标题：Circular RNA targeted theranostic nanoplatform for liver cancer-related gene detection and metastasis regulation in zebrafish using optical sensing and imaging

期刊：Biosensors and Bioelectronics

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118985

摘要

肝癌是全球范围内导致癌症死亡的第三大原因，由于其高度异质性和转移性，临床治疗效果仍不理想。遗憾的是，实现肝癌的有效筛查与精准治疗仍面临巨大挑战。本研究设计并制备了一种整合双光学探针与基因调控序列的纳米复合材料，可同时检测新型基因生物标志物并抑制转移相关基因功能，实现了肝癌的双重诊断与治疗功能。基于表面增强拉曼光谱（SERS）与荧光成像的生物传感模型，能够对正常细胞与肝癌细胞中目标环状RNA（cSMARCA5）的表达差异进行表征与定量分析，其超低检测限可达4.50飞摩尔。同时，纳米复合材料中负载的特异性设计序列可在体外模型中抑制肝癌细胞的迁移与侵袭。此外，通过体内斑马鱼移植肿瘤模型的光学成像技术，可进一步验证其在基因治疗中调控转移的能力。本研究构建的双功能纳米平台可实现肝癌的光学筛查与基因治疗同步进行，为精准医学提供了一种独特的策略。

引言

根据2020年全球癌症统计数据（Siegel等人，2020；Sung等人，2021），肝癌是导致癌症死亡的第三大原因。由于其早期难以发现、晚期难以治疗的特点，肝癌将造成约90.6万例新发病例和83万例死亡。此外，肝癌易发生转移，复发率较高。遗憾的是，目前缺乏有效的治疗技术或预后生物标志物。检测转移性肺癌（杨和罗伯茨，2010；安万万等，2020），这对肺癌的临床治疗和最终生存率至关重要。

与线性RNA不同，环状RNA（circRNA）是一种共价闭合的单链环状结构RNA。它由前体mRNA通过反向剪接形成，既无5'帽结构，也无3'多聚腺苷酸尾。这使其比线性RNA具有更高的稳定性和更长的半衰期（Ashwal-Fluss等人，2014；Suzuki与Tsukahara，2014；Babin等人，2021）。环状RNA广泛分布于大多数物种中（Conn Simon等人，2015；Greene等人，2017），但由于其表达水平较低在环状RNA（circRNA）被发现之前，它们曾被视为信使RNA（mRNA）剪切的副产物，其在疾病进程中的自身生物学功能被忽视。然而，近期研究表明，人类上皮-间质转化过程中有数百种环状RNA受到调控，这提示环状RNA可能具有潜在的功能性作用（Conn Simon 等人，2015）。同时，越来越多的文献报道环状RNA在肺癌（LC）中存在差异表达，并在肺癌的发生发展中发挥重要作用（Yao 等人，2017；Chen 等人，2018）。这表明环状RNA有望成为肺癌极具潜力的诊断标志物与治疗靶点。目前最常用的环状RNA检测技术包括实时聚合酶链式反应（RT-PCR）（Costa 等人，2021）、微阵列技术（Li 等人，2019）、高通量测序（Gaffo 等人，2022；Vromman 等人，2023）、Northern 印迹法（Zia 和 Flynt，2018；De la Rosa 和 Reyes，2019）以及电化学检测法（Zhang 等人，2021a；2021b）。但这些技术仍存在一些弊端，如样品前处理繁琐、特异性差、耗时久、检测灵敏度低、样品不可重复使用且成本高昂（Ng 等人，2014；Pfeffer 等人，2015）。因此，迫切需要开发一种操作简便、快速且成本效益高的检测方法，用于检测作为肺癌筛查生物标志物的环状RNA，并将其应用于肺癌的治疗靶点研究。

表面增强拉曼光谱（SERS）是一种主要由局域表面等离子体共振驱动的纳米级光学增强现象（Kleinman 等人，2013）。与荧光和红外光谱技术相比，SERS 具有超高灵敏度、窄峰宽、低背景信号和固有化学指纹信息等优势（Jiang 等人，2021）。其超高灵敏的检测特性使其能够实现单分子水平的检测（Zong 等人，2018；Lenzi 等人，2019；Guo 等人，2020）。此外，其分子特异性使其能够对复杂生物样品进行多重检测。因此，SERS 已广泛应用于生物医学领域，包括核酸的高灵敏检测（Sun 等人，2010；Song 等人，2016；Panneerselvam 等人，2018；Lai 等人，2015；Lee 等人，2019）。本课题组报道了一种集成催化发夹组装扩增技术的 SERS 生物传感器，可高灵敏、可靠地检测与临床疾病相关的血清微小 RNA（Weng 等人，2022）。Liu 等人提出了一种基于核酸内切酶信号扩增和加热电极的等离子体银纳米立方体增强 SERS 生物传感器，用于口腔癌 DNA 的高灵敏检测（Liu 等人，2021）。然而，目前尚无关于利用 SERS 技术同时检测环状 RNA 以及监测与肺癌相关基因治疗的研究报道。

本研究设计了一种双功能纳米颗粒（AuRFs），利用表面增强拉曼散射（SERS）技术实现对环状RNA（cSMARCA5）的定量检测以及对肝癌下游基因治疗的调控。据报道，cSMARCA5可抑制肝癌细胞的生长与转移，并可作为肝切除手术时肝癌的预后生物标志物（Yu等人，2018年）。因此，本研究首先设计了一种双模式探针，该探针可靶向环状RNA，并结合SERS成像与荧光成像实现细胞内环状RNA的定量检测。随后，探究了该双模式探针对环状RNA参与肝癌细胞及体内下游代谢侵袭功能的影响。由于该探针可促进环状RNA的表达并抑制其与致癌基因（miR-17）的结合，因此可评估其在基因治疗中的可行性。

结果与讨论

环状RNA检测原理

图1展示了AuRFs用于检测肺癌细胞中cSMARCA5以及调控基因治疗的原理。将标记有ROX ((1503 ~cm^{-1}))和(FAM (1503 ~cm^{-1}))的修饰DNA双链连接到金纳米颗粒（Au NPs）表面，形成复合探针Au-ROX-FAM纳米颗粒（AuRFs）。此时，由于FAM相较于ROX更靠近金纳米颗粒表面，FAM产生的表面增强拉曼散射（SERS）信号会更强。当AuRFs进入细胞后，cSMARCA5与DNA-FAM发生竞争性互补结合，导致DNA-FAM脱离金珠表面，FAM对应的SERS信号随之减弱。与此同时，DNA-ROX会自组装形成发夹结构，信号分子ROX靠近金球表面，使得ROX的SERS信号增强。因此，cSMARCA5浓度越高，FAM的SERS信号越弱、ROX的SERS信号越强。在此情况下，ROX与FAM的SERS信号比值((I_{1503} / I_{1133}))是定量检测目标环状RNA的理想指标。值得注意的是，这两种探针分子还具有荧光特性。当存在目标cSMARCA5时，基于表面荧光猝灭效应，ROX的荧光信号会减弱，而FAM的荧光信号会增强。因此，可采用荧光检测模型进一步验证目标环状RNA的表达水平。特别地，我们针对miR-17与cSMARCA5的结合位点设计的DNA-FAM链可与cSMARCA5竞争性结合，使miR-17无法与cSMARCA5结合。这一特性将被用于研究其是否能对肺癌细胞功能产生抑制作用，以实现癌症治疗的目的。

图1.斑马鱼细胞内cSMARCA5检测和基因治疗原理图。

SERS探针的表征与环状RNA的定量分析

首先，我们成功制备了尺寸均一的金纳米颗粒，并且平均粒径为32±4纳米（图2B的图示）。带有标记分子的DNA双链结合到金纳米颗粒表面后，金纳米颗粒的Zeta电位从-8.09毫伏降至-26.19毫伏（图2A）。这是由于脱氧核糖核酸含有带负电的二价磷酸骨架，使得负电荷增加所致（Lin等人，2019）。紫外吸收光谱显示，金拉曼活性基底的紫外吸收峰出现了10纳米的红移，同时在262纳米处出现了核酸的特征峰（图2B）。如图2C所示，动态光散射测得的粒径结果表明，金拉曼活性基底的粒径大于金纳米颗粒。上述结果证实，带有表面增强拉曼散射探针的DNA双链成功修饰到了金纳米颗粒表面。为探究利用制备的金拉曼活性基底定量检测环状RNA的可行性，对不同浓度（1皮摩尔-10微摩尔）的cSMARCA5进行了表面增强拉曼散射检测。在图2D中可以发现，随着浓度升高，FAM的表面增强拉曼散射强度逐渐降低，ROX的表面增强拉曼散射强度逐渐升高。这表明经过特殊设计的AuRFs能够精准靶向cSMARCA5，且修饰在AuRFs表面的探针所产生的SERS信号变化与cSMARCA5的浓度密切相关。以(1133 ~cm^{-1})峰的强度为纵坐标、浓度变化为横坐标绘制标准曲线，得到的标准曲线为(Y=-139.16178 X-327.64841)，相关系数为(R^{2}=0.98016)，经计算检测限（LOD）为79.8飞摩尔（图2(E)）。同理，以(1503 ~cm^{-1})峰的强度为纵坐标、浓度变化为横坐标绘制标准曲线，得到的标准曲线为(Y=194.15365 X+4143.47706)，相关系数为(R^{2})（0.96955），计算得出的检测限为22.3飞摩尔（图2(F)）。进一步以峰强度比((I_{1503} / I_{1133}))为纵坐标、浓度变化为横坐标绘制标准曲线时，可获得更优的相关系数(R^{2})（0.98566）和更低的检测限4.5飞摩尔（图2(G)）。同时，采用常规RT-PCR法对相同的环状RNA样本进行平行检测，其检测限为6.96皮摩尔，检测性能逊于SERS法（图2(I)）。这种优异的定量检测灵敏度可归因于本研究采用了双SERS探针（ROX和FAM）在一次传感测定中使其对靶浓度的超微弱变化提供信号响应。此外，我们检查了不同批次合成的AuRFs用于检测靶环RNA时的SERS光谱。我们发现SERS信号强度保持一致，相对均方差（RSD）为3.06%（图S1（A））。同样，不同批次合成的AuRFs的SERS信号强度保持一致，RSD为4.33%（图S1（B）），表明该方法表现出良好的稳定性和重现性。为了进一步探讨这种基于SERS的生物传感器检测靶环RNA（cSMARCA5）的特异性，制备了一系列干扰RNA样品，包括环RNA反向剪切位点左端（CirRNA（A））、右端（CirRNA（B））和反向截断位点序列的不同数量的点突变序列（1p. m.、3pm.和5pm.），并在相同条件下用SERS方法进行了测试（图2（H））。结果表明，仅在靶环RNA存在时才观察到最高强度的(I_{1503} / I_{1133})，显示了该方法的高特异性及其在复杂组分环境中的应用潜力。此外，我们进一步测试了其他非靶RNA与肝癌相关，包括约HIPK3、约BCBM、约MAD4、miRNA21、miRNA155和miRNA210（图S2）。结果表明，没有检测到任何明显的信号，进一步验证了该方法的高特异性。

图2. (A) 金纳米颗粒（Au NPs）和金纳米棒-荧光纳米复合物（AuRFs）的Zeta电位图，(B) 紫外吸收光谱，(C) 动态光散射统计粒径分布图，插图为金纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图。(D) 不同浓度cSMARCA5的表面增强拉曼散射（SERS）光谱，其中(1133 ~cm^{-1})处的信号来自荧光素酰胺（FAM），(1503 ~cm^{-1})处的信号来自罗丹明X（ROX）。(E) 由(1133 ~cm^{-1}(I_{1133}))处峰比值生成的对数浓度曲线。(F) 由(1503 ~cm^{-1}(I_{1503}))处峰比值生成的对数浓度曲线。(G) 基于(1503 ~cm^{-1})和(1133 ~cm^{-1}(I_{1503} / I_{1133}))处峰比值的对数浓度曲线。(H) 相同浓度干扰物质下金纳米棒-荧光纳米复合物探针的选择性。(I) cSMARCA5拷贝数与实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）循环阈值（Ct值）的线性关系。

细胞内cSMARCA5环RNA检测

细胞内探针的可行性取决于其毒性实验的结果。因此，对AuRFs探针的细胞毒性进行了评估。从浓度梯度的结果来看，Au NPs仅在高达30μg/mL的水平上对细胞有轻微的毒性作用（图3（A））。考虑到探针的细胞内信号强度和其他因素，选择25μg/mL作为后续实验的剂量。与对照样品相比，在细胞与AuRFs探针孵育24小时后，90%以上的细胞仍然存活（图3（B））。为了确定AuRFs探针作用的最佳时间，在不同的孵育时间进行了一系列SERS映射。结果表明，探针在30分钟后进入细胞（图3（B））。3（C）），探针的最强信号直到24小时才存在。在这最终确定以25 μg/mL的金纳米棒荧光探针（AuRFs）与细胞共孵育24小时作为细胞检测的条件。上述结果还表明，本实验中专门设计的纳米探针可通过表面增强拉曼散射（SERS）成像法用于细胞内环状RNA（circRNA）的检测。接下来，分别采用荧光成像和SERS成像法探究目标circRNA在正常肝细胞与肝癌细胞中的差异表达情况。图3(D)为探针（ROX和FAM）的细胞内荧光成像图，可见荧光信号集中于细胞质，且在正常肝细胞（HL-7702）中FAM的荧光信号强于ROX；而在肝癌细胞系（SMMC-7721和SK-hep1）中则出现相反情况，这说明cSMARCA5主要在细胞质中表达，且在肝癌细胞中呈低表达状态。SERS成像结果显示，肝细胞中ROX的SERS信号分布更强、范围更广，而肝癌细胞中则相对较弱（图3(E)）。该结果与荧光成像结果及此前cSMARCA5在肝癌细胞中低表达的研究结论一致。综上，本实验设计的双模探针成功应用于实际样本的检测。

图3.（A）Au NPs的细胞毒性浓度梯度。（B）25μg/mL AuRFs的细胞毒性。（C）25μg/mL AuRFs在不同孵育时间的SK-hep1细胞中的cSMARCA5 SERS成像。（D）肝细胞（HL-7702）和肝癌细胞（SMMC-7721和SK-hep1）中cSMARCA5的荧光成像和（E）SERS映射图像。

金纳米射频在体外模型中抑制肝癌细胞的迁移与侵袭

基因治疗已吸引了大量的研究关注，测序技术和生物信息学工具的快速发展（Cavazzana 等人，2019；Zabaleta 等人，2023）。基因治疗是新一代精准疗法，可通过将治疗性外源基因导入靶细胞来纠正由基因缺陷或异常引发的疾病，从而实现疾病治愈（Zhao 等人，2020）。根据作用原理，基因治疗可大致分为以下几类：基因修饰、基因替换/基因修复、基因灭活、免疫调节以及自杀基因的应用（Cesur-Ergün 和 Demir-Dora，2023）。然而，大多数外源基因是通过逆转录病毒载体导入受体的，这类载体的靶向效率较低，且存在潜在的安全问题（Wang 等人，2018）。因此，已有部分研究人员探索利用纳米技术治疗癌症的基因疗法（An 等人，2022；Huang 等人，2023；Wang 等人，2023）。基于此，本研究考虑以纳米颗粒作为递送载体，将外源正常基因导入靶细胞，从而实现致病基因的靶向替换，用于基因治疗。

根据以往研究，在肝癌细胞中，环状SMARCA5可促进肝癌细胞的迁移与侵袭，但不影响细胞增殖。此外，环状SMARCA5的反向剪切位点可吸附miR-17，进一步促进肝细胞癌的进展。因此，AuRFs探针的设计位点也位于环状SMARCA5的反向剪切位点处。对经AuRFs处理的细胞进行的功能实验显示，AuRFs处理不影响细胞增殖（图4(A–C)），但显著抑制了肝癌细胞的迁移和侵袭能力（图4 D-G）。这表明金纳米射频探针能够精准靶向cSMARCA5，进而通过阻止cSMARCA5与miR-17的结合来抑制肝癌进展。为进一步验证金纳米射频探针的这一功能，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测了金纳米射频探针对cSMARCA5基因表达水平的影响。首先，RT-PCR结果显示，cSMARCA5和miR-17在肝癌组织中均呈低表达（图5 A-D）。经金纳米射频探针处理后，肝癌（SMMC-7721和SK-hep1）细胞中cSMARCA5和miR-17的表达量均显著升高（图5 B-C、E-F）。这些结果表明，金纳米射频探针通过促进cSMARCA5和miR-17的表达来抑制肝癌的迁移和侵袭。此外，该探针不仅可用于cSMARCA5的双模式定位追踪，还具备抑制cSMARCA5介导的转移的功能，为肝癌的基因治疗提供了助力。

图4. AuRFs对LC细胞功能的影响。（A）AuRFs处理后HL-7702细胞增殖变化。AuRFs处理对SMMC-7721细胞（B）增殖、（E）迁移和（G）侵袭的影响。AuRFs处理对SK-hep1细胞（C）增殖、（D）迁移和（F）侵袭的影响。

图5. 细胞中cSMARCA5和miR-17表达水平的RT-PCR检测。(A) HL-7702、SMMC-7721和SK-hep1细胞中cSMARCA5的表达水平；(D) 上述细胞中miR-17的表达水平。(B) 经AuRFs处理后SMMC-7721细胞中cSMARCA5的表达水平；(E) 经AuRFs处理后SMMC-7721细胞中miR-17的表达水平。(C) 经AuRFs处理后SK-hep1细胞中cSMARCA5的表达水平；(F) 经AuRFs处理后SK-hep1细胞中miR-17的表达水平。

金纳米棒对斑马鱼胚胎表型及凋亡的影响

斑马鱼是脊椎动物，其基因和器官（包括肝脏）与人类具有高度的保守性（Garcia 等人，2016）。对鱼类和哺乳动物肝脏发育的研究可为肝癌细胞的发育提供新见解。许多参与的机制斑马鱼肝脏的发育与再生过程在肝脏肿瘤发生中具有一致性。由于斑马鱼幼鱼适用于体内成像和药物随机诱变筛选研究（Philip 等人，2017；Herzog 等人，2019），因此它们是研究肝脏发育、肝癌形成及肝脏再生等肝脏相关问题的理想模型系统。此外，斑马鱼模型中可轻松构建异种移植肿瘤，且饲养成本较低，因此可通过对成年斑马鱼开展纵向研究，探究肝癌发病机制的相关影响因素（Santoriello 和 Zon，2012；North 和 Goessling，2011）。而纳米颗粒的有效毒性被认为是评估其生物相容性的重要指标（Verma 等人，2018），因为纳米颗粒会在活体模型中引发生理和细胞层面的变化。因此，本研究进一步以斑马鱼作为体内模式生物，探究本实验设计的纳米探针对肝癌的影响。如图6（A-C）所示，对斑马鱼胚胎发育至24小时受精后（hpf）、48小时受精后及72小时受精后阶段的表型分析结果显示，不同浓度的金纳米颗粒（Au NPs）和金纳米棒-荧光素复合物（AuRFs）对斑马鱼胚胎的生长几乎无毒性。有研究表明，在暴露过程中金纳米颗粒被细胞摄取后会引发氧化应激，这是不同细胞系模型中出现细胞毒性的原因（Minai 等人，2013）。而细胞凋亡则是这是氧化应激表达增加的结果。通过吖啶橙染色法检测金纳米颗粒（Au NPs）和金纳米探针（AuRFs）对斑马鱼胚胎细胞凋亡的诱导作用，发现浓度为15-25微克/毫升的金纳米颗粒处理组，其心脏细胞的凋亡现象显著增加（图7A）。而浓度在20-35微克/毫升范围内的金纳米探针组，与空白组相比细胞凋亡情况无显著差异（图7B）。结果表明，当金纳米颗粒外层包裹DNA链后，其对斑马鱼细胞凋亡的诱导作用可被抵消。由于体外模型中细胞处理采用的浓度为25微克/毫升，该浓度也被用于体内模型的后续实验。值得注意的是，与金纳米颗粒相比，本实验设计的金纳米探针具有生物相容性，适合进一步探究其在体内模型中对肿瘤的作用效果。

图6. 不同浓度金纳米颗粒（Au NPs）和金纳米棒-叶酸复合物（AuRFs）处理的斑马鱼胚胎生长代表性图谱，分别对应（A）受精后24小时（24 hpf）、（B）受精后48小时（48 hpf）和（C）受精后72小时（72 hpf）。

图7. （A）金纳米颗粒（Au NPs）和（B）金-荧光纳米颗粒（AuRFs）斑马鱼细胞凋亡的代表性统计图与统计图表

金纳米棒在斑马鱼体内模型中抑制肺癌转移

时间梯度成像能够为癌细胞的行为研究提供思路，并阐明细胞迁移、侵袭、增殖和转移所需的机制。为进一步探究金纳米星（AuRFs）对肺癌（LC）的体内治疗效果，本研究构建了肺癌细胞异种移植的斑马鱼移植瘤模型。如图8（A-C）所示，在15-35 μg/mL该浓度范围内，与金纳米颗粒（AuNPs）组相比，金纳米星处理2小时后，斑马鱼尾部肿瘤细胞的荧光面积未出现显著变化。处理48小时后，斑马鱼尾部肿瘤细胞的荧光面积显著降低((P ≤0.05))。本研究还对金纳米星处理的斑马鱼移植瘤模型进行了表面增强拉曼散射（SERS）成像。从图8（D）可以看出，孵育2小时后，金纳米星随移植肿瘤的转移在体内移动，因此在斑马鱼体内广泛分布。而处理48小时后，肿瘤的尾部远处转移显著减少。研究结果研究表明，AuRFs 探针对可在斑马鱼体内抑制肺癌细胞的转移，这与在细胞中观察到的结果一致，说明这种新型纳米探针具有显著的体内治疗效果。

图8. (A) 注射后2小时金纳米颗粒和金共振荧光体用于斑马鱼肿瘤移植的荧光成像，(B) 注射后48小时的荧光成像。(C) 金纳米颗粒和金共振荧光体对斑马鱼肿瘤移植效果的荧光面积统计。(D) 注射后2小时和48小时金共振荧光体用于斑马鱼肿瘤移植的表面增强拉曼散射成像。

结论

本研究提出了一种新型纳米诊疗平台，该平台通过将改性功能纳米颗粒（AuRF）与表面增强拉曼散射（SERS）及荧光技术相结合，实现了基因检测与调控，可同时完成疾病筛查与治疗任务。负载于AuRF表面的双探针能够特异性识别基因生物标志物（环状RNA，cSMARCA5），基于SERS的生物传感技术可利用双探针的强度比对cSMARCA5进行定量检测，其超低检测限可达4.50飞摩尔。此外，借助SERS与荧光成像技术，可观察到cSMARCA5主要在细胞质中表达、在肺癌细胞中低表达的特征。同时，研究发现AuRF表面修饰的特异性单链序列可通过阻断目标环状RNA与微小RNA的配对，有效抑制肺癌细胞的迁移与侵袭。此外，在斑马鱼移植瘤体内模型中，通过光学成像方法可进一步直观观察并验证其在后续基因治疗中调控肿瘤转移的能力。值得注意的是，对AuRF中特异性识别目标基因的序列进行合理修饰，可使其轻松成为适用于其他疾病筛查与治疗的通用纳米平台。因此，本研究提出的策略为推动精准高效的纳米药物发展开辟了新途径。

材料与方法

试剂与仪器

试剂。四氯金酸水合物（(HAuCl_{4})，99%）购自上海易恩化学技术有限公司。柠檬酸钠和氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司。三（2-羧乙基）膦（TCEP）和焦碳酸二乙酯（DEPC）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司生化科技股份有限公司 磷酸盐缓冲液（PBS，(pH=7.4)）和胰蛋白酶购自上海生物工程有限公司。胎牛血清、DMEM 培养基、4% 多聚甲醛、青霉素-链霉素溶液、CCK-8、总细胞RNA提取试剂盒、SYBR Green qPCR 预混液和 Fermentas K1622 逆转录试剂盒购自上海宏业生物技术股份有限公司。本研究所用的DNA和RNA均购自生物工程（上海）股份有限公司。CSMARCA5 环状RNA购自上海吉玛制药技术股份有限公司。CircHIPK3、circBCBM、circSMAD4、miRNA21、miRNA155 及 miRNA210 购自生工生物工程（上海）股份有限公司。序列见表1。

表1 本研究中使用的DNA/RNA序列

仪器。紫外-可见光谱通过 Lambda 950（美国珀金埃尔默公司）测得。动态光散射（DLS）和Zeta电位测量通过马尔文Zetasizer NanoZ（英国马尔文帕纳科公司）完成。透射电子显微镜（TEM）图像通过FEI Talos F200s（美国FEI公司）获取。共聚焦荧光成像通过配备488纳米和532纳米激光的LSM880（德国蔡司公司）完成。高分辨率表面增强拉曼散射（SERS）光谱和SERS成像通过配备785纳米激光源的HORIBA Details XploRA™PLUS（日本堀越公司）记录。测量前，使用(520 ~cm^{-1})进行校准。

金纳米颗粒的制备

采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒。将1毫升1%的(HAuCl_{4})加入99毫升超纯水中，剧烈搅拌至沸腾。迅速加入1毫升1%柠檬酸钠溶液，继续搅拌15分钟。在此过程中，溶液颜色变为深红色。随后将溶液冷却至室温，并在4摄氏度下保存。

SERS探针的制备

向3微升10毫摩尔的TCEP溶液中加入20微升10微摩尔的DNA-ROX溶液，反应1小时以活化巯基。向2毫升金纳米颗粒（重悬于无菌水中）中加入10微升0.02摩尔氯化钠、20微升10微摩尔DNA-ROX和DNA-FAM。将混合液置于37摄氏度的摇床上充分反应12小时。随后加入1微升0.1摩尔氯化钠，继续反应4小时。DNA双链结合到金纳米颗粒表面，形成金纳米颗粒-核酸荧光探针（AuRFs）。

cSMARCA5的检测

向200微升的AuRFs溶液中加入10微升不同浓度的cSMARCA5溶液。反应在室温下进行2小时，随后离心并弃去上清液。将沉淀物滴加在铝板上，室温干燥后进行表面增强拉曼光谱（SERS）检测。光谱检测采用785纳米激光和10倍物镜进行目的积分时间为10 s，积累1次。使用一系列(400-1800 ~cm^{-1})进行光谱采集。每个样品收集三个光谱，以确保拉曼光谱的可靠性。

细胞增殖和毒性测定

实验采用CCK-8试剂盒，在96孔板中向各组细胞中加入不同浓度的AuRF，测定其毒性。

细胞迁移测定

细胞与AuRFs探针孵育24 h，然后制成细胞悬浮液。在24孔板中，将10000个细胞接种到未涂覆基质凝胶的小室中。在小室中加入200μL无血清培养基，在小室外加入500μL含血清培养基。孵育24 h和72 h后去除包膜，用PBS洗涤3次，然后用4%多聚甲醛固定15分钟并干燥。干燥的室浸入结晶紫染色溶液20分钟。将它们干燥并使用倒置光学显微镜（Nikon ECLIPSE TS100，Japan）拍照。使用Image J软件进行计数。

细胞侵袭测定

使用带有基质凝胶的室接种细胞，否则与步骤一致。

细胞内环RNA检测

在细胞生长到对数生长期时，将15000个细胞接种在4 cm2平方高纯度石英片上。孵育4小时后，将细胞贴片并加入2 mL含血清培养基。孵育24小时后，丢弃培养基并加入2 mL含血清培养基和25μg/mL AuRFs继续孵育。然后纳米探针通过内吞作用进入细胞进行作用（Chithrani等人，2006年；Rejman等人，2004年；Varela等人，2012年）。将细胞在37°C和5%(CO_{2})培养箱中孵育24小时后取出。使用PBS溶液轻轻洗涤细胞三次，并在4%多聚甲醛溶液中固定10分钟。然后，使用PBS溶液再洗涤细胞三次，并放置在2 mL PBS溶液中，在4°C下储存。

总RNA提取和RT-PCR

使用EaStep®超级总RNA提取试剂盒，收集到的细胞沉淀按in结构进行柱提取，提取的细胞总RNA置于−80°C并放置一旁，使用cDNA合成试剂盒（Thermofisher）在25°C下5 min和42°C下6 min反转录合成cDNA，使用SYBR Green qPCR Master Mix（GLPBIO）试剂盒进行RT-PCR，反应条件为：95°C，5 min；95°C，15s，60°C，1 min，共40个循环。

斑马鱼胚胎发育和表型观察

选择野生型斑马鱼进行自交。随机选择健康、未变形、正常发育的荧光鱼苗进行表型观察实验。在显微镜下选择受精后3 h（hpf）周期的胚胎，并将其放置在24孔板中，每孔10个胚胎。通过添加纳米探针对胚胎进行处理。在24孔板中，首先使用橡胶头滴管吸走残留的胚胎培养水，然后在每个孔中加入1mL E3溶液和不同浓度的AuRF。将24孔板在28.5C的恒温培养箱中孵育至72hpf，每天重新加入纳米操作袍。处理完成后，在24hpf、48hpf和72hpf下拍摄表型照片，并随机拍摄10尾。将斑马鱼置于身体显微镜系统（SMZ800N，尼康）上，每组随机抽取10条鱼，在3×，白光/荧光条件下拍照，在同一位置拍摄斑马鱼，头部朝左，侧面朝下。

斑马鱼细胞凋亡测定

在72 hpf时，将培养液改为PBS溶液，其中溶解有5μg/mL的嘧啶橙，幼鱼在培养箱中于28°C处理20 min，然后用PBS溶液冲洗3次，处理完成后，将斑马鱼置于体镜系统上，每组随机抽取10条鱼进行照相记录，之后用Image J.

斑马鱼肿瘤移植

在显微镜下选择周期为48 hpf的Fry进行肿瘤移植。移植完成后，将它们随机分组到六孔板中，每孔中有12条鱼。在6孔板中，首先用橡胶头滴管吸走胚胎中残留的胚胎培养水，每孔用4mL E3溶液和不同浓度的AuRFs孵育。将6孔板置于28.5°C的恒温器中，连续孵育至96 hpf。在96 hpf下拍照，并随机拍摄10条尾巴。将斑马鱼置于身体显微镜系统中，从每组中随机选择10条鱼，在6×物镜下拍照，在白光/荧光条件下尾巴放大。斑马鱼在同一位置拍照，头部朝左，侧面朝下。

SERS成像和荧光成像

本研究中，光谱检测和细胞表面增强拉曼散射（SERS）成像是通过堀场（Horiba）全自动拉曼光谱仪的785纳米激光完成的。斑马鱼的SERS图像采用5倍物镜获取，激光强度衰减率为10%，积分时间为5秒。细胞SERS图像采用50倍物镜获取，激光强度衰减率为50%，积分时间为10秒。光谱采集范围为(400-1800 ~cm^{-1})。为确保拉曼光谱的稳定性，每个样品采集三次光谱。固定在石英板上的细胞通过商用一体化激光扫描显微镜平台（蔡司，LSM 880）的488纳米和532纳米激光进行荧光成像。