题目：Toxicological effects of nanoplastics and phenanthrene to zebrafish (Danio rerio)

原文链接:：https://www.elsevier.com/journals/gondwana-research/1342-937X

期刊：Gondwana Research

摘要

尽管已知塑料垃圾会对野生动物造成危害，但进入水道和海洋的塑料垃圾仍以惊人的速度逐年增加。纳米塑料是环境中塑料碎片的分解产物（0.1–100纳米），其微小尺寸使其具有生物可利用性，且它们可能吸附持久性有机污染物，从而增强自身毒性。本研究探究了纳米塑料和菲对斑马鱼早期生命阶段的影响。研究人员将斑马鱼胚胎暴露于荧光纳米颗粒下，并通过荧光显微镜进行观察。荧光显微镜观察显示，80纳米的聚苯乙烯纳米塑料附着在胚胎绒毛膜上，斑马鱼在受精后144小时首次开口时便将其摄食，肠道内的荧光也证实了这一点。单独暴露于纳米塑料或与菲共同暴露，均会导致斑马鱼出现心包水肿、脊柱弯曲、胚胎心率加快、体长缩短以及死亡率上升的情况。5毫克/升纳米塑料与0.1毫克/升菲的共同暴露，对斑马鱼胚胎的体长、致畸性和死亡率产生的负面影响，大于相应浓度的单一暴露。本研究明确证实斑马鱼幼体能够摄食纳米塑料，因此未来开展相关毒理效应评估研究，对海洋野生动物管理具有重要意义。

关键词：纳米塑料 菲 斑马鱼胚胎 胚胎毒性

引言

粒径小于5毫米的塑料颗粒被定义为微塑料，而粒径在1至100纳米之间的纳米级微塑料则为纳米塑料（NPs）（Frias和Nash，2019；Lehner等人，2019）。微塑料在环境中分布广泛，但由于洋流、天气条件和人类活动的影响，不同区域的丰度差异极大（Alimi等人，2018）。河口或城市河流中微塑料的丰度往往高于沿海地区（0.167±0.1；Zhao等人，2014）。研究已在褐虾（Crangon crangon）（Devriese等人，2015）、贻贝（Mytilus spp.）（Bråte等人，2018）、日本鳀（Engraulis japonicus）（Tanaka和Takada，2016）、短尾剪水鹱（Puffinus tenuirostris）（Tanaka等人，2013）等多种生物体内检测到微塑料。

粒径小于5毫米的塑料颗粒被定义为微塑料，而粒径在1至100纳米之间的纳米级微塑料则为纳米塑料（NPs）（Frias和Nash，2019；Lehner等人，2019）。微塑料在环境中分布广泛，但由于洋流、天气条件和人类活动的影响，不同区域的丰度差异极大（Alimi等人，2018）。河口或城市河流中微塑料的丰度往往高于沿海地区（0.167±0.1；Zhao等人，2014）。研究已在褐虾（Crangon crangon）（Devriese等人，2015）、贻贝（Mytilus spp.）（Bråte等人，2018）、日本鳀（Engraulis japonicus）（Tanaka和Takada，2016）、短尾剪水鹱（Puffinus tenuirostris）（Tanaka等人，2013）等多种生物体内检测到微塑料。

相比之下，由于环境采样难度较大，纳米塑料在环境中的分布情况仍不明确。其中一个原因是纳米塑料常以胶体形式存在，会通过过滤干扰采样过程。尽管如此，通过大型塑料碎片和微塑料的降解，以及纳米材料向环境的释放，纳米塑料被认为在环境中普遍存在（Alimi 等人，2018；Oliveira 与 Almeida，2019）。 据推测，纳米塑料的毒性作用强于微塑料。其微小的尺寸使其具有更高的生物利用度；进入组织和细胞后，它们可引发氧化应激、降低免疫力（Li 等人，2020）、影响能量代谢（Li 等人，2021）、导致内分泌功能紊乱（Brun 等人，2019），并诱发神经毒性（Barboza 等人，2018）。这些综合作用会导致生物体发育异常和生殖功能障碍（Della Torre 等人，2014；Tallec 等人，2018）。 此外，研究发现，多环芳烃（PAHs）、多氯联苯（PCBs）、滴滴涕（DDT）、药品等持久性有机污染物（POPs），易通过疏水作用被微塑料吸附（Rodrigues 等人，2019；Tourinho 等人，2019年）。此外，纳米塑料表面性质的多样性使其能够发生其他相互作用，例如表面带电的纳米塑料可吸附重金属离子。因此，纳米塑料是持久性有机污染物（POPs）及其他环境污染物生物富集的另一途径。据估计，相较于微塑料，纳米塑料更大的比表面积使其吸附速率比微塑料高1至2个数量级（Velzeboer 等人，2014年；Syberg 等人，2015年）。因此，研究纳米塑料（NPs）与持久性有机污染物联合作用的毒性效应尤为重要。

多环芳烃（PAHs）广泛分布于全球的大气、水和土壤中。中国香港城乡表层土壤中多环芳烃的浓度范围为7.0至410微克/千克（干重）（Zhang等人，2006年），希腊雅典大气中多环芳烃的浓度范围为3.5至(26.0 ng / m^{3})（Mandalakis等人，2002年）。在杭州水库中，地表水中检测到了多环芳烃，浓度为0.989–9.6631毫克/升，沉积物中浓度为132.7–7343纳克/克（干重）（Chen等人，2004年）。多环芳烃不易降解，易在生物体内积累，可诱发基因突变，进而引发癌症、致畸等问题。其来源广泛，包括森林火灾、火山喷发、化石燃料不完全燃烧以及石化工业生产活动等。菲（PHE）是一种含三个苯环的多环芳烃，在水生生态系统中含量丰富，常被用作研究多环芳烃的模式化合物（Shirmohammadi等人，2017年）。

斑马鱼是毒理学研究的理想模式生物，本研究对其胚胎发育阶段进行了评估，该阶段对环境污染物尤为敏感。本研究利用斑马鱼胚胎评估纳米颗粒与多环芳烃的联合发育毒性。通过荧光显微镜观察到了纳米颗粒的摄取情况。根据形态特征及其他指标对毒性进行了测定。该研究为探究纳米颗粒与菲产生负面影响的作用机制奠定了基础。

结果

纳米塑料在斑马鱼体内的摄取

在24小时胚胎期（hpf），两个纳米塑料（NPs）组的斑马鱼胚胎卵膜上均检测到了荧光纳米塑料（图1A），且在48小时胚胎期，附着在卵膜上的纳米塑料数量更多（图1B）。然而，在24小时胚胎期和48小时胚胎期，5纳米塑料组与10纳米塑料组胚胎卵膜上附着的纳米塑料数量并无差异。斑马鱼在72小时胚胎期孵化，但直到144小时胚胎期才在其体内检测到荧光信号。此时，斑马鱼肠道中检测到了纳米塑料。10纳米塑料组的荧光强度高于5纳米塑料组（图1C-D），且荧光强度随暴露时间的延长而增强。

图1. 斑马鱼胚胎对纳米塑料的摄取与积累。5纳米塑料组斑马鱼胚胎在24小时受精后（A）、48小时受精后（B）和144小时受精后（C）的荧光图像，以及10纳米塑料组斑马鱼胚胎在144小时受精后的荧光图像（D）。

斑马鱼的形态变化

单独或联合暴露于纳米颗粒（NPs）或五氯苯醚（PHE）会导致斑马鱼胚胎出现畸形，包括脊柱弯曲和心包水肿（图2）。两组均观察到这两种畸形，但纳米颗粒（NPs）组的心包水肿比五氯苯醚（PHE）组更严重，而五氯苯醚（PHE）组的脊柱弯曲比纳米颗粒（NPs）组更严重。

图2. 纳米塑料和菲对斑马鱼胚胎168小时受精后胚胎的致畸效应

通过畸形数量计算致畸率（图3D）。对照组未发现斑马鱼发育异常。两种纳米颗粒浓度下的畸形率无差异（p>0.05），但较高浓度的苯并芘组致畸率有所上升：0.1mg/L苯并芘组的致畸率为8.10%±0.82%，0.2mg/L苯并芘组为12.46%±0.45%（p<0.05）。同时暴露于0.1mg/L苯并芘和5mg/L纳米颗粒的斑马鱼胚胎畸形率，几乎是单独暴露于0.1mg/L苯并芘时的两倍。0.2mg/L苯并芘+纳米颗粒组的致畸率也高于单独纳米颗粒组或单独苯并芘组，不过其效应不如0.1mg/L苯并芘单独或联合纳米颗粒处理时显著。

对斑马鱼胚胎的致死与亚致死效应

记录了各组斑马鱼在72小时受精后（hpf）的心率、144小时受精后的体长以及168小时受精后的死亡率。对照组的平均心率为82.25±2.66次/分钟（图3A）。仅在较高浓度的苯并芘（PHE，0.2毫克/升）和纳米塑料（NPs，10毫克/升）处理组中观察到心率变化，较低浓度组与对照组无差异。联合暴露未表现出协同效应，苯并芘与纳米塑料的联合暴露效果与单独使用苯并芘一致。

对照组的体长为3.87±0.07毫米（图3B）。纳米颗粒（NPs）和菲（PHE）的单独及联合暴露均会缩短斑马鱼幼鱼的体长。10纳克/毫升纳米颗粒组的斑马鱼幼鱼体长更短，而5纳克/毫升纳米颗粒组未出现此现象；两种浓度的菲均导致斑马鱼幼鱼体长缩短，但0.1纳克/毫升菲组与0.2纳克/毫升菲组的体长无差异。联合暴露组（0.1纳克/毫升菲+纳米颗粒）中斑马鱼幼鱼的平均体长短于单独暴露组。

治疗组的死亡率高于对照组，且随着暴露浓度的升高而升高（图3C）。在0.1苯并芘+5壬基酚联合暴露组中，死亡率高于相应的单一暴露组。虽然0.2苯并芘+5壬基酚联合暴露组与其对应的单一暴露组之间无统计学显著差异，但联合暴露组的死亡率略高于仅壬基酚暴露组，且略低于仅苯并芘暴露组。

图3. 对斑马鱼胚胎的致死与亚致死效应。(A) 72小时胚胎期斑马鱼胚胎的心率；(B) 96小时幼体期斑马鱼幼体的体长；(C) 168小时胚胎期斑马鱼胚胎的死亡率；(D) 168小时胚胎期斑马鱼胚胎的致畸率。误差线代表均值标准误差（±SE），不同字母表示在p<0.05水平下存在显著差异

讨论

绒毛膜是保护胚胎免受外界侵害的第一道屏障；它选择性允许氧气、营养物质和部分有机小分子通过，同时阻挡细菌、浮游动物及其他微生物的侵入（Stehr和Hawkes，1979；Schoots等人，1982；Fent等人，2010）。该膜由三层结构组成：最外层的颗粒层具有极高的通透性，中间层和内层遍布直径为0.5–0.7毫米的锥形孔隙，这些孔隙部分被外层的颗粒块所堵塞（Rawson等人，2000）。荧光成像结果显示，绒毛膜对本研究中使用的80纳米聚苯乙烯纳米颗粒构成了有效屏障。聚苯乙烯纳米颗粒会黏附在斑马鱼胚胎的绒毛膜上，且黏附程度随时间推移而增加（图1）。

以往研究已证实部分纳米颗粒可穿透绒毛膜。例如，单个银纳米颗粒（5–46纳米）可通过非主动转运方式经绒毛膜孔道（CPCs）进出胚胎（Lee等人，2007年）。氧化石墨烯（GO）纳米片（厚度0.8–1纳米、直径101–258纳米）也可通过绒毛膜孔道进入胚胎，同时还能通过内吞作用进入（Chen等人，2016年）。但这并不意味着所有小于孔径范围的颗粒都能穿透绒毛膜。25纳米或115纳米的(SiO_{2})纳米颗粒仅在斑马鱼胚胎的绒毛膜上积累，在斑马鱼胚胎内部或幼鱼体内未检测到荧光信号（Vranic等人，2019年）。金、硫化镉和氧化锌荧光纳米颗粒也仅附着在胚胎绒毛膜表面，但胚胎孵化后，幼鱼的肠道和泄殖腔中检测到了荧光信号，且暴露处理导致幼鱼死亡（Lacave等人，2016年）。

近期一项研究发现，纳米塑料能否穿过卵壳膜与粒径相关，粒径等于或小于50纳米的纳米塑料可穿过卵壳膜（段等，2020）。根据该研究，25纳米和50纳米的塑料颗粒会在斑马鱼胚胎的眼部积累，而大于50纳米的颗粒仅出现在肠道和外层表皮（范·波梅伦等，2017）。但也有研究报道，在受精后96小时，头部和视网膜中检测到了1-5微米的微塑料，这表明它们穿过了卵壳膜（桑托斯等，2020）。对于这些相互矛盾的研究结果，一种可能的解释是，只有当卵壳膜的吸附能力达到最大值时，纳米颗粒才能穿过（范·波梅伦等，2017）。本研究中，5纳米纳米塑料组与10纳米纳米塑料组在受精后24小时和48小时的荧光强度无差异，因此卵壳膜的吸附能力可能已达到最大值。

即使纳米塑料仍附着在胚胎表面，它们仍能发挥作用。对暴露于苯并[a]芘（BaP）涂层微塑料的斑马鱼胚胎进行的荧光分析追踪显示，微塑料颗粒仅附着在绒毛膜上，而来自苯并[a]芘的荧光信号却出现在卵黄和眼睛等部位（Batel 等人，2018）。直至受精后144小时，斑马鱼幼体的肠道中才检测到苯并[a]芘涂层颗粒。这表明微塑料可将其携带的持久性有机污染物转移至附着的器官。胚胎发育过程中的纳米颗粒。我们观察到斑马鱼幼鱼在受精后120小时或144小时开口，此时纳米颗粒被摄食，且仅在肠道中检测到纳米颗粒的荧光信号。

尽管差异不显著，但单独或联合暴露于纳米塑料（NP）和菲（PHE）会有增加斑马鱼胚胎心跳的趋势。暴露于纳米塑料后胚胎心跳加快，可能与附着有纳米塑料的卵膜气体交换能力下降有关。附着在卵膜上的纳米塑料可能会堵塞内部孔隙，导致胚胎内部氧含量降低。以往研究发现，缺氧程度与纳米塑料浓度呈正相关（Malafaia 等人，2020）。在该研究中，暴露于高浓度聚乙烯（PE）微塑料的斑马鱼胚胎提前孵化，推测是由胚胎内部低氧环境导致的。

我们还发现，暴露于菲会升高斑马鱼胚胎的心率。已知多环芳烃会影响发育中鱼类的心率：暴露于菲会降低黑茉莉鱼胚胎的心率（Zheng 等人，2020），而暴露于多环芳烃的硬骨鱼幼虫也出现了心率降低的现象（Cherr 等人，2017；Hansen 等人，2019）。研究也观察到了心率加快的情况，例如青鳉鱼胚胎暴露于高毒性多环芳烃苯并[c]菲（BcP）时。在该研究中，随着心率加快，胚胎发育也随之加速。由此可见，心率变化是多因素共同作用的结果，可能与多环芳烃的种类、浓度以及暴露的物种等因素相关。

单独或联合暴露于纳米塑料（NPs）和菲（PHE）会导致斑马鱼胚胎发育异常，引发畸形、体长缩短以及死亡率上升（图2和图3）。已有充分研究证实，菲暴露会造成胚胎发育缺陷（Huang等人，2013；Zheng等人，2020）。然而，关于微塑料暴露影响的研究结论却存在矛盾。Santos等人（2020）得出结论，2毫克/升的微塑料暴露不会对斑马鱼胚胎产生致死或亚致死效应，而Zhang等人（2020）却观察到0.05–10毫克/升的微塑料暴露会产生致死和亚致死效应。我们认为，这种差异可能是由于暴露实验中所使用的微塑料浓度不一致导致的。研究发现，与单独暴露于菲或纳米塑料相比，联合暴露对斑马鱼的体长和畸形率影响更为显著，但对心率和死亡率则无明显影响。低浓度镉与微塑料联合暴露下，斑马鱼胚胎的体长长于单独暴露于微塑料的情况（Zhang等人，2020）。而随着镉浓度升高，联合暴露组的斑马鱼胚胎体长逐渐短于单独微塑料暴露组，这表明联合暴露与毒性之间并非简单的线性关系。

结论

总体而言，纳米塑料会附着在斑马鱼胚胎的绒毛膜上，并在斑马鱼开口后被摄入。附着在绒毛膜上的纳米塑料可将吸附的污染物转移至胚胎，且在附着量达到最大值后可能穿过绒毛膜。心率变化与多环芳烃的种类、浓度等因素相关。本研究中，单独暴露于纳米塑料或与菲联合暴露均会使胚胎心率加快、体长缩短、死亡率升高，并引发心包水肿和脊柱弯曲。联合暴露时，其毒性可能并非呈线性关系。且需要更多研究来分析联合毒理效应。

材料与方法

实验材料

聚苯乙烯纳米塑料微球（纳米塑料，80纳米）购自中国天津基准色谱科技研究中心，标记有绿色荧光（激发波长：470纳米，发射波长：526纳米）。通过扫描电子显微镜检测了纳米塑料的粒径（补充图S1）。菲（PHE，(purity >99.5%）购自中国上海阿拉丁试剂公司，预先配制为1克/升和2克/升的菲-甲醇溶液。

斑马鱼饲养与胚胎收集

成年野生型斑马鱼（斑马鱼，AB品系）来自华南农业大学海洋学院水产经济动物种质资源与育种工程实验室。斑马鱼饲养于循环水系统中，水温维持在28℃，光周期为14/10小时（光照/黑暗），每日投喂两次新鲜卤虫（盐生卤虫）（Santos 等人，2020）。

为获得胚胎，成年斑马鱼在商业孵化箱中配对过夜，并于次日清晨在光照刺激下产卵。受精胚胎在4小时内被挑选收集，置于E3培养基中培养（Lee等人，2019）。

胚胎暴露与形态学参数

将胚胎随机分为7组，每组30个胚胎。每个实验组设置三个平行样本。胚胎在受精后6小时（hpf）进行暴露处理，具体分为7组：对照组（E3溶液组）、5 mg/L纳米颗粒组、10 mg/L纳米颗粒组、0.1 mg/L菲组、0.2 mg/L菲组、5 mg/L纳米颗粒+0.1 mg/L菲组、5 mg/L纳米颗粒+0.2 mg/L菲组，分别命名为CTR组、5 NP组、10 NP组、0.1 PHE组、0.2 PHE组、0.1 PHE+NP组、0.2 PHE+NP组。菲通过1 g/L和2 g/L的菲-甲醇溶液添加。向不含菲的暴露组以及对照组中均加入等量的甲醇。

在体视显微镜（重庆奥特光学仪器厂 SZ680 型；中国重庆奥特）下对斑马鱼胚胎进行形态学测量。在受精后72小时（hpf）测量心率，在受精后144小时测量体长，受精后72小时孵化率达100%，在受精后168小时记录死亡率和致畸率（Pitt 等人, 2018；Qiang 与 Cheng, 2019；Le Bihanic 等人, 2020）。每日观察斑马鱼胚胎和幼体的形态。每日使用配备尼康 C-HGF1 荧光系统的尼康 SMZ18 体视显微镜拍摄荧光图像。

统计分析

使用 SPSS 25.0 对数据进行分析，并采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行显著性检验，p<0.05 表示差异具有统计学意义。