1a-β和nrxn1b-β）相关的基因组区域重叠。这些缺失的详细信息如图1B所示，相应的注释序列见补充文件S1，所有向导RNA和基因分型引物列于补充表S1和补充表S2。筛选/分离得到这些不同突变体后，我们致力于建立稳定的品系，以在双突变背景下独立研究每种神经毒素蛋白，本研究中命名为nrnx1a1b、nrxn2a2b和nrxn3a3b（总结于图1C）。如下文所述，所有这些突变体且双突变体均具有生活力。所构建的所有单突变体和双突变体的精子均已冷冻保存，可按需获取。RNA测序分析证实了这些突变的预期分子效应（图1D-F，补充文件S3）。完整的基因组缺失导致相应转录本显著减少或缺失，而跨膜结构域突变不影响转录本水平，这与其设计目的一致，即这些突变旨在破坏蛋白定位而不改变基因表达。同样，除了双突变体(n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m s})中nrxn1b和nrxn3a (full 3 b^{full })的表达略有升高外，所有突变均未引发神经毒素旁系同源基因间的转录组补偿迹象；鉴于其相对于其他神经毒素的基线表达水平极低，这一结果需谨慎解读。

图1 六种斑马鱼神经连接蛋白基因突变的示意图、细节及转录组学影响。A，斑马鱼神经连接蛋白基因座的基因组结构示意图，显示了本研究中用于产生突变/缺失的CRISPR/Cas9单导向RNA（sgRNA；箭头）的相对位置。灰色箭头指示用于不同突变株系筛选和维持的基因分型引物的大致位置。对于大片段缺失，纯合突变体的鉴定需要两组引物，组合方式见下图。B，所产生的不同神经连接蛋白等位基因/突变体的汇总，包括相应的i）所用sgRNA（补充表S1）、ii）用于鉴定和维持的基因分型引物对（补充表S2）以及iii）基因组缺失大小。C，本手稿中用于标注每个实验中分析的双突变体株系的命名（株系名称）。D-F，RNA测序表达分析，其中D为各神经连接蛋白基因在各条件组的平均标准化读段数，E-F为仅与α亚型相关的编码外显子（E）或(alpha-)与β亚型共有的编码外显子的平均读段数，如左图所示（基因组坐标见补充表S3）。柱形代表组均值；误差棒表示均值±标准差。对每个目标基因或区域，采用Welch t检验将突变株系与野生型进行比较。完整的统计结果（包括所有比较的P值）见补充文件S3。

神经黏连蛋白对斑马鱼胚胎和幼鱼的早期发育无显著影响

在成功构建双突变体品系后，我们开展了对比表型分析。出乎意料的是，在胚胎期和幼体阶段，所有突变体在初步对比测试中均未表现出明显表型。突变体动物的孵化与发育过程与野生型对照无显著差异（图2A、B）。野生型对照动物的体长从受精后3天（dpf）的3209微米（±66.86微米）增长至受精后7天的3877微米（±136.1微米），各时间点组间均无统计学差异（图2A，详细统计数据见补充文件S3）。所有测试的鱼卵均在受精后3天完成孵化，且生长过程中未观察到形态学缺陷（图2B）。受精后2天，所有突变体动物对触碰均有反应，其游泳反应/模式与对照组无差异，提示胚胎期大脑或外周神经系统发育未出现可检测的延迟或缺陷（图2C）。我们进一步利用斑马鱼行为分析平台（Zebrabox Revolution）及一系列刺激手段，对突变体受精后7天内的行为进行了分析（图2D及补充图S1）。所有实验均未发现突变体自发行为或对刺激的反应出现显著变化。图2D总结了7种双突变体品系在经历包含明暗交替、振动/声音及光照胁迫的24分钟刺激方案后的行为特征。所有突变体的游泳模式与反应强度均与对照组相当，表明其行为或神经功能未出现早期明显异常。最后，我们对突变体受精后2至7天的脑部发育进行了监测，未观察到整体结构、大小或发育时序的差异（图2E、图3）。这一结果证实，在缺乏神经粘连蛋白的情况下，胚胎期至幼体期的神经系统发育基本正常进行。

图2 神经连接蛋白基因nrxn1、nrxn2和nrxn3对斑马鱼整体发育及早期游泳行为并非必需。A，上图为不同神经连接蛋白突变型斑马鱼与野生型对照在2天胚胎期（dpf）至7天胚胎期的代表性侧面观；下图为3、5和7天胚胎期的体长测量结果，显示与野生型对照无差异（每组n=(= 30)）；(Scale bar =500 mu m.)。B，24小时胚胎期（hpf）至96小时胚胎期神经连接蛋白突变型与野生型幼鱼的孵化率（%）（每组n=(n ≈300)）。C，不同神经连接蛋白突变型与野生型对照的触碰诱发反应评分（左图）及游泳反应（右图）（每组n=(n=30)）。D，32分钟记录期间的游泳行为分析及平均游动距离，包含明暗交替刺激与声振刺激；实验分别在6和7天胚胎期进行。个体游动轨迹见补充图S1。所有测试品系的总游动距离均无统计学差异（每组n=(n=36)）。E，实时脑部发育及体积分析显示各组间无统计学差异。上图为2至7天胚胎期的脑部体积监测，下图为3、5、7天胚胎期脑部标志点间距离（眼间距/视顶盖/脑干）的定量分析（每种基因型n=(= 3)）。比例尺=100微米。所有突变品系与对照组的比较采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn多重比较检验。（ns，无显著性差异）。

图3 神经连接蛋白1（nrxn1）、神经连接蛋白2（nrxn2）和神经连接蛋白3（nrxn3）对斑马鱼整体大脑和神经系统的发育并非必需。在转基因对照（CTR；tg(huc:Kaede)）与转基因tg(huc:Kaede)背景下不同神经连接蛋白突变体的大脑共聚焦扫描图像。转基因tg(huc:Kaede)可在整个神经系统中驱动荧光蛋白KAEDE的表达。共聚焦显微照片（最大强度z轴堆叠投影）展示了从受精后2天至7天（dpf）每日采集的完整大脑背侧视图，清晰呈现了各基因型斑马鱼大脑的渐进式发育过程，且未发现明显的结构异常。(Scale bar =100 mu m)

无明显早期缺陷却表现出显著的成年行为改变

虽然在早期阶段未检测到明显的行为或发育缺陷，但在生命后期出现了显著的行为改变。尽管所有突变都影响了交配行为，使得胚胎的维持和产生具有挑战性，但我们观察到了明确的旁系同源物特异性表型。这首先在设施本身中就很明显，其中 (n r ×n 2 a^{full } 2 b^{full }) 和 (n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m s}) 突变体表现出几乎永久的底栖行为，整天都待在水箱底部，即使在喂食过程中也是如此（补充视频S1）。这些显著差异促使我们使用一系列测试进行系统的行为评估，包括新水箱潜水、游泳耐力、社交偏好、镜咬和集群分析（开放与封闭场地），具体内容如下及图4至图6所示。

nrxn2基因缺失引发显著的焦虑样行为

观察到(n r x n 2 a^{full } 2 b^{full })和(n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m r})突变体在设施内始终表现出底栖行为后，我们研究人员让斑马鱼接受了一种新型的水箱潜水测试，这是评估斑马鱼类焦虑行为的经典检测方法。在该实验范式中，将斑马鱼放入全新环境后，其游至水箱上部的潜伏期被认为与焦虑程度呈负相关——例如，动物停留的时间越长位置越靠下，焦虑水平越高。野生型对照组平均在23.16±8.8秒内到达顶部区域，而(n r x n 2 a^{full } 2 b^{full })和(n r ×n 2 a^{t m r} 2 b^{t m s})突变体的潜伏期显著延长，到达顶部区域的平均时间为314.4±8.8秒（Mann-Whitney检验，(U=1) (p<0.0001) 1）以及 580.1 ± 66.8 秒（对应 (U=0)、(p<0.0001)）（图 4A-B）。值得注意的是，37.5% 的 (nrxn2a2b ^{t m r}) 突变体从未游至上层区域，在整个实验过程中仅停留在底部，这表明斑马鱼出现了严重的焦虑样状态。

与这些发现一致，对三个区域的垂直分布及区域间转换次数的分析显示，与对照组相比，实验组的探索行为显著减少（图4C-D）。关于垂直分布，统计分析证实了其行为发生显著变化（ART方差分析，基因型×区域交互作用：(n r x n 2 a^{full } 2 b^{full }) (F(2,60)=287.35)、(p<0.0001)；(n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m r}) F(2,60)=347.12，(p<0.0001)）；野生型鱼类在实验中累计有28.6±2.3%的时间处于下层区域，而(n ×n 2 a^{full } 2 b^{full })和(n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m r})突变体则几乎完全停留在底部，分别累计有78±2.4%和92±2.4%的实验时间处于下层区域（事后检验(p<0.0001)，图4C）。实验不仅显示突变体具有底栖习性，还表明其探索行为明显减少：野生型鱼类在实验期间累计在各区域间进行了421±45次转换，而(n r x n 2 a^{full } 2 b^{full })突变体仅进行了192±25次转换（Mann-Whitney检验，(U=36.5) (p=0.0003)），(n r ×n 2 a^{t m r} 2 b^{t m r})突变体则极少离开底部区域，整个实验过程中仅进行了43±15次区域转换（(U=2) (p<0.0001)）（图4D）。

图 4 神经突触黏附蛋白（Neurexin）可显著改变成年斑马鱼行为，且不同旁系同源基因缺失会引发特异性行为表型。新型鱼缸潜水实验结果证实：敲除nrxn2会诱发强烈的焦虑样表型，特征为持续停留在缸底游动并伴随反复僵直行为；而完全敲除nrxn1基因座则会造成异常偏好水面游动的行为。

nrxn2基因的缺失会引发强烈且反复的僵住/癫痫发作，但不会影响游泳能力

除了深度底栖且活动探索减少外，(n r x n 2 a^{full } 2 b^{full })和(nrxn 2 a^{t m r} 2 bar{b}^{t m s})还表现出重复性且强烈的僵滞行为，这种行为之后常伴随一阵无规律的过度活跃/游动，这一现象在行为学检测和实验室常规观察中均有观察到（图4E-F，补充视频S2/S3）。在新型 tank 潜水测试中，(n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m r})的僵滞行为平均占实验时间的43±8%，与野生型相比显著更高（Mann-Whitney检验，(U=8.5)、(p<0.0001)）。相比之下，(n r x n 2 a^{full } 2 b^{full })的僵滞行为仅占实验时间的11±4%，受影响程度低于(n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m r})（(U=25.5)、(p<0.0001)）。对(n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m r})突变体在新型tank潜水测试中的僵滞事件进一步分析发现，存在两种类型的事件：一类是僵滞期后恢复正常游动（动物通常停留在tank底部），另一类是僵滞后立即出现无规律的过度活跃爆发。对(n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m r})的新型tank潜水记录进行定量分析显示，每次检测平均出现4±0.6次僵滞事件，其中20.8±7.7%的事件后立即伴随高速无规律活动爆发（图S3A-C，补充视频S3）。这种僵滞-爆发序列与斑马鱼网络过度兴奋模型中描述的癫痫样行为相似[30,32]。为进一步从药理学角度探究网络兴奋性，我们将鱼暴露于(GABA)受体拮抗剂戊四氮（PTZ）中。(n r x n 2 a^{t m r} 2 b^{t m r})对PTZ表现出显著的超敏性，在暴露于1mM浓度时，其易感性较野生型对照组显著升高PTZ（图S3D-G）。尽管需要电生理和/或钙成像实验来正式证实这些事件的癫痫样性质，但这些结果与网络兴奋性增加和癫痫易感性升高一致。此外，nrxn2a2b突变体以及所有nrxn1a1b突变体（而非nrxn3a3b突变体）在这些新水箱潜水实验中，总游动距离和平均游泳速度均显著降低（图4G和H）。这些数值是在排除静止期后计算得出的，以避免偏差。为了确定这些降低是否反映了神经肌肉/健康状况受损而非行为改变，我们使用Loligo®游泳隧道对不同品系进行了耐力测试，在测试中让动物逐渐承受递增的水流。如图5A所示，突变体和野生型（wt）动物对递增水流的耐受性相当，表明其力量和耐力保持完好，这说明观察到的游动距离缩短和速度降低主要源于行为改变，而非运动功能缺陷。

nrxn1基因缺失会导致斑马鱼出现异常的底栖行为，同时探索行为减少

与nrxn2a2b不同，nrxn1a1b突变体未表现出强烈的焦虑表型，而是在社交亲和行为和攻击性方面表现出明显的缺陷/变化（见下文及图5）。在介绍这些新的检测/表型之前，值得强调的是，在新型潜水测试中，所有nrxn1a1b突变体进入顶部区域的潜伏期均未出现显著变化（图4A和B——结论为无明显焦虑）。然而，(n ×n 1 a^{full } 1 b^{full }) 突变体表现出显著的顶部区域游泳行为/偏好（图4C），同时向中部和底部区域的探索/转移次数减少，总游动距离也更短（图4D、G、H，补充视频S2）。据我们所知，这种明显的顶部区域偏好、探索行为减少以及游动距离/速度降低的组合此前尚未有报道，这表明该突变体的行为发生了深刻且可能复杂的改变。有趣的是，尽管(nrxn1a a^{part } 1 b)、(part)和(n r x n 1 a^{t m r} 1 b^{t m r})突变体在新型水箱潜水测试中未表现出这种显著的顶部区域偏好，但它们在下文所述的封闭场测试中表现出类似的明显的表层栖息行为（图6）。

nrxn1基因缺失会调控社交偏好与攻击性

除了在水面活动的行为特征外，所有 nrxn1a1b 突变体均出现了社交亲和行为和攻击性的显著变化（图 5B-E、补充视频 S4 及补充视频 S4）。为评估社交偏好，我们采用三室实验水箱，其中两个侧边小隔间通过透明玻璃与中央区域分隔开。一个侧边隔间内放置一群同种个体，而对面的隔间则保持空置。将实验鱼放入中央区域，分析其空间分布以量化社交偏好/行为。如图 5B、5C 所示：野生型对照组鱼类有 77±4% 的实验时长停留在同类鱼周边；而nrxn1a^full1b^full、nrxn1a^part1b^part、nrxn1a^tmr1b^tmr 三种突变体均表现出显著的社交回避行为，它们停留在同类附近的时长占比分别仅为 30±3.4%、49±3.5%、43±3.8%（曼 - 惠特尼检验，对应统计量 U 依次为 0、25、12，所有组别 p＜0.0001）。研究采用镜像撕咬实验评估攻击行为（图 5D、5E）：野生型斑马鱼平均有 48±3.7% 的时间待在距离镜面 3 厘米范围内；与之相反，所有 nrxn1a1b 突变体在该区域停留的时间均出现显著下降。突变体与镜面发生互动的时长占比显著降低：nrxn1a^full1b^full 品系仅 29±3.7%（曼 - 惠特尼检验，U=50，p=0.0046）；nrxn1a^part1b^part 品系为 36±2%（U=84，p=0.0226）；nrxn1a^tmr1b^tmr 品系为 40±1.9%（U=66，p=0.0265）。为进一步佐证上述实验结果，本研究对nrxn1a^full1b^full 突变体开展了配对打斗实验（参考文献 33）。补充图 S4 结果显示，配对打斗实验印证了镜像撕咬实验的结论：突变体的直接攻击行为大幅减少。野生型对照组斑马鱼平均每分钟撕咬 16±3 次，而突变体仅为 2±1 次（U=0，p=0.0286）。值得注意的是，镜像撕咬实验同样发现nrxn2a^tmr2b^tmr 突变体的社交偏好与攻击行为存在显著异常；但该品系在实验过程中频繁出现僵直、类癫痫发作行为，会干扰实验结果，因此解读该组数据的统计学差异时需谨慎。

图5 nrxn1基因调控斑马鱼的亲和性社交行为和攻击性。A，游泳耐力检测，以力竭所需时间表示行为表现；B–C，社会偏好检测：B，社会偏好检测/装置示意图，以及野生型鱼与七种神经连素突变品系鱼在10分钟记录期间的代表性游泳轨迹；C，受试鱼在社交区域停留时间所占百分比的定量分析。D–E，镜像攻击检测：D，镜像攻击检测/装置示意图，以及野生型鱼与不同神经连素品系鱼在10分钟检测期间的代表性游泳轨迹；E，鱼在镜像区域停留时间所占百分比。数据以均值±标准误（SEM）表示。野生型与突变型之间的比较采用双尾Mann-Whitney检验。针对每种行为表型中七种突变品系的多重检验，采用错误发现率（FDR）校正（*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001）。

nrxn1 与 nrxn2 突变体在开阔场实验和封闭场实验中表现出截然相反的行为应答

在完成单条斑马鱼的初步行为学分析后，研究人员进一步利用开阔场、封闭场两套装置分析鱼群的集群分布，以此评估群体层面的行为特征。本部分实验的核心目的，是验证日常饲养过程中观察到的现象：nrxn2a2b突变体平时会一直停留在缸底，但当置于有遮挡、具备庇护感的环境中时，便会主动探索鱼缸；这与它们放置在开放式操作台、饲养架上完全暴露时始终沉底的行为形成鲜明反差。本实验中，开阔场与封闭场条件使用相同的测试鱼缸，二者核心区别为：封闭场装置会将鱼缸完全包裹遮挡，为斑马鱼提供庇护，隔绝外界视觉刺激（图 6B）；而开阔场装置不做任何遮盖，实验鱼完全暴露于外部环境中。每组放入 10 条斑马鱼，持续记录鱼群随时间的空间分布情况，结果如图 6 所示。实验结果与日常饲养观察、新型鱼缸潜水实验结论一致：所有nrxn2a2b突变体在开阔场环境下均表现出强烈且持续的沉底行为。整个实验周期内，nrxn2a^full2b^full、*nrxn2a^tmr2b^tmr* 鱼群停留在缸底的平均占比分别达到 80±4%、99±0.3%，而野生型对照组仅为 17±6%（图 6K-N）。该差异具有极高统计学显著性（对齐秩变换方差分析，基因型 × 区域交互作用：*nrxn2a^full2b^full* 组 F (2,12)=59.071p＜0.0001*nrxn2a^tmr2b^tmr* 组 F (2,12)=99.989，p＜0.0001），事后两两比较证实两种突变品系停留在缸底的比例均显著高于野生型（p＜0.0001）。切换至封闭场环境后，实验现象印证了前期观察：*nrxn2a^full2b^full* 突变体的行为与野生型无差异，鱼群在各水域分区的分布比例和对照组完全一致（图 6L）。*nrxn2a^tmr2b^tmr* 突变体虽仍与野生型存在统计学差异（对齐秩变换方差分析，基因型 × 区域交互作用：F (2,12)=18.253，p=0.0002），但行为得到明显改善：停留在缸底的鱼群占比从开阔场下的 99±0.3% 下降至封闭场中的 68±5.5%。

与之相反，转入遮蔽式封闭环境对野生型斑马鱼与nrxn3a3b突变体的行为无任何影响（图 6O-R），还能缓解、改善nrxn2a2b突变体的行为缺陷，但会显著改变所有nrxn1a1b突变体的行为表现（图 6C-J）。对比野生型与各nrxn1a1b突变品系的垂直空间分布，可见鱼群栖息位置发生显著偏移（对齐秩变换方差分析，基因型 × 水域区域交互效应：*nrxn1a^full1b^full* 组 F (2,12)=22.551，p＜0.0001；*nrxn1a^part1b^part* 组 F (2,12)=65.323，p＜0.0001；*nrxn1a^tmr1b^tmr* 组 F (2,12)=8.095，p=0.0059）。具体表现为：这类突变体在开阔场环境下的行为与野生型无明显差异；但切换至封闭环境后，会出现显著的偏好水面栖息行为，探索行为同步减少。实验全程，nrxn1a^full1b^full、nrxn1a^part1b^part、*nrxn1a^tmr1b^tmr* 突变鱼群停留在水面区域的平均占比分别达到 79±4.6%、88±3%、60±6%；与野生型进行事后两两比较，对应 p 值分别为 0.0006、p＜0.0001、0.023。

简言之，从开阔场切换至封闭场环境不会改变野生型斑马鱼与nrxn3a3b突变体的行为；该环境转换可显著缓解、减轻nrxn2a2b缺失引发的焦虑样行为，但与之相反，会显著加重甚至诱发nrxn1a1b突变体异常偏好水面栖息的行为。

图6 nrxn1和nrxn2突变系对开放场和封闭场环境表现出不同的反应。A、开放场测试装置和视频快照示例的示意图。B、封闭场测试装置和视频快照示例的示意图。C-R，野生型和七个研究的neuresin突变体的区域偏好随时间的变化。左面板表示在10分钟的记录中每5秒每个区域的平均鱼数（每5秒10条鱼的百分比，有4个独立组；(n=4)总共40条鱼）。右面板平均10条记录的鱼在10分钟的总实验记录中的总体空间分布（10条鱼在10分钟记录中的百分比，有4个独立组；(n=4)总共40条鱼）。实验在5分钟的习惯化后开始。数据显示为平均值±SEM。对于跨三个区域的两组之间的比较，应用ART方差分析。在每个区域内进行野生型和突变型鱼类之间的事后成对比较。使用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）程序同时调整来自事后比较的所有原始P值，以控制每个行为条件内七个突变系的多次测试（*表示(p<0.05)，**表示(p<0.01)，***表示(p<0.001) ,**** 表示(p<0.0001)）。

从胚胎幼鱼阶段直至成年，敲除nrxn3均不会引发明显的行为或发育异常

与之相比，nrxn3a3b双敲除突变体发育正常，在探索行为、焦虑样行为及亲和社交行为上均未表现出明显异常（图 4–6）。在新型鱼缸潜水实验、镜像撕咬实验、社交偏好实验以及开阔 / 封闭鱼群分布实验中，所有nrxn3a3b突变体的各项行为指标始终与对照组无显著差异。上述结果说明，对于本研究检测的成年个体行为而言，NRXN3 蛋白要么并非必需，要么在该突变品系体内存在其他基因的功能代偿机制。

讨论

本研究首次构建了全套斑马鱼神经突触黏附蛋白（neurexin）敲除品系，并完成了首个系统性对比表型分析；研究结果证实，不同 neurexin 旁系同源基因在调控成年个体行为方面各司其职、功能不可相互代偿。值得关注的是，突变体在发育早期无明显发育缺陷，但成年后却出现显著行为异常，这一特征与多种神经发育类疾病对应的临床发病进程高度相似。以及精神分裂症、自闭症和双相情感障碍等精神疾病，这些疾病通常缺乏明显的神经解剖学特征，却会表现出显著且快速进展的行为功能异常。这些研究结果凸显了神经毒素蛋白在大脑功能中既保守又复杂的作用，并证明斑马鱼是一种具有参考价值的补充模型该系统可解析精神疾病相关行为域背后的遗传和环路水平机制。在 nrxn1 和 nrxn2 功能缺失（LOF）品系中观察到的极端且稳定的表型，清晰证明了斑马鱼在研究遗传学对心理健康和行为障碍作用方面的潜力。这些发现表明改变了网络兴奋性，而不是纯粹的高度焦虑样行为。支持我们的发现，Koh等人在主要研究神经肌肉连接功能的同时，还报告了nrxn2a外显子2的遗传破坏诱导斑马鱼的焦虑和冷冻样行为。有趣的是，这些表型在几代人之间减弱，而与我们的双突变体相关的行为表型保持稳定，这可能反映了转录适应或其他补偿机制。

这种解释与nrxn2在突触传递调节和兴奋性/抑制性（E/I）平衡中的作用是一致的。在哺乳动物中，Nrxn2/NRXN2在参与应激反应的前脑回路中富集，啮齿动物中的条件性缺失破坏海马回路并增加癫痫易感性。这些观察进一步得到大量证据的支持，这些证据将NRXN2变体与啮齿动物和患者的E/I失衡、癫痫和神经发育障碍联系起来。最近的研究甚至将NRXN2描述为一种“抑制性神经尿素蛋白”，其破坏显著增强兴奋性突触强度和释放概率。

重要的是，neurexins，特别是NRXN2，与自闭症谱系障碍和患者的相关精神状况密切相关。自闭症经常出现显著的神经精神共病，包括焦虑（约42-56%的个体报告）、抑郁（12-70%）和癫痫（8-30%）率升高。因此，在nrxn2突变斑马鱼中观察到的持续焦虑样行为和间歇性癫痫样发作的组合符合人类神经精神状况中通常改变的行为域。总之，这些数据加强了NRXN2依赖性电路调节的重要性和翻译相关性，并确定了对其损失特别敏感的行为维度。

尽管斑马鱼癫痫发作活动的直接确认和表征需要电生理学或钙成像以及详细的时空表达映射，但行为、药理学和跨物种证据的融合支持NRXN2在维持抑制性电路稳定性方面的保守作用。虽然我们的数据不应该被解释为模拟特定的临床实体，如自闭症，但它们确定了对NRXN2改变敏感的行为域，并为未来的电路级和药理学调查提供了一个机械基础的平台。

相反，nrxn1缺失并没有引起斑马鱼强烈的焦虑样行为，而是引起了附属社会行为、攻击性的深刻改变，以及在封闭场条件下加剧的不寻常的表面流动表型。这些结果与NRXN1与精神分裂症密切相关的事实产生了共鸣，精神分裂症也与患者显著的社会互动改变和攻击性调节有关。有趣的是，在小鼠neuresin-1突变系中发现了类似的社会行为改变。

值得注意的是，nrxn1和nrxn2突变体之间的这些表型差异特别令人感兴趣。禁闭减轻了nrxn2突变体的焦虑样行为，但矛盾的是引发了nrxn1突变体的异常表面居住。这表明不同的neuresin类似物揭示了环境线索是如何整合到行为输出中的。在人类中，NRXN1缺失与精神分裂症和异常感觉门控密切相关，而NRXN2与高度焦虑和ASD样特征相关。因此，我们的斑马鱼数据支持nrxn1和nrxn2通过不同的神经通路作用的观点，这些神经通路不同地处理环境和上下文信息，这可以解释为什么不同的类似物与不同的精神状况有关。

另一个引人注目的观察结果是，没有斑马鱼nrxn突变体在胚胎或幼虫阶段表现出明显的发育或形态缺陷。大脑体积、大体解剖结构和基本运动反应都与野生型对照无法区分。然而，在后期发育阶段出现了深刻的表型。这反映了精神疾病的临床悖论，精神疾病被广泛认为具有早期神经发育起源，但缺乏明显的发育异常。这一“沉默的发育轨迹”支持这样一种假设，即新尿素功能障碍以潜伏的方式扰乱突触布线或可塑性，直到电路成熟或环境需求和社会互动/需求增加。斑马鱼在生命早期具有光学可及性和强大的体内成像工具，非常适合研究这种潜在电路中断的精确时间和机制。

相比之下，nrxn3突变体在进行的行为检测中没有显示明显的异常。然而，这并不排除对此处使用的范式未捕获的行为域可能产生的影响，并且缺乏可检测的表型可能反映了通过其他neuresin同源物的部分功能冗余。事实上，nrxn3损失可以通过共享神经回路中NRXN1或NRXN2的存在来补偿。

详细的空间和时间表达地图的斑马鱼neuresin paralog跨越发展和成年期尚未被系统地表征，这限制了直接测试这些假设的能力。更广泛地说，全面时空映射的neuresin paralog及其在斑马鱼神经系统中的异构体将是重要的，以更好地解释这里观察到的paralog特定的行为差异，并完善neurex独立行为调节的机制理解。

限制

本研究关于其与人类疾病相关性的一个局限性是行为分析仅在纯合突变体中进行，而人类中大多数致病性NRXN变异体在复杂的遗传架构中充当杂合风险因素。因此，所提出的模型应被解释为定义完全副特异性新尿素缺失的行为后果，而不是人类杂合条件的直接遗传复制品。我们有意采用完全功能丧失的方法来稳健地描绘副依赖的行为域并建立明确的功能框架。未来研究杂合状态、异构体特异性贡献和药理学相互作用对于完善这些发现的转化相关性至关重要该局限性涉及对全基因组缺失（全缺失）型与跨膜结构域（tmr）突变体之间观察到的表型差异的解读。全基因组缺失预计会完全消除基因功能，而跨膜结构域的缺失仍可能使机体产生接近全长的蛋白质，这类蛋白质缺乏膜锚定结构，因此很可能会分泌到相关的突触间隙中。这种可溶性的细胞外神经连接蛋白片段可能会干扰突触相互作用与神经环路功能，进而导致部分 tmr 突变体表现出更显著的行为学表型。尽管该假设仍具推测性，且需通过直接的生物化学验证，但两种突变策略下观察到的表型大体相似，这有力地支持了本文所报道的神经连接蛋白依赖性效应的特异性。未来仍需开展研究以确定是否会产生截短的细胞外神经连接蛋白片段，并阐明其对突触组织及神经环路功能的潜在影响。

最后，不应将未观察到明显的胚胎或幼虫表型这一情况，理解为神经黏蛋白的缺失对早期神经发育完全没有影响。我们的分析旨在检测整体形态、运动能力以及广泛的行为异常，但无法捕捉到细微的突触、神经环路层面或细胞类型特异性的缺陷。因此，神经黏蛋白缺乏很可能会以某种方式干扰早期神经网络的组装、突触成熟或活动依赖的精细修饰，这些影响在发育早期阶段是隐性的，直到发育后期行为需求增加时才会显现。未来需要借助全脑活动图谱绘制、钙成像、电生理技术以及更高分辨率/更快速度的运动分析，来明确这些潜在变化的发生时间和具体性质。

结论

总之，本研究首次构建了覆盖神经连接蛋白基因家族全部成员的完整斑马鱼突变体系列。这些突变体在胚胎和幼虫阶段未表现出明显的神经发育或运动缺陷，但在生命后期阶段出现了显著且因旁系同源物而异的行为紊乱。斑马鱼中 nrxn1 的缺失主要改变亲和社交行为与攻击性，而 nrxn2 缺失会引发严重的焦虑样行为和癫痫样发作。然而，在所有检测的行为领域中，nrxn3 缺失似乎无明显影响，这与人类中 NRXN3 与精神健康疾病关联较弱的研究结论一致。

斑马鱼的这些表型轨迹反映了人类心理健康研究中的一个核心挑战：大多数精神疾病和神经发育障碍被广泛认为起源于生命早期，但在发育早期往往不会表现出明确、可检测的异常。这些突变体在无明显早期缺陷的情况下展现出显著的成年表型，为探究发育早期与行为表现之间那些微妙、渐进且发生在神经环路层面的机制提供了独特机遇。斑马鱼具有光学可观测性、遗传可操作性和全脑成像能力，是研究突触黏附基因的早期分子扰动如何转化为迟发性行为病理的极其强大的模型。因此，这些nrxn突变体为研究精神疾病的发育时间、网络重塑和机制起源开辟了新途径，这与理解疾病发病机制及识别新型治疗窗口期直接相关。

材料与方法

斑马鱼饲养

成年斑马鱼及其胚胎按照昆士兰大学和格里菲斯大学动物伦理委员会批准的标准方案进行饲养。伦理批准号为AE213_18/AE213_18和GRIDD/11/22/AEC。本研究中使用的野生型及所有品系均为AB遗传背景。本研究中涉及的所有品系的冷冻保存精子，可根据合理申请获取。

神经毒素突变体的生成与维持

本研究中呈现的所有突变体均按照Tromp等人[15]描述的方案制备。CRISPR向导RNA和靶向序列列于补充表S1。利用图1和补充表S2中给出的引物组对杂合子和纯合子进行基因分型。使用REDExtract-N-Amp组织PCR试剂盒（Sigma-Aldrich，货号XNAT-10RXN），按照制造商的说明书，从脱膜胚胎或鱼鳍组织提取的基因组DNA上进行PCR反应。补充文件S1中提供了包含sgRNA靶向位点、引物结合位点和缺失片段在内的注释序列。本文呈现的纯合子分析不包含来自连续两代以上纯合子近交繁育的个体。所分析的对照组和突变体动物均来自相同的AB遗传背景。

胚胎和幼体测量

使用配备 DP75 数码相机的 MVX10 显微镜（奥林巴斯，0.63×）并通过 CellSens 图像分析软件（奥林巴斯）控制，对胚胎和幼虫的发育情况进行了分析。体长从校准后的图像中测量，定义为从头部前端尖端到尾部后端尖端的距离。在受精后第 3、5 和 7 天，对每种基因型的 30 只幼虫进行体长测量。对多个发育阶段的孵化动态进行了评估在受精后24、32、40、48、56、64、72、80、88和96小时这几个时间点进行观察。对于每个突变体品系和野生型对照组，在多个独立的批次中于每个时间点手动计数孵化的胚胎数量。这些数据被用于绘制孵化曲线，并确定发育时间上潜在的基因型特异性差异。

游泳诱发反应测定

在7个突变品系和野生型对照组的幼体中，于受精后48小时评估触觉诱发反应。胚胎于受精后24小时手动脱膜，并在28.5℃下培养至测试前。实验前，将幼体转移至室温放置1小时。将单个幼体（基因型为((n=30 per)）放入装有E3胚胎培养基的90毫米培养皿中。用细杵尖端轻轻对尾部施加机械刺激。每个幼体最多接受十次触碰，成功的逃逸反应记为“1”，无反应记为“0”。使用ZebraBox Revolution系统（法国ViewPoint生命科学公司）记录幼体的运动，直至刺激后游动停止。随后在FIJI软件（ImageJ 1.8.0_322，64位）中分析游动轨迹，并使用GraphPad Prism软件（9.0.0版）将反应率以平均值±标准误均值（SEM）绘制图表。

脑部成像与脑体积定量分析

为评估脑形态学，我们采用了一种已建立的转基因品系 Tg(HuC:Kaede)，该品系通过 Tol2 介导的基因组整合技术构建，在 HuC 泛神经元启动子的调控下表达荧光蛋白 Kaede[16]。脑成像通过 Olympus FV3000 激光扫描共聚焦显微镜完成。胚胎在添加了 0.2 毫摩尔/升 1-苯基-2-硫脲（PTU；终浓度）的 E3 培养基中培养，以抑制色素沉着。幼体在特定的发育时间点（33、57、81、105、129 和 153 小时受精后）使用 488 纳米激发通道进行成像。获取的Z轴堆叠图像通过 FIJI（ImageJ 1.8.0_322，64 位）和 Imaris 软件（英国牛津仪器公司，v. 10.2.0）进行处理与分析。利用 Imaris 中的表面渲染功能重建三维脑模型，对所有样本统一设置荧光强度阈值，以实现脑体积定量分析的标准化。

幼鱼游动与行为分析

研究人员利用斑马盒旋转系统（ViewPoint生命科学公司）评估了斑马鱼幼体的游泳行为以及其对感官刺激的反应。将幼体以三份重复的方式分配到24孔板中，每个孔板包含12只对照组（AB遗传背景）幼体和12只突变体幼体。行为学实验流程为32分钟的记录，包含四个光照4分钟、黑暗4分钟的循环。记录过程中，每分钟会发出一次持续3秒的闪光（2400流明）和一次持续3秒的声振动（250赫兹），两者时间上相差30秒。记录开始前，幼体需在黑暗环境中适应5分钟。实验数据采用GraphPad Prism软件（9.0.0版本）进行分析。

成年斑马鱼大脑解剖与RNA提取

所有实验品系的成鱼脑组织均在三天内完成解剖。将鱼置于冰浆中麻醉，直至观察到鱼体完全失去运动能力且鳃盖活动停止。麻醉后，摘除鱼眼，用精细镊子小心打开颅骨以暴露脑组织。随后完整切除大脑并立即转移至冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。解剖得到的脑组织样本迅速放入TRIzol™ LS试剂（美国加利福尼亚州Invitrogen公司）中，用于RNA提取。  使用Direct-zol™ RNA迷你制备试剂盒（美国加利福尼亚州Zymo Research公司）从成鱼脑组织中提取总RNA，该试剂盒可直接从TRIzol试剂中纯化RNA，无需进行相分离。将组织样本在TRIzol中匀浆，随后按照制造商的操作流程分离总RNA。使用NanoDrop分光光度计（赛默飞世尔科技公司）测定RNA的浓度和纯度，所有样本均在-80 °C下保存，直至进行文库构建。  提取的RNA提交至澳大利亚布里斯班分子生物科学研究所UQ测序中心进行质量控制（QC）评估、文库构建和测序。在构建文库前，对RNA的完整性和浓度进行了检测，所有样本的RNA完整性指数均大于7.2。

成年斑马鱼RNA测序与转录组分析

通过质量控制的样本使用 Illumina TruSeq Stranded mRNA 文库制备试剂盒进行处理，随后进行 RNA 测序Illumina NovaSeq X 测序平台，生成 150 bp 双端测序读长（基因表达公共数据库（GEO）收录号 GSE324987）。为验证 RNA 测序数据的可靠性，我们使用 FastQC（0.11.9 版）和 MultiQC（1.9 版）进行质量控制。通过 Trimmomatic（0.39 版） 去除接头序列和低质量读长，随后再次使用 FastQC 和 MultiQC 对经修剪的读长进行质量检测。使用 STAR（2.7.11b 版）进行用于读取比对的参数为“--twopassMode Basic --quantMode GeneCounts”。将读数比对到Ensembl斑马鱼基因组组装版本GRCz11（第113版）及对应的GTF注释文件。使用DESeq2对神经连接蛋白基因的表达进行标准化，以量化每个基因的表达量。针对神经连接蛋白α或β异构体的区域特异性计数则通过编码外显子进行统计仅针对α亚型，或α和β亚型共有的3'外显子。使用SAMtools 从比对文件中提取计数，这些区域的基因组坐标见补充表S3。

成年行为学研究

所有成年斑马鱼行为实验（详见下文）均使用 Zantiks LT 自动化系统进行（英国剑桥 Zantiks 有限公司；本研究使用的脚本见补充文件 S2）。为最大限度减少昼夜节律干扰，所有测试均在上午11点至下午6点之间开展。实验室保持恒温恒光照条件。突变品系与野生型对照组同步进行测试，且对比仅限定于同一时间段内完成的批次。每组实验鱼的性别比例大致均衡（雄性:雌性约为1:1）。所有成年行为实验均使用4至6月龄的斑马鱼完成。

新型坦克潜水试验

新型 tank 潜水测试（亦称新型 tank 测试，NTT）以斑马鱼在新环境中的垂直分布作为成年斑马鱼“类焦虑”行为的经验证指标，实验按照既定流程进行。行为学测试前，所有斑马鱼需在实验室环境中适应至少1小时。将每条斑马鱼放入尺寸为125×155毫米的透明饲养槽（T-225细胞培养瓶，由英国剑桥市Zantiks有限公司提供）。从侧面视角记录斑马鱼15分钟的行为，并通过Zantiks软件界面进行行为追踪。数据分析时，将饲养槽虚拟划分为上部（T）、中部（M）和下部（B）三个区域。利用Zantiks内置软件实时统计斑马鱼的总游动距离、在各区域的平均停留时间以及进入各区域的平均次数。后续通过EthoVision XT软件（荷兰Noldus公司，版本18.0.1803）量化斑马鱼的平均游动速度、首次进入上部区域的潜伏期、冻结次数及冻结时长占比。

镜像咬测试

镜咬行为是一种成熟的鱼类实验范式。实验在不透明水箱（200×140×140毫米）中进行，以最大限度减少外界环境带来的视觉干扰。沿水箱一侧放置镜面插件，同时以一定角度安装两面镜子以增加反射面。镜区被定义为距离镜面3厘米以内的区域。每条鱼先在黑暗环境中单独适应水箱5分钟。适应完成后恢复照明，使鱼接触镜面，并记录其行为10分钟。以鱼在镜区内停留的总时长作为衡量其镜向行为的主要指标。

社交偏好测试

社交偏好实验旨在评估斑马鱼的社交互动与偏好[25,27]。将一尾待测斑马鱼放入不透明测试缸的中央区域，在一端的相邻区域放置一组成同品系的同种鱼；另一端则为空置区域，作为中性对照。中央区域进一步被虚拟划分为4个面积相等的子区域：距离同伴鱼最近的区域为“社交区”，中间两个区域为“中间区”，最外侧的区域为“空区”。行为学记录适应5分钟后开始实验。从鱼缸顶部视角录制视频，时长为10分钟。随后计算每条鱼在各区域的停留时间，并得出社交偏好指数，以量化实验鱼的社交互动程度。

封闭现场测试

该实验的原理与新型水箱测试（NTT）相似；不过，本实验室对其进行了改造，用于评估一群鱼而非单条鱼的焦虑样行为。该实验被称为封闭区域测试，因为实验是在Zantiks LT培养箱内的封闭环境中进行的，四周用黑色泡沫板围合以隔绝所有外部视觉线索，从而形成一个受保护的环境。这与开放区域测试（见下文）形成对比，开放区域测试的水箱放置在Zantiks系统外部的开放环境中，实验动物暴露于周围空间（有光照且视野开阔）。封闭区域测试在透明长方形水箱（370×140×300毫米，长×宽×高）中开展。将10条鱼组成的鱼群轻轻放入水箱，从侧面对其行为进行录像记录。实验过程中，Zantiks系统顶部的集成式LED照明保持开启状态，且在所有实验中均维持恒定亮度。鱼群的录像时长为15分钟，其中包含5分钟的适应期和10分钟的实验记录期。该实验重复进行了四次（使用(n=4)组独立的10条鱼，共计40条鱼）。将录制的视频导入Adobe Premiere Pro 2022（美国加利福尼亚州Adobe公司），并叠加自定义网格，该网格由三条水平线构成，将水箱高度均分为三个区域（分别定义为上层T、中层M和下层B）。每5秒手动统计一次各区域的鱼的数量。鱼群的分布情况采用盲法评分，不告知实验者鱼的基因型。

旷场实验

本实验在与旷场试验相同的实验室内进行，使用相同的长方形水箱，不过将其安装在Zantiks LT培养箱外的开放环境中。水箱放置在3×3米实验房间中央的桌子上，由天花板常亮灯提供照明（符合澳大利亚/新西兰标准AS/NZS1680.2.4的照明，距实际焦平面700毫米处光照度为400勒克斯）。为保证一致性，水深与旷场试验保持一致。在水箱后方40厘米处安装了一块光板（X光观察板，爱德华兹仪器公司，新南威尔士州），以提升对比度和动物检测效果。行为记录通过连接至Zantiks控制台控制系统的罗技Brio 4K Pro网络摄像头（罗技国际公司，瑞士洛桑）从侧面采集。与旷场试验一致，将每10条鱼的组轻轻用网移入水箱，按照相同的分析流程记录其15分钟的行为（含5分钟适应期）。每种基因型测试四个组（共40条鱼，为10条鱼一组的独立组，组ID分别为(n=4)）。鱼群分布情况采用盲法评分，不了解基因型信息。

游泳隧道试验

本实验使用来自美国麦迪逊市 Loligo® Systems 公司的游泳隧道装置进行，并基于先前的研究[28]对实验方案进行了修改。将4条鱼为一组放入玻璃舱内，随后使用“罗技 BRIO – 超高清网络摄像头”从侧面记录其行为。实验动物先在静水中适应5分钟。适应结束后，每5分钟将水流速度逐步提升10厘米/秒，以诱导鱼类产生水流驱动的游泳行为。记录从水流开始至鱼力竭的时间，力竭的定义为达到以下节点时此时鱼已无法在水流中保持位置，被冲入腔室下游端的收集网中。鱼停止主动游动的那一刻被记为其力竭时间。

PTZ处理实验

戊四氮（PTZ；P6500-25G）购自美国密苏里州圣路易斯市的西格玛奥德里奇公司。在无超纯™ 无脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶蒸馏水中配制2摩尔/升的储备液（美国赛默飞世尔科技公司），于-20摄氏度保存至使用。处理实验前，成年野生型和神经连接蛋白突变型斑马鱼需在实验室环境中适应至少1小时。PTZ的最终浓度（0.1、1、5和10毫摩尔/升）和暴露时长依据既往研究确定[29, 30]。对照组仅暴露于养殖系统水。工作浓度的PTZ溶液通过将储备液稀释于250毫升养殖系统水中新鲜配制，加入实验养殖缸（与新缸潜水实验所用养殖缸相同）。将单条斑马鱼轻轻捞入养殖缸，记录其20分钟单次的行为活动。实验结束后，将斑马鱼转移至装有新鲜养殖系统水的恢复养殖缸。在斑马鱼被放回原饲养缸前，连续一周监测其健康状况与存活情况。每次实验后更换处理用水。癫痫发作评分依据既往发表的标准进行[30]。

统计分析

样本量由每种基因型可用的动物数量决定，同时保持性别平衡，这与以往使用类似行为范式的研究一致，此类样本量足以检测出显著的表型差异。统计分析采用GraphPad Prism 9软件（美国加利福尼亚州拉荷亚市GraphPad公司）和R语言（4.5.2版本）进行。所有数据均未被剔除，未采用随机化处理。实验过程中，研究人员未采用盲法，另有说明的除外。数据以平均值±标准误（SEM）表示。组间比较采用图注中指定的统计检验方法进行。图中，*代表(p<0.05)，*代表(p<0.01)，***代表(p<0.001)，ns表示无显著性差异。所有统计检验及结果的详细汇总见补充文件S3。