标题：BjPro-7a, A Proline-Rich Peptide from Bothrops jararaca Venom, Reverses MPP⁺-Induced Locomotor Deficits and Rescues Mitochondrial, Redox, and Synaptic Proteomic Pathways in a Zebrafish Model of Parkinsonism

期刊：Neurochemical Research

原文链接：https://doi.org/10.1007/s11064-026-04835-2

摘要

帕金森病（PD）及相关帕金森综合征涉及线粒体稳态、氧化还原平衡、突触功能和蛋白稳态的进行性破坏。现有疗法仍以对症治疗为主，这推动了对可作用于应激敏感通路的多靶点化合物的研究。BjPro-7a（pEDGPIPP）是一种来自矛头蝮蛇毒液的富含脯氨酸的寡肽，在氧化应激下具有细胞保护作用，但其在体内帕金森样模型中的活性尚不明确。本研究探究了BjPro-7a是否能减轻行为学和蛋白质组学方面的变化1-甲基-4-苯基吡啶鎓诱导的斑马鱼幼鱼的紊乱（((MPP^{+}))）。幼鱼暴露于(500 mu M MPP^{+})并用10微摩尔的BjPro-7a进行后处理，随后评估基础运动能力、光/暗诱发行为以及无标记蛋白质组学图谱。BjPro-7a通过增加总移动距离、改善与运动相关的参数、缩短发作间隔以及恢复视觉诱发的反应性，显著逆转了(MPP+)诱导的运动减少表型。蛋白质组学分析显示出广泛的与恢复相关的重塑，在被(MPP ^{+})抑制的蛋白质中，这种重塑比在中毒诱导的上调蛋白质中更为显著。功能富集和蛋白质-蛋白质相互作用分析表明，囊泡运输和突触组织、线粒体和生物能量功能、氧化还原稳态以及蛋白质质量控制受到协同调控。与恢复相关的代表性蛋白质包括VAMP2和SNAP25A（突触相关）、SDHA和UQCRFS1（线粒体相关）、G6PD和PRDX3（氧化还原相关）以及PSMC5和STIP1（蛋白质稳态相关）。综上，这些研究结果表明，BjPro-7a可减轻(MPP ^{+})诱导的功能障碍，并在斑马鱼幼虫中促进与恢复一致的系统级蛋白质组学重塑。这些数据支持BjPro-7a作为未来帕金森样神经毒性治疗研究的潜在候选药物。

图形摘要：巴西矛头蝮毒液中富含脯氨酸的肽BjPro-7a可逆转帕金森病斑马鱼模型中MPP⁺诱导的运动功能障碍并挽救其线粒体、氧化还原及突触蛋白质组通路

关键词 ：行为表型 · 无标记蛋白质组学 · 线粒体稳态 · 帕金森综合征 · 毒液来源肽 · 斑马鱼模型

引言

神经退行性疾病是一类异质性疾病，其主要临床表型各不相同，但往往在有限的早期致病过程中趋于一致。在完全的表型分化显现之前很久，帕金森病（PD）、阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症等疾病通常会出现涉及线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白稳态受损和突触功能异常的分子改变。这些紊乱并非仅仅是神经元丢失的下游结果，相反，它们越来越被认为是神经元易感性和进行性功能衰退的核心驱动因素]。这种一致性尤为重要，因为它表明有效的干预措施可能需要同时稳定多个对压力敏感的系统，而非仅针对单一孤立的病变。

在这一大背景下，帕金森病（PD）仍是临床相关性最强且治疗难度最大的神经退行性疾病之一。尽管传统上以运动迟缓、肌强直、静止性震颤和姿势不稳等运动症状为特征，但如今人们认识到PD是一种涉及线粒体生物能量衰竭、氧化失衡、囊泡转运改变、蛋白质稳态缺陷以及进行性突触功能障碍的系统性疾病。重要的是，目前的治疗手段在很大程度上仍仅能缓解症状。多巴胺能替代疗法可改善运动功能，但尚无任何疗法被确凿证实能阻止疾病进展或逆转潜在的致病状态]。症状缓解与真正的疾病修饰之间的这一差距，使人们对能够作用于与神经元功能障碍相关的多个生物学通路的化合物产生了更大兴趣。

在这种情况下，动物毒液已成为具有独特药理特性和高靶标选择性的生物活性分子的极具吸引力的来源。毒液衍生化合物已催生了成功的疗法，而近期研究愈发凸显毒液肽作为常规小分子疗法仍显不足的疾病的潜在支架。其吸引力不仅在于化学多样性，还在于它们能与兴奋性、存活及适应性应激反应直接相关的受体、离子通道、酶和信号通路相互作用。这一点在神经退行性疾病中尤为重要，此类疾病中多靶标作用模式可能比作用范围狭窄的药理学手段更具优势。

在蛇毒中，巴西矛头蝮蛇毒中发现了一类特别有趣的富含脯氨酸的寡肽，其生物学作用已超出其经典的心血管相关范畴。我们团队的研究研究已逐步证实，这些肽在氧化应激相关模型中可发挥保护作用。在SH-SY5Y细胞中，BjPro-7a及相关的BjPro肽在(H_{2} O_{2})刺激下可提高细胞活力并降低氧化应激标志物水平。在PC12细胞中，巴西矛头蛇毒液的肽组分可抵御氧化应激诱导的细胞完整性丧失与代谢活性下降，而相同组分在相同条件下却无法保护星形胶质细胞样C6细胞，这表明其作用可能具有细胞类型依赖性，而非非特异性的。近期研究发现，结构相关的富含脯氨酸十肽在神经保护特征以及对精氨酰琥珀酸合成酶/L-精氨酸相关通路的影响上均存在显著差异，这进一步表明不应将这些肽归为一类，而应将其视为具有独特作用机制特征的分子。与此同时，本团队证实巴西矛头蛇毒液的肽组分在遭受氧化应激的斑马鱼体内也能发挥保护作用，而同属蝰科的泰国圆斑蝰毒液的相关组分在相同处理条件下却无法重现这一效应]。综上，这些研究结果为在帕金森病样模型中探究BjPro-7a的作用提供了充分的依据。

BjPro-7a 本身具有特别的吸引力，因为其生物学特征表明它可能通过多种途径影响神经元功能。BjPro-7a 是 M1 毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M1 mAChR）的激动剂，以往研究显示，该物质可通过与 M1 受体激活相符的机制，逆转 PC12 细胞中氧化应激诱导的神经毒性，在 (H_{2} O_{2}) 刺激下恢复细胞完整性、线粒体代谢及活性氧相关的异常变化。此外，对啮齿类动物的行为学研究表明，BjPro-7a 具有抗焦虑和抗抑郁样作用，同时能增强运动能力与探索行为，有证据显示这一效应与 M1 受体激活及儿茶酚胺能通路有关。综合来看，这些研究结果表明，BjPro-7a 并非仅在简单细胞系统中发挥细胞保护作用的分子，而是一种能够参与神经信号通路、并在体内影响整体功能输出的肽类物质。从更广泛的角度而言，靶向 M1 的信号传导在神经退行性疾病中的治疗价值已获得越来越多的支持，尤其是在突触可塑性、神经元兴奋性以及用于改善疾病的胆碱能策略方面。

在目前现有的体内实验平台中，斑马鱼已成为研究早期类神经退行性疾病条件下候选化合物的特别有用的模型。斑马鱼发育迅速、便于光学观测、适用于高通量实验，且其运动行为可量化，这些特性使其尤其适合评估毒物诱导的功能障碍及治疗反应。在以帕金森病为导向的研究中，斑马鱼还具备一项优势，即能将生物体水平的行为学读数与蛋白质组学及系统级分子分析直接关联起来。当研究目标不仅是检测神经毒性，还旨在确定候选化合物能否逆转已形成的功能障碍状态时，这一优势便显得尤为重要。

在基于斑马鱼的帕金森病模型构建中，(MPTP/MPP)轴仍是研究最透彻的毒素范例之一。(MPP ^{+}) 因与线粒体功能障碍、氧化失衡和运动能力受损密切相关而被广泛应用。在我们之前的研究中，斑马鱼幼体长期暴露于(MPP)会产生显著的运动能力低下表型，同时蛋白质组发生重塑，且该重塑在线粒体、氧化还原、蛋白稳态和突触相关过程中高度富集，从而在斑马鱼幼体中确立了明确的中毒特征。这一前期表征对本研究具有重要意义，因为它能让当前的研究问题得到更精准的提出：不再是探究(MPP ^{+})是否能产生相关表型，核心问题转变为BjPro-7a能否减弱或逆转该模型中已明确的功能与分子层面的紊乱。

基于这一理论依据，本研究的目的是探究BjPro-7a是否能够逆转由(MPP)在斑马鱼幼虫中诱导的行为和蛋白质组学改变。通过将运动行为表型分析与无标记蛋白质组学图谱分析及整合性系统层面分析相结合，我们旨在确定BjPro-7a是仅能改变单一的检测指标，还是能促进由中毒作用破坏的核心细胞系统的协同恢复。借此，本研究将BjPro-7a置于更广泛的研究范畴中，以筛选在早期帕金森病样神经毒性方面具有真正治疗潜力的毒液来源肽。

结果

BjPro-7a 逆转 MPP⁺ 诱导的斑马鱼幼鱼基础运动缺陷

通过刃天青还原法评估的代谢活性在暴露于(MPP ^{+})后显著受损（图1A），这表明斑马鱼幼虫的细胞代谢功能明显下降。相比之下，仅用BjPro7a处理的幼虫表现出的代谢水平与对照组相当，这说明该肽不会干扰基础代谢活性。重要的是，中毒后用BjPro-7a处理能够减轻(MPP ^{+})诱导的代谢缺陷，使刃天青还原值恢复至接近对照组的水平。与这些代谢变化同时，暴露于(MPP)会使斑马鱼幼虫出现明显的运动减退表型（图1B和G）。与对照组相比，中毒幼虫的总移动距离（图1B）和每次运动的距离（图1D）显著减少，同时运动发作间隔时间增加（图1E）。平均速度受影响程度低于其他指标（图1C），这表明(MPP ^{+})诱导的表型与运动参与度降低和运动模式组织受损的关联，比与完全无法产生运动的关联更为显著。

仅用 BjPro-7a 处理的幼虫，其运动特征在所有评估参数上均与对照组相当。相比之下，(MPP+/) 组添加 BjPro-7a 的幼虫，其缺陷得到了明显缓解由中毒诱导。BjPro-7a 处理后与(MPP ^{+})组相比，暴露组的总移动距离和单次移动距离均增加，运动发作间隔也缩短。在BjPro-7a存在的情况下，活性状态下的时间占比也因(MPP ^{+})而降低，并向对照组数值靠拢（图1G）。典型的游泳轨迹与这些定量数据一致（图1F）。对照组和BjPro7a组展现出更广泛且更有条理的探索路径，而经(MPP ^{+})处理的幼鱼则表现出短且空间受限的轨迹。在(MPP ^{+} / B) jPro-7a组中，这种受限模式得到显著缓解，轨迹分布与未中毒幼鱼的观察结果更为相似。综上，这些研究结果表明BjPro-7a可逆转斑马鱼幼鱼中(MPP ^{+})诱导的基础运动功能障碍。

图1.A 代谢活性（刃天青还原率）。B 总移动距离。C 平均速度。D 每次运动行为的移动距离。E 行为间歇期。F 典型游泳轨迹。（G）活动状态。各项参数在对照组、MPP+组、BjPro-7a组及MPP+/BjPro-7a组中进行评估。MPP+暴露显著降低代谢活性，并诱发明显的低运动表型。单独给予BjPro-7a未改变基础代谢或行为学参数。值得注意的是，MPP+暴露后给予BjPro-7a治疗可缓解MPP+所致的代谢缺陷及运动功能障碍。数据以箱线图表示（每组n = 12尾幼鱼）。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），后续进行Tukey多重比较检验。*p < 0.05，与对照组相比；#p < 0.05，与MPP+组相比。

BjPro-7a 可恢复 MPP⁺ 暴露斑马鱼幼虫的明/暗诱发运动反应

为了确定 BjPro-7a 的治疗效果是否不仅限于自发运动，研究人员对幼虫进行了接受明暗运动活性测定（图2A-F）。暴露于(MPP ^{+})后，在测试的交替阶段，小鼠的移动距离（图2A）和移动速度（图2B）均降低，同时运动发作的次数（图2C）和持续时间（图2D）减少，运动发作间隔（图2E）延长。因此，(MPP ^{+})不仅损害了整体的运动输出，还破坏了刺激诱发的运动反应的时间组织性。

单独使用 BjPro-7a 能在整个实验过程中保持良好的运动状态，且未造成明显的行为损伤。更重要的是，(MPP^{+} / BjPro-7 a) 组的幼虫相较于中毒组表现出明显的改善幼虫的移动距离和速度更高，运动次数更多、持续时间更长，且运动间隔更短。这些变化表明，经 BjPro-7a 处理后，幼虫的运动强度和运动模式结构均得到了恢复。

时间运动轨迹强化了这一模式（图2G）。对照组和BjPro-7a组在连续的明暗周期中表现出保留的振荡活动，而(MPP ^{+})组在整个实验过程中表现出持续减弱的反应。相比之下，在(MPP)暴露后给予BjPro-7a处理，恢复了更具动态性的反应模式，其活动峰值接近未中毒幼虫中观察到的水平。综上，这些结果表明BjPro-7a不仅能改善基础运动能力，还能还能恢复(MPP)刺激下斑马鱼幼体的视觉诱发运动反应能力。

图2.BjPro-7a在(MPP)暴露的斑马鱼幼体中恢复光/暗诱发的运动反应。面板A-F显示在交替的暗和光阶段记录的运动参数，包括移动的距离、速度、与回合相关的测量值和运动发作之间的间隔。面板B显示了时间运动轨迹，说明了整个测定过程中的行为特征。(MPP)显著降低了运动反应，而BjPro-7a保持了性能并减轻了在中毒幼体中观察到的缺陷。阴影区域表示光阶段。数据以方框图（每组(n=12)只幼体）的形式呈现。使用双向方差分析进行统计比较，然后进行Tukey的多重com-+parisons测试。(^{*} p<0.05)vs. Control；(# p<0.05 vs)。

各实验组蛋白质组学图谱的整体概览

对蛋白质组学数据集的整体检测显示，所有实验组的蛋白质鉴定覆盖率相当（图3A）。对照组共检测到1879种蛋白质，BjPro-7a组为1834种，(MPP+)组为1849种，MPP/BjPro-7a组为1966种。因此，所有实验条件均获得了稳定的蛋白质组深度，中毒幼虫的肽处理并未降低数据集的复杂度。

四组的重叠分析显示了大量共享的核心蛋白质组（图3B）。在所有条件下共检测到1103种蛋白质，而每组也呈现出特定条件的鉴定，包括对照组独有的241种蛋白质、BjPro-7a独有的213种蛋白质、(MPP)独有的244种蛋白质和(MPP / B)jPro-7a独有的274种蛋白质。这些数据表明，尽管实验条件保留了广泛的共同蛋白质组学背景，每种治疗条件也与不同的检测谱相关联。

重叠模式也显示了生物学兴趣的中间交叉点。一些蛋白质由对照组、BjPro-7a组和(MPP^{+} / BjPro-7 a)组共享，但(MPP ^{+})组不存在，而其他亚组共享具体共享于对照组与 (MPP^{+} / B) jPro-7a 之间。相反，额外的蛋白质仍共享于 (MPP ^{+}) 与 MPP/BjPro-7a 之间。综合来看，这些分布情况支持以下观点，即 BjPro-7a 并非简单地消除与中毒相关的特征，而是促进受胁迫幼虫蛋白质组整体景观的更广泛重组。

图3.对照组、BjPro-7a组和1966组在(MPP^{+} / BjPro-7 a)组中的蛋白质组学图谱概览。B 展示四个组间蛋白质鉴定重叠情况的UpSet图。A 四个组的蛋白质鉴定总数。每个实验组共鉴定出1103种蛋白质。所有条件下均检测到相当的蛋白质组覆盖度，对照组检测到1879种蛋白质，BjPro-7a组检测到1834种蛋白质，(MPP)组检测到1849种蛋白质。所有条件下共有1103种蛋白质共享，表明存在稳定的核心蛋白质组，而每个组也检测到了条件特异性的蛋白质。

BjPro-7a 对 MPP⁺ 胁迫斑马鱼幼虫的救援相关蛋白质组重塑

为确定 BjPro-7a 对 (MPP ^{+}) 诱导的蛋白质组学变化的抵消程度，研究人员根据对比组 (MPP ^{+}) 与对照组、(MPP ^{+}) 与 MPP/BjPro-7a 组之间的蛋白表达方向逆转情况对蛋白进行了分类（图 4）。救援相关蛋白被定义为在中毒幼虫中表达发生改变，且经肽处理后表达趋势向相反方向转变、处理组蛋白表达模式向对照组靠拢的蛋白。按照这一标准，在经 (MPP) 处理后表达上调的 293 种蛋白中，有 82 种在 BjPro-7a 处理下表达下调；而在经中毒处理后表达下调的 297 种蛋白中，有 149 种在肽处理后表达上调。因此，在被 (MPP) 抑制的蛋白质中，救援相关效应在数量上比在神经毒性刺激下上调的蛋白质中更为显著。

对救援相关蛋白的亚细胞定位分析显示其在细胞内分布广泛，主要包括细胞质、细胞核、膜结合蛋白和线粒体蛋白（图4B）。这一模式表明，肽段反应并非局限于单个细胞区室，而是涉及与结构、代谢和调控功能相关的蛋白质的广泛重塑。

为进一步表征与肽段介导的修复相关的生物学过程，研究人员对被(MPP)下调且被BjPro-7a上调的蛋白质子集进行了基于STRING的富集分析（图4C）。富集最显著的术语与翻译机制、RNA相关过程、有氧呼吸、蛋白质折叠和代谢稳态相关。这些富集类别表明，生物合成能力、能量代谢和适应性蛋白质维持相关的核心程序得到了恢复。

图4. (MPP) 攻击的斑马鱼幼虫中，BjPro-7a 诱导的救援相关蛋白质组重塑。A  通过各组间定向对比鉴定的救援相关蛋白比例。当蛋白在 (MPP) 组与对照组相比发生变化，且在 (MPP) 组与 MPP/BjPro-7a 组相比呈相反方向变化，且肽处理组的蛋白表达趋势向对照组靠拢时，被归类为救援相关蛋白。在 (MPP) 组上调的蛋白中，293 个中有 82 个（28.0%）在 BjPro-7a 存在的情况下表达下调；而 (MPP) 组下调的 297 个蛋白中，149 个（50.2%）在 BjPro-7a 处理后表达上调肽处理。B 救援相关蛋白亚细胞分布的示意图，显示细胞质、细胞核、膜相关和线粒体蛋白占主导地位。C 基于STRING的生物过程富集分析，分析经(MPP)处理后下调且经BjPro-7a处理后上调的蛋白。根据富集显著性展示代表性富集条目，列高代表富集分数，条形颜色根据错误发现率标注

一张代表性救援相关蛋白的热图进一步揭示了这种反应的双向特性（图5）。其中一个模块包含在受毒幼虫中表达升高、而在BjPro-7a存在时表达降低的蛋白，这些蛋白包括与蛋白稳态、应激反应和线粒体调控相关的因子，例如PSMB10和PSMC1B（蛋白酶体功能）、LONP1（线粒体蛋白质量控制）、ATP6V1E1B（囊泡酸化/ATP酶功能）、COX6C和UQCRQ（线粒体呼吸链），以及PRDX2和GSTT1A（氧化还原相关防御）。囊泡相关蛋白SYT5B也遵循这一模式tern。第二个区块包含被 (MPP ^{+}) 下调的蛋白质且经肽处理后表达上调，包括参与囊泡融合与突触组织的VAMP2和SNAP25A、参与线粒体及生物能量功能的SLC25A11、SDHA、IDH2、UQCRFS1和COX6A1、参与氧化还原稳态的G6PD和PRDX3，以及参与蛋白稳态的PSMC5。

图5.BjPro7a在(MPP)攻击的斑马鱼幼虫中调控的代表性救援相关蛋白。热图显示了对照组、BjPro-7a组、(MPP)组和MPP/BjPro-7a组中具有救援相关表达模式的代表性蛋白。蛋白分为两个主要的方向反应模块：经BjPro-7a处理后上调的(MPP)和下调的蛋白，以及经该肽处理后下调的(MPP)和上调的蛋白。颜色强度代表按行标准化的(log _{2})蛋白丰度（Z值）。代表性蛋白根据主要功能类别进行分组，包括突触/囊泡功能、线粒体和生物能量通路、氧化还原/应激相关蛋白以及蛋白稳态相关因子

这种整合模式与在行为水平上观察到的功能恢复相一致。BjPro-7a并非通过单一孤立的靶点发挥作用，而是似乎重新平衡了细胞能量代谢、囊泡相关功能、氧化适应所需的相互关联通路，以及神经毒性应激下的蛋白质质量控制。表1根据代表性蛋白质的方向反应模式和生物学相关性对其进行了总结，将它们分为恢复、正常化和部分恢复/减弱三类。

表1.BjPro-7a在MPP⁺诱导损伤的斑马鱼幼鱼中调控的代表性神经保护相关蛋白

网络分析揭示BjPro-7a介导的救援相关的功能连接模块

为进一步探究代表性救援相关蛋白之间的关系，研究人员利用STRING数据库构建了蛋白-蛋白相互作用网络，并通过马尔可夫聚类算法（MCL）对其进行聚类分析（图6）。该分析揭示了一个由生物学相关模块构成的结构化相互作用图谱，表明BjPro-7a调控的蛋白并非以孤立靶点的形式分布，而是形成了一个与救援相关的整合网络。

一个核心的中心模块主要由线粒体和生物能量相关蛋白质构成，包括SDHA、UQCRFS1、UQCRQ、COX6A1、COX6C、NDUFS6、TOMM7、CS、DLST、IDH2、SLC25A11和LONP1。A第二个功能连接模块由与蛋白质稳态相关的蛋白质组成，例如PSMC5、PSMC1B、PSMB10、PSMB3和PSMD11B。同时，一个氧化还原/应激相关的分支将PRDX2、PRDX3、G6PD、PARK7、FTHL27和GSTT1A与更广泛的线粒体核心联系起来。一个包含VAMP2、SNAP25A和SYT5B的较小突触/囊泡模块凸显了参与囊泡动力学和神经传递相关组织的蛋白质的恢复。

综合来看，该网络架构将线粒体和生物能量重塑置于肽相关反应的核心位置，同时还展现出与蛋白质稳态、氧化还原平衡以及突触/囊泡功能的协同关联。这种系统层面的组织方式与肽处理后幼虫出现的行为恢复现象相符，也为MPP+斑马鱼模型中连接蛋白质组重塑与功能挽救构建了一套整合框架。

图6.经BjPro-7a调控的、在MPP⁺胁迫下斑马鱼幼体中与救援相关蛋白的网络分析。在STRING数据库中生成救援相关蛋白的蛋白-蛋白相互作用网络，并通过马尔可夫聚类算法（MCL）进行聚类分析。鉴定出不同的功能一致模块，包括核心线粒体/生物能核心模块（SDHA、UQCRFS1、UQCRQ、COX6A1、COX6C、NDUFS6、TOMM7、CS、DLST、IDH2、SLC25A11、LONP1）、蛋白稳态相关模块（PSMC5、PSMC1B、PSMB10、PSMB3、PSMD11B）、氧化还原/应激相关分支（PRDX2、PRDX3、G6PD、PARK7、FTHL27、GSTT1A）以及较小的突触/囊泡模块（VAMP2、SNAP25A、SYT5B）。连线代表有证据支持的相互作用；节点簇反映MCL定义的功能群

讨论

本研究表明，BjPro-7a 能显著减轻 (MPP ^{+}) 对斑马鱼幼虫行为和蛋白质组造成的紊乱，为该肽在早期帕金森病样情境中的治疗效果。我们之前的研究证实，斑马鱼幼虫长期暴露于 (MPP) 会产生可重复的运动减退表型，并伴随与线粒体功能障碍、氧化应激相关的蛋白质组学改变。失衡、蛋白质稳态以及突触生物学。在本研究中，我们对该框架进行了拓展，结果表明BjPro-7a不仅能改善运动能力，还能以与恢复效应一致的方向重塑与中毒相关的蛋白质组学特征。从损伤表征到以恢复为导向的重塑，这一过程具有特别重要的意义，因为当行为学结果和分子终点能够形成具有生物学一致性的解读时，斑马鱼神经毒性模型的参考价值将大幅提升。

在行为学层面，结合帕金森病运动功能障碍来解读本文观察到的这一模式具有重要意义。斑马鱼幼鱼并不能以字面的一一对应方式重现帕金森病的全部临床症状，但毒素诱导的总移动距离减少、游动频次降低、运动参与度下降以及视觉诱发反应性减弱，在该模型中被广泛认为是运动减退/运动徐缓样损伤的有效替代指标。从这个意义上说，本文观察到的MPP⁺诱导的表型并非单纯的自发运动减少，而是反映了运动驱动力下降、运动发作启动障碍以及对环境刺激的反应性减弱。BjPro-7a通过增加总位移、改善游动节律、缩短运动事件间隔，并在基础状态及明/暗条件下恢复活动水平，逆转了这一病理状态。这一模式表明其实现了真正的功能恢复，而非运动的非特异性轻微增加。

蛋白质组学数据进一步证实了这一解释。本研究最明确的发现之一是，与中毒诱导上调的蛋白质相比，在(MPP ^{+})处理后下调的蛋白质中，救援相关的重塑在数量上更为显著。这一结果具有生物学意义，因为神经毒性状态通常既包含应激特征的增强，也涉及关键稳态功能的丧失。在本研究的数据集中，BjPro-7a似乎能特别有效地上调那些被MPP+抑制的、与基础细胞程序相关的蛋白质，包括线粒体代谢、抗氧化调控、囊泡相关组织和蛋白质质量控制。因此，该肽段的作用不仅限于抑制应激相关信号，还涉及恢复维持细胞更稳定状态所需的功能。

线粒体和生物能量轴成为了这一反应的核心组成部分。几种具有代表性的救援相关蛋白属于核心线粒体通路，包括SDHA、UQCRFS1、UQCRQ、COX6A1、COX6C、IDH2、DLST、CS、SLC25A11和TOMM7。这些蛋白共同对应呼吸链活性、三羧酸循环功能、代谢物交换以及线粒体组织。鉴于(MPP+)在破坏线粒体方面已被充分证实的作用呼吸作用与氧化还原稳态方面，这些蛋白质的恢复与帕金森病神经毒性中核心致病轴的逆转高度一致 。网络分析进一步支持了这一结论，将线粒体和生物能量相关蛋白质置于相互作用图谱的核心位置，表明该模块可能是救援反应的主要分子骨架。

第二个主要组成部分涉及氧化还原适应与压力管理。与这一通路相关的蛋白质包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、硫氧还蛋白过氧化物酶3（PRDX3）、硫氧还蛋白过氧化物酶2（PRDX2）、谷胱甘肽S-转移酶T1A（GSTT1A）、铁蛋白重链样27（FTHL27）以及帕金森病蛋白7（PARK7）。这些因子在功能上与过氧化物解毒、氧化还原缓冲、谷胱甘肽相关防御、铁代谢以及细胞对氧化应激的广泛适应有关。由于在基于1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）的模型中，氧化还原失衡与线粒体功能障碍密切相关，因此这些蛋白质与线粒体簇整合在一起这一事实具有特别重要的意义。本研究观察到的氧化还原反应并非代表一个独立的抗氧化系统，而是中毒状态下线粒体-氧化还原偶联广泛恢复的一部分。

蛋白质稳态也成为肽相关反应的一个重要维度。蛋白酶体相关蛋白（如PSMC5、PSMC1B、PSMB10、PSMB3和PSMD11B），以及LONP1和STIP1相关功能，将蛋白质质量控制纳入了救援相关框架中。这一点至关重要，因为神经退行性表型的持续不仅源于能量耗竭或氧化应激，还源于蛋白质更新、折叠和监测功能的维持失败。现有数据表明，BjPro-7a在这一更广泛的稳态空间中发挥作用，使功能相互依赖而非孤立的各系统蛋白质组谱趋向更平衡的状态。

该反应的突触/囊泡维度也值得关注。VAMP2、SNAP25A和SYT5B是经肽处理后发生表达变化的代表性蛋白之一。这些分子与囊泡融合、突触机制及囊泡相关组织相关，对它们的调控尤为关键，因为运动行为最终依赖于神经元通讯的维持与输出的协调。在此背景下，突触/囊泡蛋白的恢复为连接蛋白质组重塑与行为学实验中观察到的运动能力恢复提供了合理的分子桥梁。

解释这些发现的一个重要机制框架是前文所述的 BjPro-7a 激活 M1 型毒蕈碱型乙酰胆碱受体的能力。这一背景具有高度相关性，因为与 M1 相关的信号传导与神经元兴奋性、细胞内过程密切相关与适应性应激反应相关的信号级联反应，以及代谢活性神经元状态的维持。在此背景下，本文观察到的行为挽救和协同蛋白质组重塑，在生物学上与受体相关的治疗效应一致，该效应涉及在(MPP ^{+})刺激下恢复突触、线粒体、氧化还原和蛋白稳态。尽管本研究未在斑马鱼模型中直接检测受体依赖性，但BjPro-7a已知的药理学特征为以往的体外和啮齿动物研究与本文记录的系统水平挽救效应之间搭建了合理的机制桥梁。

另一个重要点是，对BjPro-7a的反应并非简单地回到未激活状态。重叠分析表明，经肽处理的中毒状态该组与对照组以及(MPP ^{+})共有部分蛋白各组的情况，同时还展示了特定条件下的检测结果。这表明挽救作用是通过部分恢复以及与治疗相关的重塑实现的，而非中毒特征被完全消除。这种模式在复杂的体内系统中具有生物学合理性，并且与本文所采用的分类完全一致，即恢复的、正常化的以及部分恢复/减弱的蛋白质。

这些研究结果应在本实验设计的范围内进行解读。斑马鱼幼体模型的选择值得明确考量。尽管成体生物拥有完全成熟的神经系统，但幼体阶段具备多项互补且操作上独特的优势，足以证明其在本研究阶段使用的合理性。在受精后5天，斑马鱼幼体已完成神经系统的基本形态发生，包括多巴胺能神经元群体的分化、运动回路的建立，以及线粒体和蛋白稳态机制保守组分的表达。幼体平台还支持高通量实验设计，最大限度减少了每个实验条件所需的动物数量，可实现直接的药物给药，并能提供可量化的运动学读数，这些读数与帕金森病神经毒性的运动减少特征相吻合。本研究的目的是确定BjPro-7a是否产生有效的挽救效应，并表征相关的分子重塑，而幼体模型非常适合实现这些目标。在神经系统更成熟的成体生物中评估该肽是下一步的重要工作，且被认定为未来研究的重点。由于蛋白质组学分析是基于全幼体样本开展的，因此观察到的变化反映的是个体水平的重塑，而非细胞类型特异性反应。此外，本文采用的挽救分类标准基于组间比较的方向一致性来筛选具有生物学意义的候选因子，后续还需对其进行进一步优化。未来的靶向验证研究。即便如此，本研究采用的行为学与蛋白质组学相结合的方法，为BjPro-7a提供了一致性证据：该物质并非仅改变单一的检测指标，而是能将与中毒相关的状态转变为更稳定的功能和分子特征谱。

总体而言，本研究结果表明BjPro-7a是一种具有潜力的毒液来源肽，在早期帕金森病样神经毒性中具备多靶点治疗潜力。其作用机制与运动能力的协同恢复以及以线粒体功能、氧化还原适应、蛋白稳态和囊泡相关生物学为核心的分子系统重塑密切相关。这种整合性反应进一步支持了毒液来源肽可作为未来神经退行性疾病机制研究和转化研究的有效工具这一观点。

结论

总之，本研究表明BjPro-7a能够减轻斑马鱼幼虫中由(MPP ^{+})诱导的行为和蛋白质组紊乱，这证明了其作为多靶点治疗候选物质在早期帕金森病样情境中的应用价值。该肽段恢复了斑马鱼幼虫的基础运动能力，改善了光/暗刺激引发的反应，并促进了广泛的蛋白质组重塑，这与逆转中毒所破坏的核心细胞系统的状态相符。综合分析显示，这一效应与对突触/囊泡功能、线粒体及生物能量稳态、氧化还原平衡和蛋白质稳态相关的蛋白质及通路的协同调控有关。

重要的是，行为表型分析与蛋白质组学图谱分析的联合使用提供了一致的证据，表明BjPro-7a并非仅改变单一的检测指标，而是将与中毒相关的状态转变为保存得更完好的功能和分子图谱。这种系统层面的恢复模式进一步佐证了BjPro-7a是帕金森病神经毒性及相关神经退行性功能障碍实验模型中开展进一步机制研究的极具潜力的候选药物。

材料与方法

肽类与试剂

BjPro-7a 是一种合成七肽，源自巴西矛头蝮蛇毒液，对应序列为 pGlu-Asp-Gly-Pro-Ile-Pro-Pro（pEDGPIPP），由巴西里约热内卢的 GenOne Biotecnologia 公司定制合成。1-甲基-4-苯基吡啶碘化物 ((MPP^{+})) 购自美国密苏里州圣路易斯市的 Sigma-Aldrich 公司。E3 胚胎培养基采用氯化钠、氯化钾、氯化钙 (CaCl_{2}) 以及 (MgSO_{4}) 配制而成。蛋白质提取与定量实验所用的尿素、1-S-辛基-β-D-硫代葡萄糖苷（OG）、Bradford 试剂和牛血清白蛋白（BSA），均按照我们此前标准化的实验流程使用。

斑马鱼的饲养、繁殖与伦理规范

图宾根（TU）品系的成年斑马鱼饲养繁殖于巴西圣保罗州立大学（Unifesp）圣保罗校区的动物设施。所有涉及动物饲养和实验使用的程序均按照巴西国家动物实验控制委员会指南（CONCEA，第61/2023号规范性决议）执行。本研究方案经圣保罗州立大学动物使用机构伦理委员会审查并批准（CEUA编号：5220291122）。研究人员每日对动物福利状况进行评估。成年斑马鱼饲养在3升聚碳酸酯养殖箱（Alesco®，巴西圣保罗）中，养殖箱连接循环水产养殖系统（Alesco®，巴西圣保罗），饲养环境为标准化条件：pH值7.0±0.5、电导率6微西门子、氨氮（0ppm）、亚硝酸盐（0ppm）、温度28±1℃，光暗周期为14小时光照/10小时黑暗（经济合作与发展组织，1992年）。饲养方式为每日投喂三次商业薄片饲料（Alcon®七彩饲料；蛋白质含量42%），并每日两次自由投喂卤虫无节幼体作为补充（卤虫，编号(RN ^{circ})）。

实验设计与MPP⁺/BjPro-7a暴露方案

实验设计包含四组：对照组、(MPP)、BjPro-7a以及(MPP^{+} / BjPro-7 a)。实验仅纳入形态正常、无可见发育异常的胚胎和幼体。受精后24小时（hpf），将胚胎随机分配至四组，在28℃、14:10光暗周期的E3胚胎培养基中培养。(MPP)用E3胚胎培养基稀释至终浓度500微摩尔，按照本团队先前标准化的中毒方案，于受精后1至5天（dpf）进行给药。

BjPro-7a 的最终浓度为 10 微摩尔，这一浓度是基于本团队此前的体外研究确定的，该研究证明 BjPro-7a 在这一浓度下具有有效的保护活性。在 (MPP ^{+} / B) jPro-7a 组中，幼虫在既定的染毒期间首先暴露于 (MPP ^{+})。暴露结束后，移除含 (MPP ^{+}) 的培养基，替换为含 BjPro-7a 的新鲜 E3 培养基，幼虫继续接受肽类处理 24 小时。在 BjPro-7a 组中，实验时间线相同，仅 （注：原文未完整结束，翻译保留原文未完成的句式）幼虫在不含 (MPP ^{+}) 的 E3 培养基中饲养在初始阶段，随后单独暴露于BjPro-7a环境中24小时。处理液每日更换，且保持测试化合物的初始浓度。行为学分析采用12只在初始阶段，随后单独暴露于BjPro-7a环境中24小时。处理液每日更换，且保持测试化合物的初始浓度。行为学分析采用12只每组的幼虫数量。蛋白质组学分析方面，每组制备两个生物学重复样本，每个样本均包含30只在5天胚胎期（相当于120小时胚胎期，与行为学评估所用的发育时间点相同）收集的幼虫，遵循我们此前标准化研究中采用的相同实验流程[29]。

代谢活性

在处理期结束时（5天龄），将每个实验条件下的幼虫培养基替换为最终浓度为80 (mu mol cdot L^{-1}) 29]的含刃天青的E3培养基。孵育2小时后，使用酶标仪（美国佛蒙特州威努斯基市的BioTek公司）通过荧光测量评估刃天青还原为试卤灵的情况，激发波长和发射波长分别设置为530纳米和590纳米。

行为评估

在受精后120小时（hpf）进行行为学分析，作为1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP⁺）诱导运动功能障碍以及肽类相关挽救作用的功能性读数。记录前，将斑马鱼幼鱼轻柔转移至新鲜的E3培养基中，以避免处理液残留。将幼鱼单独放置于24孔板中，每孔一条幼鱼，每孔加入2毫升新鲜的E3胚胎培养基。将板置于定制的行为追踪箱内，在受控的环境条件下进行实验。在黑暗中适应15分钟后，在由30秒光照和30秒黑暗交替组成的光/暗循环下记录行为180秒，该循环重复三次。

分析了以下指标：总游动距离、平均速度、单次活动周期距离、活动周期间隔、活跃/非活跃时间占比、活动周期数量、活动周期时长，以及随时间变化的运动特征。在明/暗实验中，使用阴影区域标注光照阶段，以辅助解读光刺激引发的反应。从追踪数据集中提取了代表性的游泳轨迹和时间运动曲线，用于图表展示。视频在 Fiji/ImageJ 2（美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院）中进行分析，提取的数据经整理后在 GraphPad Prism 8（美国加利福尼亚州圣地亚哥市 GraphPad 软件公司）中绘制完成。

蛋白质组学样品制备

在无标记蛋白质组学分析中，幼虫样本于实验终点（5 天受精后）收集。样本按照我们之前在斑马鱼蛋白质组学研究中标准化的流程进行处理。简而言之，合并的幼虫在真空浓缩仪中干燥（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司的 Savant SPD120 设备），并重悬于 100 微升提取缓冲液中，该缓冲液含 150 毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH 8.8）、8 摩尔尿素和 0.5% 辛基葡萄糖苷。样品在冰上进行三次超声处理循环（振幅 30%，每次 1 分钟，间隔 2 秒），随后在 4 摄氏度、10000 倍重力加速度条件下离心 10 分钟。收集上清液，用丙酮:乙醇:甲酸（体积比 50:49.5:0.5）沉淀蛋白质，在零下 20 摄氏度孵育 3 小时，再在 4 摄氏度、12000 倍重力加速度条件下离心 10 分钟得到沉淀。将沉淀重悬于 50 微升 150 毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH 8.8）中。

采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准品测定蛋白质浓度。将样品等分试样用去离子水按1:20比例稀释，每份样品取20微升，一式两份加样至96孔微孔板中。在SpectraMax Plus 384微孔板读板机（美国加利福尼亚州圣何塞市分子设备公司）上于595纳米波长处测定吸光度。

液相色谱-串联质谱分析

在连接至 Dionex Ultimate 3000 RSLCnano 纳升液相系统（德国盖尔马林赛默飞世尔科技公司）的 Orbitrap Eclipse  Tribrid 质谱仪（德国不莱梅赛默飞世尔科技公司）上进行蛋白质组学分析。以 300 纳升/分钟的流速，将约 1 微克每份的酶解肽段样品上样至 NanoEase M/Z Peptide BEH C18 分析柱（美国马萨诸塞州米尔福德沃特世公司；(130 AA)，粒径 1.7 微米，柱长 250 毫米，内径 75 微米）。采用 90 分钟线性梯度洗脱，流动相为含 0.1% 甲酸的乙腈溶液，乙腈体积分数从 4% 升至 50%，实现肽段分离。在质荷比（m/z）375–1500 范围内进行全质谱扫描，分辨率设为 120,000，自动增益控制目标值为 (1 ×10^{6})，最大进样时间 100 毫秒。采用高能碰撞解离模式碎裂强度最高的前体离子，归一化碰撞能量为 30%，隔离窗口为 (1.2 ~m / z)，自动增益控制目标值为 (1 ×10^{5})，串联质谱分辨率为 15,000。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的数据采集沿用本团队前期研究[29]中相同的分析平台与参数设置。

蛋白质组学数据处理与生物信息学分析

原始MS文件被转换为mzXML格式，并使用Comet搜索引擎结合斑马鱼UniProt参考蛋白质组进行分析。肽段-谱匹配通过PeptideProphet进行验证，错误发现率阈值设为(≤3 %)。采用Xpress算法进行蛋白质定量，基于定制的R脚本在蛋白质水平汇总肽段强度，遵循此前应用于我们斑马鱼(MPP+)数据集的流程。蛋白质丰度矩阵被然后将其按四个实验组（对照组、BjPro-7a、(MPP ^{+}) 和 (MPP^{+} / BjPro-7 a))）进行整理，以进行综合对比。

研究采用了三种主要对比方式进行解读：MPPt 与对照组对比、(MPP ^{+}) 与 (MPP+/I) 3jPro-7a 对比，以及 (MPP+/) BjPro-7a 与对照组对比。救援相关蛋白的定义为：在 (MPP ^{+}) 与对照组的对比中发生改变，且在 (MPP) 与 (MPP) /BjPro-7a 对比中呈相反方向变化的蛋白，且肽处理组的蛋白表达趋势向对照组靠拢。基于这一逻辑，根据表 1 总结的方向框架，代表性蛋白被分为恢复型、归一化型或部分恢复/减弱型。在该框架中，“恢复型”指在 MPP+ 与对照组对比中表达下调的蛋白，在 MPP+/BjPro-7a 组中其表达水平恢复至接近对照组；“归一化型”指在 MPP+ 与对照组对比中表达上调的蛋白，在 MPP+/BjPro-7a 组中其表达水平下调并趋近对照组；“部分恢复/减弱型”指表达趋势得到校正但未完全恢复至对照组正常范围的蛋白。研究还纳入了 BjPro-7a 与对照组的对比，以评估单独使用肽处理是否会使蛋白质组学图谱相对于未处理幼虫出现可检测的变化。

对四个组进行重叠分析，以此生成全局蛋白质组概览。利用 STRING 数据库，对经 (MPP) 处理后表达下调、且经 BjPro-7a 处理后表达上调的蛋白质开展功能富集分析。同时在 STRING 数据库中进行蛋白质-蛋白质相互作用分析，并通过马尔可夫聚类算法对代表性的救援相关蛋白进行聚类，以识别与线粒体/生物能量稳态、氧化还原/应激适应、蛋白稳态以及突触/囊泡功能相关的生物学一致性模块。为进行功能注释和通路解析，基于序列同源性将蛋白质标识符映射到人类 UniProt 条目，在适用情况下也考虑了斑马鱼的相应直系同源物。

统计分析

行为学数据以箱线图形式呈现。根据每个数据集的结构，对四组小鼠进行总体运动能力比较，并采用方差分析结合Tukey多重比较检验来分析明暗箱实验。对于明暗周期分析，先前采用的标准化流程为双因素方差分析结合Tukey多重比较检验。统计显著性设定为(p<0.05)