题目：Molecular Iodine/PPARγ Interaction in the Invasion and Angiogenesis of Neuroblastoma Xenografts

原文链接：https://www.mdpi.com/2073-4409/15/13/1189MDPI

期刊：Cells

研究亮点

主要研究发现是什么？

l 分子碘（(I_{2})）会降低 SK-N-AS（非 MYCN 扩增型）和 SK-N-BE(2)（MYCN 扩增型）神经母细胞瘤细胞的活力。

l 这些作用涉及表观遗传（抗氧化）和遗传（过氧化物酶体增殖物激活受体γ的激活；(PPAR gamma）机制。

主要研究发现有何意义？

l 抗氧化作用会损害干细胞的持续状态（MYCN 和 TrkA），而 PPARγ 激活则会诱导基因分化（FasN、TrkB），从而在体外创伤实验和斑马鱼异种移植模型中损害血管生成能力与侵袭能力。

摘要

本研究探究了分子碘（(I_{2})）补充剂对高危神经母细胞瘤（NB）细胞活力、侵袭性及血管生成潜能的影响。采用非MYCN扩增的NB细胞系SK-N-AS和MYCN扩增的SK-N-BE(2)进行体外实验。通过拮抗剂GW9662、基因表达检测（RT-qPCR）和蛋白水平检测（蛋白质印迹法）评估过氧化物酶体增殖物激活受体γ（(P P A R gamma)）的作用。体内实验则利用斑马鱼异种移植模型评估肿瘤大小、血管生成及尾侧细胞扩散情况。(I_{2})补充剂显著降低了两种细胞系的细胞活力，且与(PPAR gamma)的激活无关。在SK-N-BE(2)细胞中，通过伤口愈合实验检测发现，(I_{2})会损害细胞迁移，且这一效应与(PPAR gamma)的激活无明显关联。然而，基因表达分析表明(I_{2})的作用机制较为复杂，既包括直接的抗氧化效应，也涉及(PPAR gamma)介导的作用。活性氧水平的显著降低（DCFDA染色法检测）以及(I_{2})对长链非编码RNA心肌梗死相关转录本（MIAT）的沉默，与MYCN和TrkB表达的降低直接相关。与之相反，PPARγ激活会伴随FasN和TrkA的过表达，同时使MYCN稳定蛋白Aurka的表达显著降低。在斑马鱼模型中，经(I_{2})预处理的SK-N-BE(2)异种移植物出现了明显的体积减小血管生成（血管密度）以及侵袭能力的降低。综上所述，碘单质补充处理可降低神经母细胞瘤细胞的细胞活力，并减弱其侵袭与血管生成能力，这凸显了其作为高危神经母细胞瘤常规治疗辅助手段的潜力。

关键词：神经母细胞瘤；MYCN；(PPAR gamma)；斑马鱼异种移植；分子碘；抗氧化剂；血管生成

引言

神经母细胞瘤（NB）是五岁以下儿童中最常见的颅外实体肿瘤之一。该疾病具有高度异质性，生物学和临床特征差异显著，涵盖低风险肿瘤至高侵袭性且化学耐药的肿瘤。MYCN原癌基因（MYCN）属于MYC基因家族，该家族还包括细胞型MYC（C-MYC）和肺型MYC。MYCN在神经源性恶性肿瘤（包括神经母细胞瘤和髓母细胞瘤）的发生发展中发挥关键作用。该基因主要在发育过程中的外周神经嵴中表达，对干细胞的增殖、迁移和稳态维持至关重要。其低表达与神经元终末分化相关，而持续过表达则与化学耐药性及侵袭性相关。约50%的MYCN扩增型神经母细胞瘤患者在确诊时已发生转移，这意味着预后不良且生存率降低。 MYCN调控干性相关基因的表达，如八聚体结合转录因子4和神经营养受体酪氨酸激酶2（NTRK2，TrkB）。它还可通过诱导血管内皮生长因子-A（VEGFA）调控血管生成。此外，研究人员发现神经母细胞瘤中长链非编码RNA（lncRNA）心肌梗死相关转录本（MIAT）与MYCN扩增存在关联。MIAT沉默仅能诱导MYCN扩增型细胞发生死亡，而高侵袭性神经母细胞瘤则表现出MIAT的过表达。微环境中的氧化应激是MIAT表达的主要触发因素。相反，预后良好的神经母细胞瘤与分化因子的过表达相关，如神经营养受体酪氨酸激酶1（NTRK1，TrkA）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ。 尽管已证实(PPAR gamma)激动剂对几乎所有神经母细胞瘤细胞类型均具有明确的抑制作用，但由于存在血液稀释、外周水肿以及可能增加充血性心力衰竭风险等多种不良反应，其临床应用受到限制。这些不良反应归因于这些受体的广泛分布，因此寻找佐剂和器官特异性天然化合物仍是研究热点。在这一背景下，分子碘被证实能在癌细胞中发挥抗增殖作用，并在中风险神经母细胞瘤细胞系（SK-N-AS）中与全反式维甲酸的分化作用产生协同效应，在高风险神经母细胞瘤细胞系（SK-N-BE(2)）中与环磷酰胺的凋亡作用产生协同效应。分子碘可能通过多种复杂机制发挥作用。其抗氧化作用已得到阐明，包括直接中和活性氧（ROS）以及释放/激活核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）——抗氧化基因的主要调控因子。分子碘还可通过调节甲基化酶发挥表观遗传效应，并最终通过激活(PPAR gamma)调控基因表达。在后者机制中，(I_{2})与花生四烯酸反应生成脂质6-碘内酯，这是(PPAR gamma)受体的特异性配体。癌细胞中花生四烯酸的浓度约为非癌细胞的十倍，这使得(I_{2})成为特定器官治疗应用的理想候选物。本研究通过体外实验和斑马鱼异种移植模型，分析了(I_{2})补充剂对高风险神经母细胞瘤细胞活力、血管生成和侵袭性的影响，并重点探讨了过氧化物酶体增殖物激活受体γ在其中的作用。

结果

过氧化物酶体增殖物激活受体γ在细胞活力中的作用

图1总结了在(I_{2})补充剂的几种浓度下NB细胞的活力以及PPARγ的参与情况。两种细胞系均对(I_{2})敏感，且半数抑制浓度（IC50）值相近（380和368微摩尔），但SK-N-BE(2)细胞系更敏感，在48小时内即出现抑制现象。研究通过激动剂RGZ和拮抗剂GW分析了(PPAR gamma)的参与情况。两种细胞系在PPARγ作用下均表现出活力下降用 RGZ 激活，而 GW 的存在逆转了这一效应。相反，尽管 (I_{2})

补充处理也产生了类似的下降效果，但GW并未抵消或逆转这一现象，这表明该抑制作用与(PPAR gamma)无关。

图1. 对(I_{2})的响应以及(PPAR gamma)在细胞活力中的参与情况。(A,B) 台盼蓝排斥试验用于评估不同(I_{2})浓度下SK-N-AS和SK-N-BE(2)细胞的活力。(C,D)，在(I_{2})（400 µM）、(PPAR gamma)激动剂（RGZ 1 µM）和拮抗剂（GW；0.5 µM）存在下的活力响应。所有实验均进行96小时。数据为至少三次独立重复实验的代表结果，以平均值±标准差表示。数据通过单因素方差分析进行分析。星号和字母表示统计学差异(p<0.05)

抗氧化作用与分子反应

为分析 PPARγ 在对 (I_{2}) 的分子应答中所起的作用，本研究检测了与氧化状态相关或受 (PPAR gamma) 直接调控的基因。图 2 总结了单独补充 (I_{2}) 或在拮抗剂 GW 存在时补充该物质的抗氧化效应及不同信使分子的表达情况。图 A 显示，在 (I_{2}) 处理组(I_{2} 组和 GW + I2 组）中，活性氧水平更低，且与氧化应激相关的基因表达（MIAT）、增殖相关基因表达及化疗耐药相关基因表达（MYCN 和 (TrkB)）均受到抑制。GW 并未抵消这些应答反应。图 B 显示，与分化相关的基因如脂肪酸合成酶基因 (PPAR gamma)（FasN）和神经营养因子受体基因 TrkA 出现过表达，而编码极光激酶 A、参与 MYCN 稳定的 Aurora 激酶 A 基因（Aurka）表达降低。GW 的存在则完全消除了上述所有应答反应。图 C 经蛋白质印迹法证实，(I_{2}) 可提高 PPARγ 蛋白水平并降低 MYCN 蛋白表达。

图2. (I_{2})和GW对SK-N-BE(2)细胞的抗氧化作用及分子应答。(A) 采用DCFDA法分析活性氧（ROS）水平，以100 µM过氧化氢(H_{2} O_{2})为阳性对照，基因表达不受过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激活的独立调控。(B) 基因表达依赖于PPARγ激活，以β-肌动蛋白为参照进行标准化（定量聚合酶链式反应，qPCR）。(C) MYCN和(PPAR gamma)的蛋白含量（蛋白质印迹法，Western blot）。蛋白含量以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为参照进行标准化。所有处理均加入(I_{2})（400 µM）、PPARγ拮抗剂GW9662（0.5 µM；GW）以及联合处理的(GW+I_{2})，作用时间为96小时。数据为至少三次独立重复实验的代表性结果，以平均值±标准差（mean ± SD）表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行分析。不同字母表示存在统计学差异（p<0.05）

侵袭反应

为评估(I_{2})对体外细胞迁移的影响，我们进行了划痕愈合实验。在处理后24小时测定划痕愈合情况（图3B），结果显示(I_{2})会降低细胞迁移能力。这一效应似乎部分由(PPAR gamma)介导，因为(GW+I_{2})的存在并不能完全抑制划痕闭合。图3B展示了(I_{2})对侵袭相关基因（如N-钙粘蛋白和血管内皮生长因子A）的抑制作用。

图3. SK-N-BE(2)细胞对I2的侵袭性反应。(A) 划痕愈合实验；(a–d) 各处理条件下的代表性显微照片（10倍放大），展示了处理后24小时的开放划痕及开放划痕面积定量分析。划痕边界以红色标注。(B) 处理后开放划痕面积的定量分析。(C) 与侵袭性相关的基因。表达量以β-肌动蛋白为参照进行标准化（定量聚合酶链式反应）。数据为三次独立实验的代表性结果，以平均值±标准差表示。数据通过单因素方差分析及图基检验进行分析。不同字母表示存在统计学差异（p<0.05）

体内反应

为了评估正常或(I_{2})预处理的SK-N-BE（2）细胞的肿瘤植入和血管生成能力，在Tg（Fli1： EFGP）中生成异种移植物((Fli1:EFGP) ^{y 1})斑马鱼幼虫在48小时后受精。幼虫表现出绿色，荧光血管。细胞在标准条件下生长或补充400µM I2 96小时。将400至600个DiI标签细胞（红色）注入每个幼虫。结果显示，两个群体形成具有相似生长的异种移植物（通过密度测定法测量），但(I_{2})预处理的细胞表现出肿瘤血管生成的显着减少（图4）。

图4.斑马鱼中异种移植物密度与血管生成。斑马鱼幼虫中异种移植物大小（红色）和瘤内血管（绿色）（BVs）的代表性显微照片。将标准（对照组）和经400 µM (I_{2})预处理的SK-N-BE(2)细胞孵育96小时。将400至600个带有细胞外基质的DiI标记细胞皮下植入两日龄的Tg (Fli1:EFGP) ((Fli1:EFGP) ^{y 1})斑马鱼胚胎中。注射后三天，通过共聚焦显微镜分析异种移植物密度和瘤内血管。每个点代表一只独立的幼虫。(A,B) 斑马鱼幼虫中的血管。(C,D) 异种移植物密度（红色）。(E,F) 瘤内血管光密度分析（血管生成）。(Scale bar =100 mu m) (G) 受试者平均荧光强度。(H) 肿瘤中的血管面积百分比（相对肿瘤血管生成）。数据以均值±标准差表示，采用t检验分析；* * p<0.05

为分析细胞在体内的侵袭能力，将标准处理及(I_{2})预处理的SK-N-BE(2)细胞皮下植入两日龄野生型斑马鱼胚胎中。在图5中，两组的尾部区域均清晰可见红色DiI标记的细胞（荧光显微镜观察）。实验结果证实了这些神经母细胞瘤细胞的侵袭能力，定量分析显示(I_{2})预处理组的细胞数量显著减少。

图5. SK-N-BE(2)细胞在斑马鱼中的尾部迁移。尾部区域的代表性显微照片以及对照（(n=21)和(I_{2})预处理（400 µM）SK-N-BE(2)细胞(n=31)的定量分析（A）将400至600个DiI标记的细胞皮下植入野生型斑马鱼胚胎中，白色箭头指示斑马鱼中的神经母细胞瘤细胞。（B）96小时后分析尾部细胞的定量结果。每个点代表一条独立的幼鱼。数据以均值±标准差表示，采用Student’s t检验进行分析；* (^{*} p<0.05)

讨论

研究表明，(PPAR gamma) 激动剂可促进神经母细胞瘤细胞分化并抑制其生长，凸显了其治疗潜力。所有神经母细胞瘤细胞系均表达(PPAR gamma)，且分化细胞中的表达水平更高，这表明(P P A R gamma)在神经母细胞瘤细胞分化中发挥着积极作用。在2004年的一项研究中，塞尔维迪（Servidei）团队对8种不同表型的神经母细胞瘤细胞系（包括N型[神经母细胞型]和S型[基质型]细胞）中的两种(PPAR gamma)激动剂（15-脱氧-前列腺素J2和罗格列酮）进行了评估。这两种配体均能抑制所有细胞系的生长，且N型细胞表现出更高的敏感性，这可能是由于其对细胞凋亡的敏感性增强[29]。本研究结果显示，(I_{2})降低了SK-N-AS（基质型）和SK-N-BE(2)（神经母细胞型）细胞的存活率，证实了N型细胞的高敏感性。

MYCN 过表达与更具侵袭性的神经母细胞瘤（NB）及不良预后相关。本团队此前的研究表明，(I_{2}) 可降低小鼠神经母细胞瘤异种移植物中 MYCN 的表达，并提高 (PPAR gamma) 的表达。这些发现与我们的体外实验结果一致，即 (I_{2}) 能下调 MYCN 并上调 (P P A R gamma)。为探究 (PPAR gamma) 在 (I_{2}) 作用中的机制，我们使用了 (P P A R gamma) 拮抗剂 GW。有趣的是，即便在用 GW 抑制 (PPAR gamma) 后，(I_{2}) 仍能持续下调与侵袭性神经母细胞瘤相关的基因 MYCN 和 (TrkB)，这表明 (I_{2}) 可能部分通过不依赖于 (PPAR gamma) 的途径发挥作用。

为阐明 (I_{2}) 负调控 MYCN 的潜在机制，我们评估了其抗氧化作用。DCFDA 分析显示，添加 (I_{2}) 的组活性氧（ROS）水平更低，且 GW 不会改变这一作用。这些结果与既往研究一致，既往研究表明，在微摩尔浓度的碘作用下，兔和人类的 ROS 诱导性损伤会减轻，多种正常和癌变脊椎动物组织的脂质过氧化反应也会得到预防。生理水平的活性氧参与信号转导、基因表达和细胞增殖调控。而生理水平向病理生理水平的转变被称为氧化应激。氧化应激会损伤脂质、蛋白质以及核 DNA 和线粒体 DNA，还参与促成癌变发生的表观遗传修饰过程。表观遗传修饰包括甲基化酶、去甲基化酶和非编码RNA。MIAT是一种长链非编码RNA，最初在心肌梗死患者中被发现，在包括神经母细胞瘤在内的多种正常组织和癌组织中，其会因氧化应激而过表达。侵袭性神经母细胞瘤表现出MIAT过表达，且仅在MYCN扩增的细胞中，沉默MIAT可诱导细胞死亡。本研究表明，(I_{2})补充剂显著降低了活性氧水平和MIAT表达量，这与MYCN和原肌球蛋白受体激酶B表达的下降相关。如前所述，MYCN是调控干细胞增殖、迁移和稳态的关键主基因，在正常情况下，其表达会在神经元终末分化过程中降低，但持续过表达与化疗耐药性和侵袭性相关。此外，MYCN可直接调控原肌球蛋白受体激酶B的过表达，而这与不良预后和化疗耐药性相关。

关于与(PPAR gamma)相关的基因，我们的研究结果显示，(I_{2})补充剂显著提高了(PPAR gamma)的RNA和蛋白质水平，同时也提升了FasN和TrkA的表达，这表明(I_{2})能够促进细胞分化。脂肪酸合酶是由FasN基因编码的一种酶，其主要功能是催化脂肪酸合成；尽管在某些情况下可作为促肿瘤因子发挥作用，但它也参与细胞分化过程。由于(P P A R gamma)可直接调控FasN的表达，这进一步证实了(I_{2})能够激活这些受体的观点。

就神经营养酪氨酸激酶受体（Trks）而言，TrkA 以及 (TrkB) 均属于受体酪氨酸激酶家族，且在神经元发育的调控过程中发挥关键作用。在侵袭性神经母细胞瘤（NB）中，TrkA 的表达水平显著降低，且与 MYCN 扩增呈负相关。有研究表明，在自发消退的 IV-S 期神经母细胞瘤患者以及分化良好的神经母细胞瘤患者体内，TrkA 表达水平均有所升高。此外，在 PC12 细胞分化过程中，TrkA 与 (PPAR gamma) 发生相互作用，进而实现彼此的激活。

另一个目标基因是Aurka。Aurka编码极光丝氨酸-苏氨酸激酶A，该激酶在中心体成熟与分离、纺锤体组装以及细胞周期调控中发挥关键作用。Aurka作为神经母细胞瘤（NB）治疗靶点的重要性源于其双重功能：有丝分裂过程中的催化活性，以及不依赖于激酶的功能，尤其是对MYCN蛋白的稳定作用。Aurka表达水平升高与患者总体生存率降低相关，且在小鼠异种移植模型中，靶向Aurka的治疗可抑制细胞生长、降低MYC蛋白水平并抑制肿瘤生长。此外，Aurka的表达依赖于(PPAR gamma)的激活。本研究结果显示，补充(I_{2})可降低Aurka的表达，同时证实了其对(PPAR gamma)的依赖性（该因子已由GW取消）。此外，在我们的(I_{2})样本中观察到的MYCN蛋白含量极低（蛋白质印迹法），这与Aurka在MYCN蛋白稳定性中的关键作用相符。

采用划痕愈合实验对SK-N-BE(2)细胞的体外侵袭能力进行分析，结果显示(PPAR gamma)预处理的细胞运动能力有所下降。这一效应似乎部分由(PPAR gamma)的激活所介导。值得注意的是，N-钙粘蛋白的表达完全依赖于719eaa7a-c15e-4891-970b-240df4ed716e，这一现象进一步证实了这种部分调控作用，而血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达似乎仅部分依赖于该通路。钙粘蛋白是一个庞大的粘附分子超家族，包含80多个成员，其中上皮性（E）钙粘蛋白和神经性（N）钙粘蛋白的研究最为广泛。E-钙粘蛋白主要在上皮细胞中表达，促进细胞间粘附；而N-钙粘蛋白主要表达于神经组织和成纤维细胞中。N-钙粘蛋白在早期胚胎发育过程中的神经嵴细胞迁移中发挥关键作用。在神经恶性肿瘤中，转移进展通常与E-钙粘蛋白的缺失和N-钙粘蛋白的从头表达相关，这一现象被称为“钙粘蛋白转换”，它有助于上皮-间质转化（EMT）的建立。尽管(P P A R gamma)在神经母细胞瘤（NB）中N-钙粘蛋白表达中的作用仍未得到充分探索，已有多项研究报道了在多种癌症类型中，PPARγ 可介导抑制 TGF-β 诱导的上皮间质转化。关于血管内皮生长因子 A（VEGFA），我们的研究结果与已被充分证实的结论一致，即 MYCN 在正常组织和肿瘤组织中均直接参与血管内皮生长因子 A 的过表达。

最后，我们利用斑马鱼异种移植模型，在体内评估了(I_{2})预筛选细胞相对于对照细胞的血管生成和侵袭潜力（尾部迁移）。两组的植入率相当；然而，(I_{2})预处理细胞诱导肿瘤内血管生成的能力降低（50%），尾部迁移能力也下降（38%），这表明其侵袭性潜力更低。我们意识到斑马鱼异种移植模型存在一个潜在的与温度相关的局限性，即温度不匹配问题鱼类宿主和哺乳动物肿瘤细胞（因为人类细胞是在28摄氏度而非其生理温度下培养的）。尽管如此，斑马鱼模型已被广泛认可并验证用于转移和癌症药理学研究。哺乳动物癌细胞通常在37摄氏度时表现出最佳增殖活性，而在较低温度（如28摄氏度）下，其增殖能力会下降，尽管它们的血管生成和转移/侵袭潜力似乎并未发生显著改变。在另一方面，鱼类生长的最适温度约为26–28摄氏度。将温度升高至30摄氏度以上会使生物体产生应激反应，同时伴随代谢功能障碍和明显的畸形。为解决这一局限性，许多研究在评估肿瘤细胞行为（如血管生成和短期侵袭（48-72小时））时，优先维持宿主生物的生理状态。本研究中，我们采用28摄氏度的温度以优先保障鱼类福利。因此，在(I_{2})预处理细胞中观察到的血管生成和侵袭能力降低，更可能是由处理本身导致，而非宿主微环境的差异所致。此外，在体外划痕实验（37摄氏度）中观察到的一致抑制效应尾部迁移（28摄氏度）这一现象支持了这样一种观点，即(I_{2})的抗侵袭作用在这些温度条件下均能保持。

结论

分子碘可诱导基因重塑，通过直接抗氧化作用以及依赖于(PPAR gamma)的通路，降低中高危神经母细胞瘤细胞的增殖和侵袭潜能。这种一致的有益效应支持将(I_{2})补充剂作为神经母细胞瘤常规疗法的辅助手段。

材料与方法

试剂

升华碘购自麦克林-安万特公司（美国宾夕法尼亚州森特瓦利市），其浓度通过硫代硫酸钠滴定法进行验证。过氧化物酶体增殖物激活受体γ特异性拮抗剂GW9662（简称GW）购自西格玛-奥德里奇公司（美国密苏里州圣路易斯市），激动剂罗格列酮（简称RGZ）购自凯曼化学公司（美国加利福尼亚州洛杉矶市）。速溶DiI™油红染料（简称DiI，货号D3899）购自赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）。N-苯基硫脲（简称PTU，货号P7629-10G）和3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（货号A5040-25G）购自西格玛-奥德里奇公司（美国密苏里州圣路易斯市）。2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（简称H2DCFDA，货号HY-D0940）购自美迪西化学公司（美国新泽西州蒙茅斯章克申市）。过氧化氢（货号56001）购自费蒙特公司（墨西哥新莱昂州蒙特雷市）。

细胞培养

人神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS（CRL-2137）和SK-N-BE(2)（CRL-2271）购自美国模式培养物集存库（美国弗吉尼亚州马纳萨斯市）。培养基添加了10%胎牛血清（FBS）和2%青霉素-链霉素，二者均来自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英潍捷基公司，细胞培养在湿度饱和的培养箱中，培养条件为37℃、5%二氧化碳和95%空气。在斑马鱼实验中，按照制造商的说明，实验前一天用4微克/毫升的DiI对SK-N-BE(2)细胞进行标记。

细胞活力

将50,000个细胞/孔接种于24孔板中。24小时后，加入400微摩尔的(I_{2})处理96小时。在(GW/I)（0.5微摩尔）和GW/RGZ（0.1微摩尔）组中，在(I_{2})或RGZ处理前2小时给予GW处理。处理结束后，通过台盼蓝排斥试验在血细胞计数板上结合光学显微镜检测细胞活力；结果以相对于对照组的倍数变化表示。所有实验均进行三次重复。

基因表达

采用RT-qPCR技术对SK-N-BE(2)细胞中的MYCN、MIAT、VEGFA、TrkA、TrkB、N-钙粘蛋白、波形蛋白、极光激酶A（Aurka）、脂肪酸合成酶（FasN）以及β-肌动蛋白进行了分析。简要来说，使用Trizol试剂（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Life Technologies公司）提取总RNA。以2微克RNA为模板，利用寡聚脱氧胸苷（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市Invitrogen公司）进行逆转录（RT）。采用SYBR Green作为DNA扩增标记物，在Rotor-Gene 3000序列检测系统（澳大利亚新南威尔士州莫特莱克市Corbett Research公司）上进行实时PCR检测（基因特异性引物见表1）。将mRNA相对表达水平以β-肌动蛋白的mRNA水平作为参照进行标准化处理。

抗氧化检测

每孔接种5000个细胞至96孔板中。在相应组中，于添加400微摩尔I2前2小时给予GW处理，随后将细胞培养96小时。根据制造商的操作流程，采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFDA）染色法对活性氧（ROS）水平进行定量分析。向培养板中加入5微摩尔DCFDA，于37℃避光条件下孵育30分钟。以100微摩尔过氧化氢作为阳性对照。使用Varioskan LUX多功能微孔板读板机（赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）测定荧光强度。数据以相对于对照组细胞的最大DCFDA荧光水平表示。

表1. 寡核苷酸序列

伤口愈合实验

  将100,000个细胞接种至12孔板中，在标准条件下培养至汇合度达80%。随后用200微升移液器枪头在每孔中制造划痕，并用磷酸盐缓冲液洗涤孔板以去除脱落的细胞。更换为添加5%胎牛血清的新鲜培养基，并向每孔中加入相应的处理试剂。在划痕处理后0小时和24小时拍摄照片。采用ImageJ 1.54软件（美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院）分析划痕开放面积。

蛋白质印迹法

采用化学发光法对神经母细胞瘤细胞系中的MYCN和PPARγ蛋白进行蛋白质印迹分析。简要操作如下：每孔上样25微克蛋白，经12%丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜（美国加利福尼亚州赫尔克里士市Bio-Rad公司）。使用含5%脱脂奶粉的Tris-吐温-20缓冲盐溶液对非特异性反应进行2小时封闭。随后用针对MYCN的多克隆抗体（B8.4.B，货号sc-53993，美国加利福尼亚州洛杉矶市圣塔克鲁兹生物技术公司）和PPARγ的多克隆抗体（货号SAB5700625，美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司）处理膜片。二抗分别使用山羊抗小鼠HRP（货号62-6520）和山羊抗兔HRP（货号65-6120，均为美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市Invitrogen公司产品）。采用Bio-Rad公司的Clarity Western ECL化学发光底物进行蛋白显色。使用Image (Lab^{TM})（Bio-Rad公司）对印迹膜进行成像观察。

斑马鱼异种移植模型

野生型斑马鱼胚胎在E3胚胎培养基中于28摄氏度培养每升含：0.286克氯化钠、0.0126克氯化钾、0.048克氯化钙(CaCl_{2} cdot 2 H_{2} O)以及0.081克(MgSO_{4} cdot 7 H_{2} O)（pH值7.2），并补充0.2毫摩尔的苯硫脲。细胞按先前描述的方法[28]进行标记。将DiI标记的SK-N-BE(2)细胞注射到两日龄斑马鱼幼虫的卵周隙中。幼虫在E3/苯硫脲培养基中于28摄氏度培养，三天后分析癌细胞向尾静脉丛的扩散情况。在尼康（日本东京）光/荧光显微镜（10×/0.30倍放大）下对斑马鱼幼体进行拍照。肿瘤血管生成实验中，将DiI标记的细胞注射到两天龄的转基因Tg(Fli1:EFGP) (Tg( Flii1:EFGP )^{y 1})斑马鱼幼体的卵黄周隙中，该幼体的血管内皮细胞表达绿色EGFP蛋白，使用80%的基质胶如前文所述。将幼虫置于28摄氏度的E3/PTU培养基中孵育72小时，在4%多聚甲醛中固定过夜，并用含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚的抗褪色试剂封片。所有实验均使用至少三个独立斑马鱼批次的幼虫进行。使用来自美国新泽西州牛顿市Thor Labs公司的正置共聚焦显微镜采集原发性肿瘤和肿瘤内血管的Z轴堆叠图像。使用美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院的ImageJ 1.54软件对肿瘤内血管生成的百分比进行定量分析。