标题：Developmental toxicity and potential mechanisms of pyraoxystrobin to zebrafish (Danio rerio)

期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2017.12.061 

摘要

作为一种新型高效的嗜球果伞素类杀菌剂，吡氧噻菌酯已被报道对部分水生生物具有高毒性。然而，吡氧噻菌酯对鱼类不同生命阶段的毒性及其潜在作用机制仍不明确。因此，本研究评估了吡氧噻菌酯对斑马鱼不同生命阶段（胚胎、幼鱼和成鱼）的急性毒性，还探究了吡氧噻菌酯对斑马鱼胚胎的发育毒性及其对胚胎基因转录的影响。结果显示，吡氧噻菌酯对受精后2小时（hpf）的胚胎、孵化后12小时（hph）的幼鱼（受精后84小时）、孵化后72小时（hph）的幼鱼（受精后144小时）以及成年斑马鱼的96小时半数效应浓度（(LC50)）值分别为4.099、1.069、3.236和5.970微克/升。这表明吡氧噻菌酯对斑马鱼不同生命阶段均具有极高毒性，而新孵化的幼鱼是斑马鱼对吡氧噻菌酯最敏感的生命阶段。斑马鱼胚胎经不同浓度吡氧噻菌酯急性暴露后，出现心率下降、孵化抑制、生长迟缓和形态畸形等现象。胚胎的畸形率随暴露时间和浓度增加而升高，其中最显著的异常为心包水肿和卵黄囊水肿。2和4微克/升的吡氧噻菌酯显著改变了斑马鱼胚胎中线粒体呼吸链与ATP合成相关基因（NDI、uqcrc、ATPo6）、氧化应激相关基因（Mn-Sod、Cat、Gpx）、凋亡相关基因（p53、Bcl2、Bax、Cas3）以及免疫系统相关基因（TNFα、IFN、IL-1b）的mRNA表达水平。该结果表明，这些基因表达的改变是吡氧噻菌酯对斑马鱼产生毒性作用的潜在机制。

引言

吡唑醚菌酯是由沈阳化工研究院研发的一种新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，已在中国和美国获得专利（Chen 等人，2015；Yang 等人，2014）。研究表明，吡唑醚菌酯在土壤中的降解半衰期较短（2.6–2.7 天），在 pH 4 和 pH 7 的水中性质稳定，在 pH 9（25 ℃）的水中半衰期为 577.5 天（Chen 等人，2015；Liu 等人，2010）。吡唑醚菌酯对真菌的作用分子机制是通过阻断细胞色素c还原酶的泛醇氧化位点（Qo）上细胞色素b与细胞色素c1之间的电子传递，从而抑制线粒体呼吸（Bartlett 等人，2002；Hnatova 等人，2003）。吡唑醚菌酯对多种真菌病原菌具有高效活性，如子囊菌亚门、半知菌亚门和鞭毛菌亚门的病原菌（Li 等人，2011）。吡唑醚菌酯对雄性大鼠的急性经口半数致死剂量为 1000 毫克/千克，对雌性大鼠为 1022 毫克/千克，这表明其对哺乳动物毒性较低（Liu 等人，2011）。

截至目前，关于吡氧菌酯的研究主要集中在其环境行为（Liu 等人，2012）、杀菌活性（Chen 等人，2011）以及分析方法（Lin 等人，2015）上，而对其对环境生物的毒性关注极少。已有研究表明，许多甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对鱼类具有高毒性，例如，嘧菌酯、吡唑醚菌酯和吡氟酰草胺对斑马鱼的96小时半致死浓度分别为0.393、0.0635和0.212毫克/升（Liu 和 Zhu，2015）；肟菌酯、嘧菌酯和苯氧菌酯对草鱼幼鱼的48小时半致死浓度分别为0.051、0.338和0.549毫克/升（Liu 等人，2013）。Chen 等人（2015）的研究指出，吡氧菌酯对非靶标水生生物具有高毒性，例如，吡氧菌酯对斑节对虾和青鳉的96小时半致死浓度分别为35.10和1.22微克/升（Chen 等人，2015）。然而，吡氧菌酯对鱼类不同生命阶段的毒性尚未得到研究。

一些先前的研究报道了嘧菌酯类物质对鱼类产生毒性的潜在机制。韩等人（2016年）报道长期暴露于嘧菌酯会导致斑马鱼肝脏中活性氧（ROS）积累、抗氧化酶活性改变、脂质过氧化物生成以及DNA损伤。Liu等人（2013）的研究表明，肟菌酯、嘧菌酯和醚菌酯会诱导草鱼幼鱼发生氧化损伤，并改变与生长及能量相关基因的表达。以往研究还证实，部分甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂会对鱼类造成内分泌干扰（Cao等人，2016b；Zhu等人，2013）。尽管线粒体呼吸链可能是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在鱼类体内的潜在作用靶点，但目前尚无关于此类杀菌剂对非靶标生物线粒体功能毒性效应的研究报道。此外，已有研究证明线粒体在氧化应激和细胞凋亡的发生过程中发挥重要作用（Cadenas & Davies，2000；Green & Reed，1998），而这一过程又可能影响免疫系统的组成（Livingstone，2001）。目前，越来越多的研究开始关注环境化学品诱导的氧化应激、细胞凋亡及免疫毒性相关基因的表达情况。例如，氰氟草酯丁酯可能诱导斑马鱼胚胎细胞发生氧化应激和凋亡（Zhu等人，2015）。顺式联苯菊酯则会在斑马鱼体内诱导氧化应激、凋亡及免疫毒性相关基因的转录（Jin等人，2013）。

本研究探究了唑胺菌酯对斑马鱼不同生命阶段的急性毒性，以及唑胺菌酯对斑马鱼胚胎中线粒体呼吸链和三磷酸腺苷（ATP）合成、氧化应激、细胞凋亡及固有免疫反应相关基因表达的影响。本研究结果有助于明确唑胺菌酯对鱼类不同生命阶段的毒性，并为揭示其对胚胎发育的潜在毒性机制提供思路。

结果

溶剂效应

本研究中溶剂对照组与空白对照组的各项指标均未发现显著差异。因此，本研究将溶剂对照组的实验数据作为对照进行统计分析。

化学分析

校准曲线在0.5-10克/升((R^{2}=0.9997))范围内呈现良好的线性关系，检测限（LOD）为0.5微克/升（图S1）。对水样中吡唑醚菌酯分别进行1、5和10微克/升的加标实验，其平均回收率在88.50%至107.07%之间，相对标准偏差（RSD）为2.35%-3.54%((n=3))表S2）。实验结果表明，该方法具有令人满意的精密度和准确度，可用于吡唑醚菌酯的检测。

化学分析结果显示，24小时内吡唑醚菌酯的标称浓度与实际浓度的偏差均低于20%（表S3）。根据经济合作与发展组织（OECD）的指导原则（OECD, 1992, 2006），由于所有测试溶液均每日更换，因此本研究中吡唑醚菌酯的标称剂量即为其实际浓度。

吡唑醚菌酯对斑马鱼的急性毒性

急性毒性试验结果表明，吡唑醚菌酯对斑马鱼具有高毒性，其96小时半数致死浓度（96-h (LC_{50})）对斑马鱼胚胎、12小时龄幼虫、72小时龄幼虫和成体的数值分别为4.099、1.697、3.236和5.970微克/升（表1）。斑马鱼不同生命阶段对吡唑醚菌酯的致死敏感性依次为：12小时龄幼虫 > 72小时龄幼虫 > 胚胎 > 成体。

吡唑醚菌酯对胚胎发育的影响

对照组与处理组胚胎在20秒内的自发运动次数无显著差异（图1a），且在4.22和5.08微克/升处理组中未观察到胚胎的自发运动。胚胎的心率随吡氧嘧菌酯浓度的升高而降低。2.90微克/升的吡氧嘧菌酯在48小时胚胎期显著抑制了20秒内的心跳次数。在72小时胚胎期，对照组胚胎20秒内的心率为60.33±0.41次，而5.08微克/升吡氧嘧菌酯暴露组仅为25.6±3.2次（图1b）。同时，检测到了心律失常现象在暴露于浓度为2.90微克/升及以上的吡氧噻菌酯的组别中也观察到了这一现象。暴露于不同浓度的吡氧噻菌酯96小时后，检测到了不同程度的孵化抑制。2.03微克/升吡氧噻菌酯处理组的孵化率与对照组相似；然而，2.44微克/升吡氧噻菌酯处理组的孵化率与对照组相比下降了20%。同时，5.08微克/升吡氧噻菌酯处理组未观察到孵化现象（图1c）。此外，用2.90微克/升或更高浓度的吡氧噻菌酯处理后，96小时pf时孵化幼虫的体长显著降低（图1d）。4.22和5.08微克/升吡氧噻菌酯处理组的孵化幼虫体长未被展示，因为这两个浓度下的胚胎几乎不孵化或孵化率为零。

图1. 吡氧噻菌灵对斑马鱼胚胎的发育影响。a. 24小时受精后（hpf）20秒内的自发运动次数（各浓度对应((n=18))）。b. 48和72小时受精后（hpf）20秒内的心跳次数（各浓度对应(n=18)）。c. 96小时受精后（hpf）胚胎的孵化率（各浓度对应(n=60)）。d. 96小时受精后（hpf）幼鱼的体长（各浓度对应(n=18)）。星号表示处理组与对照组之间存在显著差异（通过Dunnett事后比较检验确定，*对应(^{*} p<0.05)、(^{* *} p<0.01)、(* * * p<0.001)）。误差棒表示标准差（SD）。

吡唑醚菌酯引发的致畸效应

吡氧酯在胚胎发育过程中诱导了一系列形态异常（图2），包括心包水肿、卵黄囊水肿、生长迟缓、色素沉着缺陷以及脊柱畸形。吡氧菌酯导致的最明显畸形是心包水肿，在72小时胚胎阶段，当吡氧菌酯浓度为2.90微克/升时，该症状明显出现。值得注意的是，与72小时胚胎阶段相比，在较低浓度（2.03–3.51微克/升）的吡氧菌酯处理下，96小时胚胎阶段的心包水肿率略有下降。然而，在4.22和5.08微克/升吡氧菌酯处理组中，心包水肿的百分比呈时间依赖性增加，在96小时胚胎阶段，与对照组相比，这两个浓度下的心包水肿率分别达到约60%和70%（图3a）。吡氧菌酯导致的另一明显畸形是卵黄囊水肿，在96小时胚胎阶段，当浓度为3.51微克/升时，该症状明显出现。此外，在较高浓度的吡氧菌酯处理下，96小时胚胎阶段的卵黄囊水肿率较72小时胚胎阶段有所降低。例如，在吡氧菌酯浓度为5.08微克/升时，卵黄囊水肿率从72小时胚胎阶段的90%降至96小时胚胎阶段的57%（图3b）。

吡氧醚菌酯对基因表达的影响

为进一步探究吡氧菌酯对斑马鱼胚胎的毒性作用机制，本研究检测了线粒体呼吸链与ATP合成相关基因、氧化应激相关基因、凋亡相关基因以及先天免疫系统相关基因的转录水平。结果显示，吡氧菌酯暴露显著改变了线粒体呼吸链和ATP合成相关基因的mRNA表达水平。在4 μg/L吡氧菌酯暴露组中，NDI1和ATP6的转录水平显著上调，分别增加了2.2倍和1.6倍；而与对照组相比，2 μg/L和4 μg/L吡氧菌酯处理组中uqcrc基因的mRNA水平分别下降了55%和85%。对于COXI基因，吡氧菌酯暴露后未观察到显著表达变化（图4a）。

暴露于吡唑醚菌酯后，与氧化应激相关的基因表达发生了显著改变。如图4b所示，在2和4微克/升吡唑醚菌酯暴露下，Mn-sod基因表达呈现浓度依赖性上调，相较于对照组分别增加了2.1倍和3.0倍。此外，Gpx基因的mRNA水平在处理组中也显著上调经2微克/升吡唑醚菌酯处理后基因表达上调，而经4微克/升吡唑醚菌酯处理后则下调。然而，在暴露于2和4微克/升吡唑醚菌酯后，过氧化氢酶（Cat）的mRNA表达显著下调，分别比对照组降低了40%和80%。

暴露于吡唑醚菌酯96小时后，参与凋亡信号传导过程的p53、Caspase-3、Bax和Bcl2的mRNA水平显著下降。此外，在2μg/L和4μg/L吡唑醚菌酯处理组中均观察到p53和Bax的下调；而Caspase-3与Bcl2的表达仅在4μg/L吡唑醚菌酯处理组中受到抑制（图4c）。

吡氧酯暴露也改变了与先天免疫系统相关的基因表达（图4d）。与对照组相比，4 μg/L浓度的吡氧酯处理显著上调了(IL-1b)和IFN的mRNA水平，分别增加了2.2倍和3.8倍。同时，与对照组相比，2 μg/L吡氧酯处理组中TNFа的转录水平上调了1.5倍，而4 μg/L吡氧酯处理组中TNFа的转录水平则下降了40%。

图4. 吡氧噻菌灵暴露后斑马鱼胚胎中线粒体呼吸链、氧化应激、细胞凋亡及免疫相关基因的mRNA表达（(n=3) 重复样本）。a. NDI、uqcrc、COXI、ATPo6的相对mRNA水平。b. Mn-sod、Cat、Gpx的相对mRNA水平。c. p53、Cas3、Bax、Bcl2的相对mRNA水平。d. IL1b、IFN、TNFa的相对mRNA水平。星号表示处理组与对照组之间存在显著差异（通过Dunnett事后比较法确定，* (^{*} p<0.05) (^{*} p<0.01)、(^{*}^{*} p<0.001)）。误差线表示标准差（SD）。

讨论

本研究评估了吡唑醚菌酯对斑马鱼不同生命阶段的急性毒性。结果明确表明，吡唑醚菌酯对斑马鱼所有被测生命阶段均具有高毒性。吡唑醚菌酯对成年斑马鱼的96小时半数致死浓度为5.97微克/升，这与陈等人（2015年）的研究报道结果相近。通过对比吡唑菌胺、嘧菌酯和啶氧菌酯对成年斑马鱼的96小时半数致死浓度（分别为0.0635、0.393和0.212毫克/升），发现吡唑醚菌酯对斑马鱼表现出更高的毒性水平。

确定最敏感的时期有助于保护水生生物免受外界有毒物质的干扰（纽曼和昂格尔，2002）；因此，在制定科学的保护方法之前，通过多阶段毒性测试发现生物最脆弱的阶段至关重要。鱼类的早期生命阶段在接触化学品时通常比成鱼阶段更敏感（莱莱和克龙，1996；韦斯特恩哈根，1988），但鱼胚胎和仔鱼之间也存在差异。杨等（2016b）报道，噻氟酰胺对斑马鱼胚胎的毒性高于对仔鱼的毒性，而曹等（2016a）则证实斑马鱼仔鱼对氰氟草酯丁酯的敏感性高于胚胎。本研究表明，斑马鱼对吡氧菌酯最敏感的阶段是孵化后12小时的仔鱼，其次是孵化后72小时的仔鱼、胚胎和成鱼，这表明初孵仔鱼（孵化后12和72小时的仔鱼）对吡氧菌酯的敏感性高于胚胎。穆等（2013）也报道了类似结果，他们发现斑马鱼仔鱼对苯醚甲环唑的敏感性高于胚胎和成鱼。斑马鱼仔鱼具有较高敏感性的可能原因如下：首先，与胚胎不同，初孵仔鱼缺乏卵壳，而卵壳是抵御接触水中化学品的保护屏障（恩布里等，2010）；其次，孵化后12和72小时的仔鱼的解毒机制发育不完全（戈麦斯-雷奎尼等，2010；帕里奇等，2009）；最后，孵化后12和72小时的仔鱼仅具有先天免疫这是因为斑马鱼的适应性免疫系统在受精后4至6周才会形成（诺沃亚、菲格雷斯，2012）。

本研究中，暴露于吡氧醚菌酯会引发多种发育异常，如孵化抑制、心率下降、生长抑制以及形态畸形。在各类畸形中，最显著的形态改变是心包水肿和卵黄囊水肿。在暴露于氰氟草酯（朱等，2015）、苯醚甲环唑（穆等，2013）和嘧菌酯（曹等，2016a）等环境毒物的斑马鱼胚胎中也有类似研究结果报道。

心脏是斑马鱼发育过程中第一个形成功能的器官，心率也是鱼类胚胎毒性测试中的重要毒理学终点（Glickman 和 Yelon，2002；OECD，2006）。本研究结果显示，吡氧嘧菌酯对斑马鱼胚胎的心率具有显著抑制作用。其他嗜球果伞素类杀菌剂（三氟敏、嘧菌酯和醚菌酯）对草鱼幼鱼的影响也得到了类似结果（Liu 等人，2013），此外噻氟酰胺（Yang 等人，2016b）、氰氟草酯（Zhu 等人，2015）和异菌脲（Jin 等人，2016）等农药也有类似报道，这表明暴露于有毒物质后，心率改变可能是鱼类胚胎的一种普遍反应。此外，暴露于吡氧嘧菌酯会导致发育中的胚胎出现明显的心包水肿，在5.08 μg/L处理组中，96小时胚胎阶段的心包水肿率高达约70%。该结果表明，发育中的心脏可能是吡氧嘧菌酯在斑马鱼体内产生毒性的重要靶器官。心肌细胞需要大量的三磷酸腺苷（ATP）来维持持续耗能的收缩状态，而细胞内能量的主要来源是线粒体。以往研究表明，直接与电子传递链相互作用的药物会诱导线粒体心肌功能障碍，进而导致心肌功能异常（Kuzmicic 等人，2011；Varga 等人，2015）。本研究中，暴露于吡氧嘧菌酯会显著提高NDI和ATPo6的mRNA表达水平，并抑制uqcrc的表达，这三个基因分别是编码线粒体复合体I、V和III的关键基因。这表明吡氧菌酯可能会干扰斑马鱼胚胎线粒体中的电子传递链和ATP合成。Yang等人（2016b）报道，暴露于噻氟酰胺——一种琥珀酸脱氢酶（SDH）合成抑制剂——会显著改变线粒体复合物相关基因的表达，改变SDH的活性，最终导致线粒体结构损伤和线粒体功能障碍。因此，我们推测吡氧菌酯可能通过破坏斑马鱼胚胎心肌细胞的线粒体电子传递链，干扰其能量合成，进而进一步诱发心脏功能障碍，伴随心包水肿、心率降低和心律失常的发生。据我们所知，这是首次将线粒体呼吸链和ATP合成相关基因的表达作为嗜球果伞素类杀菌剂对水生生物毒性作用的潜在机制进行研究。

值得注意的是，4.22和5.08 μg/L吡氧菊酯暴露组胚胎的卵黄囊水肿率，以及较低浓度（2.03–3.51 μg/L）处理组的心包水肿率，在斑马鱼胚胎孵化成幼体后均有所下降。Fraysse等人（2006年）也报道过类似结果，他们发现，在48小时胚胎期（hpf）用0.8、1.5、3和6 μM马拉硫磷处理后检测到的斑马鱼胚胎水肿，仅在80 hpf时的最高浓度下可观察到。其可能原因是斑马鱼胚胎发育过程中免疫力的增强缓解了一些轻微的非致死性畸形。

线粒体是活性氧（ROS）的主要细胞内来源（Turrens, 2003）。线粒体受损时会出现活性氧的异常生成（Murphy, 2009），这可被视为氧化损伤的重要信号（Barzilai 和 Yamamoto, 2004; Valko 等人, 2007）。升高的活性氧水平随后可被超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等抗氧化酶清除，这些酶将超氧阴离子((O_{2}))转化为(H_{2} O_{2})，再进一步转化为(H_{2} O)和(O_{2})（Valavanidis 等人, 2006; Zhang 等人, 2009）。因此，检测SOD、CAT、GPx等抗氧化酶的活性变化被认为是判断氧化应激的有效方法。Liu等人（2013）研究发现，嘧螨酯、嘧菌酯和醚菌酯可通过降低草幼鱼体内SOD活性、升高CAT和过氧化物酶（POD）活性，削弱其抗氧化防御系统并加剧氧化应激。尽管基因表达的改变并不意味着蛋白表达发生变化，但在大多数情况下，基因的表达趋势与相应蛋白的表达趋势一致（Jiang 等人, 2016; Yang 等人, 2016a）。编码抗氧化蛋白的基因表达也被用于监测化学污染物的影响（Sheader 等人, 2006; Woo 等人, 2009）。Jiang等人（2016）报道，丙草胺暴露可提高斑马鱼胚胎发育过程中抗氧化蛋白的活性及对应基因（如SOD、CAT、GPX）的转录水平，表明丙草胺可诱导斑马鱼胚胎发育阶段的氧化应激。抗氧化酶的转录和积累增加可能有助于清除丙草胺诱导产生的活性氧。本研究中，2和4 μg/L的吡氧嘧菌酯显著诱导Mn-sod的mRNA表达，分别上调2.1倍和3.0倍；2 μg/L的吡氧嘧菌酯还诱导Gpx的mRNA表达上调1.4倍，这提示机体可能诱导这两种酶的含量或活性升高，以清除吡氧嘧菌酯引发的超氧自由基。然而，两种浓度的吡氧嘧菌酯均显著抑制Cat的转录，4 μg/L浓度的吡氧嘧菌酯还抑制了Gpx的转录。此前部分研究也报道了类似结果（Ahmad 等人, 2000; Ansari 和 Ansari, 2014; Crestani 等人, 2007; Kubrak 等人, 2010; Liu 等人, 2008）。Ansari和Ansari（2014）指出，斑马鱼接触乐果后，CAT活性呈剂量依赖性显著下降，他们认为CAT活性降低可能是由于(H_{2} O_{2})过量生成导致反应速率下降所致这可能是由超氧阴离子自由基的通量导致的，该通量可能会抑制过氧化氢酶（CAT）的活性。Jin 等人（2015）的研究表明，暴露于较高浓度的毒死蜱后，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的活性会下降，这可能是由其他抗氧化酶的消耗所引起的。Ansari 和 Ansari（2014）提出，酶活性的升高或降低与细胞损伤的程度相关。基于上述研究结果，我们推测暴露于吡氧菊酯（尤其是较高浓度时）可能会对斑马鱼胚胎造成严重的细胞损伤，进而导致超氧阴离子自由基的过量产生以及过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性的抑制。不过，不同抗氧化酶对农药的敏感性可能存在差异。为验证这一推测，仍需在酶水平开展进一步的研究。

细胞凋亡作为细胞内在的死亡程序，可通过靶向清除单个细胞来维持组织稳态，且不会破坏组织的生物学功能（Schattenberg 等人，2006）。以往研究表明，线粒体在细胞凋亡的调控中发挥着关键作用（Fan 等人，2001）。线粒体功能障碍会破坏细胞内环境稳定（Green 和 Reed，1998），进而引发疾病的发生。例如，诱导细胞凋亡会导致器官功能不全，抑制细胞凋亡则会引发组织增生和癌症（Yazici 等人，2009）。大多数细胞凋亡信号传导过程与凋亡相关分子的变化有关，如 p53、Bcl-2/Bax 以及细胞色素 c，这些分子变化会进一步激活半胱天冬酶（caspase），最终诱导细胞凋亡（Zhao 等人，2009）。  近年来，环境污染物诱导斑马鱼凋亡相关基因 mRNA 表达水平变化的相关研究已广泛开展（Deng 等人，2009；Shi 等人，2008；Zeng 等人，2014）。Zhu 等人（2015）研究发现，氰氟草酯暴露 96 小时后，可显著诱导斑马鱼胚胎中 p53、Puma、Cas3 和 Cas9 的 mRNA 表达，并降低 Bcl-2/Bax 的比值。这表明氰氟草酯通过激活 p53 诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡，而 p53 可直接诱导促凋亡蛋白（Puma、Bax）编码基因的转录，进而激活细胞凋亡的关键执行因子（Cas3），最终诱导细胞凋亡和胚胎畸形。  本研究中，斑马鱼胚胎暴露于 4 μg/L 吡氧嘧菌酯 96 小时后，与对照组相比，p53、Cas3、Bax 和 Bcl2 的表达量分别下降了 77%、47%、73% 和 50%，说明吡氧嘧菌酯干扰了斑马鱼细胞凋亡的正常进程。斑马鱼适应外源性毒物诱导的不同刺激的潜在机制。有必要进一步研究免疫相关基因不同变化背后的机制。

结论

综上所述，本研究证实吡氧噻菌酯对斑马鱼的多个发育阶段均具有高急性毒性，其中12小时龄的仔鱼是最敏感的时期。研究观察到吡氧噻菌酯在斑马鱼胚胎发育过程中产生了负面影响，表明其可诱导发育毒性。这些结果提示，即使是低剂量的吡氧噻菌酯施用，也可能对水生环境中的鱼类构成风险。基因表达检测结果表明，线粒体呼吸链与ATP合成相关基因、氧化应激相关基因、细胞凋亡相关基因以及免疫系统相关基因的mRNA水平发生改变，可能是吡氧噻菌酯对斑马鱼胚胎产生毒性作用的潜在机制。不过，仍需进一步研究以阐明吡氧噻菌酯对斑马鱼毒性作用的潜在机制。

材料与方法

化学品与试剂

吡氧酯菌酯（CAS：862588-11-2，纯度95%）由沈阳化工研究院提供。用丙酮（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）配制100毫克/升的吡氧酯菌酯母液，并加入0.5%（体积比）吐温-80（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）作为助溶剂。在暴露试验中，使用含0.5%（体积比）吐温-80的丙酮（简称AT）制备溶剂对照组。用于测定暴露溶液中吡氧酯菌酯浓度的乙腈（ MERDA 科技公司）为高效液相色谱级。实验室依据ISO-7346-3标准（国际标准化组织，1996年）配制了含(2 mmol / L Ca^{2+}) 0.5毫摩尔/升(Mg^{2+})、0.75毫摩尔/升(Na^{+})以及0.074毫摩尔/升(K^{+})的再生水。

斑马鱼养殖与产卵

野生型AB品系斑马鱼购自当地水族馆，饲养方法参照Cao等人（2016a）的研究。用于产卵的亲代斑马鱼（体长3.50±0.50厘米；体重0.40±0.10克）和用于化学暴露的成年斑马鱼（体长2.50±0.50厘米；体重0.15±0.05克），分别在实验室条件下的流水投喂装置（中国易生公司）和水族箱中于再生水中培养，毒性试验前至少适应2周。所有成年斑马鱼每天投喂两次活体丰年虫。

将雌雄亲代斑马鱼（雌雄比例为1:2）置于产卵箱（北京易生公司）中过夜隔离。次日清晨，开灯后即可触发产卵，30分钟后收集鱼卵并用配制好的水冲洗。受精后约2小时，通过体视显微镜挑选出受精且发育正常的鱼卵用于胚胎急性毒性试验。选取约1000枚2小时龄的鱼卵，随后在配制好的水中培养于将胚胎置于培养箱中（温度27±1℃，光暗周期14:10小时），以获取孵化后12小时（hph）和72小时（hph）的幼虫。在本实验的实验室条件下，大部分胚胎（约70%）在受精后72小时（hpf）左右孵化，孵化时间早于71小时的幼虫以及73小时后仍未孵化的胚胎均被剔除。在71至73小时孵化的幼虫分别再培养12小时和72小时，随后分别用于12小时和72小时孵化后幼虫的毒性测试。孵化时间为72±1小时受精后，因此12小时和72小时孵化后的幼虫分别对应84小时和144小时受精后。

吡氧噻菌酯对斑马鱼的急性毒性试验

根据经济合作与发展组织（OECD）《鱼类胚胎毒性（FET）测试草案提案》（OECD，2013年）以及此前提出的方法（弗雷斯等人，2006年）开展斑马鱼胚胎急性毒性测试。吡氧菌酯的名义浓度设为2.03、2.44、2.90、3.51、4.22和5.08微克/升，浓度选择依据预实验数据确定。所有测试溶液均采用复配水配制，复配水作为空白对照组（0毫克/升）。溶剂对照组采用0.005%的AT配制（溶于复配水中，体积比），其溶剂含量与最高浓度吡氧菌酯测试溶液的溶剂含量一致。将发育正常的胚胎（约受精后2小时）随机转移至24孔板的测试溶液中（每孔2毫升溶液、1枚胚胎），培养96小时。每块板中设置20孔吡氧菌酯测试溶液组和4孔复配水内对照组。每个测试浓度及对照组均设置3块24孔板作为重复实验（每个浓度60枚胚胎）。所有24孔板均置于培养箱中培养（温度27±1℃；光暗周期14:10小时），板上覆盖透明盖子以防止溶液蒸发。每24小时更换一次暴露溶液，以维持吡氧菌酯的适宜浓度和水质。每日统计死亡个体数量并观察胚胎发育状态。测试指标包括受精后24小时胚胎的自主运动（尾部自主摆动）、受精后48和72小时胚胎的心率，以及受精后96小时孵化幼体的孵化率和体长。此外，每日检查胚胎畸形情况，通过光学显微镜（奥林巴斯BH-2）观察胚胎的形态发育与异常特征。幼体体长测量参考弗雷斯等人（2006年）的方法并稍作修改，使用GE-5（北京爱国者公司产品）沿背轴边缘画直线，从头部顶端至尾部末端进行测量。

参照穆等人（2013年）的方法，对斑马鱼幼鱼和成鱼开展急性毒性评估。将240尾12小时 post-hatch（hph，孵化后小时数）的幼鱼随机暴露于200毫升重构水（空白对照）、0.0024%丙酮-吐温-80混合液（溶剂对照，溶解于重构水，体积比），以及1.50、1.65、1.83、2.00、2.20和2.43微克/升的吡氧菊酯溶液中。将210尾72 hph的幼鱼随机暴露于200毫升重构水（空白对照）、0.0037%丙酮-吐温-80混合液（溶剂对照，溶解于重构水，体积比），以及2.50、2.75、3.00、3.30和3.65微克/升的吡氧菊酯溶液中。将240尾成年斑马鱼暴露于4升脱氯自来水（空白对照）、0.007%丙酮-吐温-80混合液（溶剂对照，溶解于脱氯自来水，体积比），以及5.75、6.00、6.25、6.50、6.75和7.00微克/升的吡氧菊酯溶液中，暴露时长为96小时。试验浓度依据预实验数据确定。幼鱼试验采用重构水配制测试溶液，成鱼试验采用脱氯自来水配制测试溶液。溶剂对照中丙酮和吐温-80的含量与各试验最高剂量溶液中的含量一致。每个浓度设置三个重复组（每组30尾幼鱼或成鱼），每个烧杯放置10尾幼鱼或成鱼作为一个重复。每24小时更换一次暴露溶液，以维持吡氧菊酯的适宜浓度和良好水质。试验期间每日记录死亡个体数量。死亡判定标准为：幼鱼在显微镜下无心跳（经济合作与发展组织，1998年），成鱼无明显呼吸或触碰尾部无活动（经济合作与发展组织，1992年）。急性毒性试验期间实验中，成鱼和幼鱼不喂食，死亡个体立即从烧杯中移除。

基因表达分析

2小时胚胎期（hpf）的斑马鱼胚胎暴露于0.004%的阿特拉津（AT，溶剂对照，溶于重构水中，体积比）、2和4微克/升的吡氧菊酯，处理时长为96小时。该剂量的选择基于无观察效应浓度（2.03 µg/L）以及胚胎急性毒性试验的96小时半数效应浓度（96-h (LC _{50})）值。暴露处理结束后，按照制造商的操作流程（中国北京天根生化科技有限公司），采用离心柱法从30枚胚胎或新孵化的斑马鱼幼鱼中提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度与质量。按照制造商的操作流程，使用Quant逆转录酶试剂盒（中国北京天根生化科技有限公司）通过逆转录合成互补DNA（cDNA）。采用SYBR Green PCR预混试剂试剂盒（中国北京天根生化科技有限公司），在ABI 7500实时荧光定量PCR系统（美国加利福尼亚州福斯特城应用生物系统公司）上进行实时荧光定量PCR扩增。热循环程序设置如下：95℃预变性10分钟，随后40个循环，每个循环包括95℃变性15秒、60℃退火20秒、72℃延伸32秒。

测定了与浓度相关的目标基因转录变化，包括编码抗氧化蛋白的锰超氧化物歧化酶基因（Mn-sod）、过氧化氢酶基因（Cat）和谷胱甘肽过氧化物酶基因（Gpx）；参与细胞凋亡通路的肿瘤抑制基因（p53）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl2）、Bcl-2相关X蛋白基因（Bax）和半胱天冬酶3基因（Cas3）；与先天免疫系统相关的肿瘤坏死因子α基因（TNFα）、干扰素基因（IFN）和白介素-1β基因（IL-1b）；以及参与线粒体呼吸链和ATP合成的NADH脱氢酶亚基基因（NDI）、泛醇-细胞色素c还原酶核心蛋白基因（uqcrc）、细胞色素c氧化酶亚基I基因（COXI）和ATP合酶F0亚基6基因（ATPo6）。相应的引物序列列于表S1。以β-肌动蛋白作为持家基因。通过熔解曲线分析验证引物特异性。采用(2^{-Delta Delta C t})法（Livak和Schmittgen，2001）计算基因的相对表达水平。每个样本均进行三次生物学重复和三次技术重复。

水样中吡唑醚菌酯的测定

在暴露开始时以及暴露24小时后换水前，分析所有处理组暴露溶液中吡氧嘧菌酯的浓度。将10 mL样品转移至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈和3.0 g氯化钠。随后将混合物涡旋1分钟，并在5000×g条件下离心5分钟。将上层乙腈层通过0.22 µm滤膜过滤，转移至自动进样瓶中进行分析。

开展了一项回收率实验以确定该分析方法的准确度和精密度。通过向空白水样中添加定量标准物质，设计出吡唑醚菌酯浓度分别为1、5和10微克/升的水样，随后按照上述步骤对样品进行分析。

本分析在配备电喷雾电离源（ESI）的三重四极杆Xevo-TQD质谱仪的Waters Acquity超高效液相色谱（UPLC）系统上进行（美国马萨诸塞州米尔福德市沃特斯公司）。色谱分离在Acquity UPLC BEH Shield RP18色谱柱（2.1×100 mm，粒径1.7 µm，美国马萨诸塞州米尔福德市）上完成，以乙腈（流动相A）/水（流动相B）为流动相，流速为0.4 mL/min，采用梯度洗脱程序。梯度洗脱方案如下：流动相A初始比例为10%，保持0.5分钟；随后在0.5至1.25分钟内线性升至90%，并保持1.75分钟；最后进行梯度洗脱在0.1分钟内设定为10%的A相，并在4.0分钟时停止。进样体积为10微升，柱温箱温度为40摄氏度。质谱分析采用正离子多反应监测（MRM）模式。离子源温度设定为150摄氏度，电喷雾电压为3.0千伏，脱溶剂温度为350摄氏度，脱溶剂气体流量为650升/小时，锥孔气体流量为50升/小时。优化后的锥孔电压为26伏，碰撞能量为10伏。多反应监测分析通过监测前体离子到产物离子的质荷比跃迁来进行，定性离子为m/z 412.9→205.4，定量离子为m/z 412.9→145。使用MassLynx 4.1版软件收集并分析超高效液相色谱-串联质谱数据。

统计分析

本研究通过Shapiro-Wilk检验和Levene检验分别对数据进行正态性和方差齐性检验。采用SPSS 16.0软件（美国伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司）通过单因素方差分析（one-way ANOVA）比较对照组与处理组之间的差异，随后进行Dunnett事后多重比较。统计学显著性判定标准为(p<0.05)