标题：Zebrafish use spectral information to suppress the visual background

期刊：cell

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.10.009

摘要

视觉最初在水中进化形成，光线的光谱成分能反映观察距离。然而，水生视觉系统是否以及如何利用这一“物理事实”，目前尚不为人知。本研究表明，斑马鱼会利用“颜色”信息来抑制对视觉背景的反应。为此，斑马鱼将其完整的祖先视锥细胞组成划分为两个对立的系统：PR1/4（“红/紫外视锥细胞”）与 PR2/3（“绿/蓝视锥细胞”）。其中，哺乳动物保留的无色彩分辨能力的 PR1 和 PR4 是视觉形成的必要且充分条件。相比之下，哺乳动物丢失的具有颜色拮抗特性的 PR2 和 PR3 对视觉既非必要也非充分。相反，它们构成了一个“辅助系统”，从光谱层面抑制 PR1 和 PR4 产生的“核心驱动信号”。本研究的发现挑战了长期以来的观点，即脊椎动物视锥细胞的多样性主要服务于色觉，并进一步表明，推动哺乳动物视觉回路重组的主要动力是陆地化适应，而非夜行化演化。

图形摘要

引言

在成像视觉中，关于空间二维的信息被硬连线到眼睛的视网膜拓扑结构中。 相比之下，距离信息则必须通过推断得出。包括人类在内的陆生四足动物通过计算方式解决这一问题，结合了视网膜内物体分割回路、立体视觉以及诸如利用图形线索等认知策略。然而，成像眼最初是在水中进化出来的，而水环境为距离估算提供了一种简单得多的线索——“白度”（图1A）。

水中对光的强烈散射与吸收会导致光谱成分随观测距离的增加而迅速变窄12（图1A）。因此，光谱范围较宽的光（即“白色”光）仅存在于前景区域（图1A、1B；视频S1）。水生视觉系统或许可以利用这种“白色效应”，例如通过使视网膜的光反应偏向光谱范围较宽的输入信号。视网膜向大脑输出的这种偏向几乎必然会导致视觉行为出现前景偏向。然而，水生视觉系统是否以及如何利用这种诱导性偏向仍有待探究。

原则上，可通过比较消色差（“灰度”）回路和色觉（颜色）回路来实现视网膜的白色偏倚，因为这两类回路对光谱宽度的变化会呈现相反的响应趋势（图1A和图1B）。灰度回路（非对立型）的活性会随着光谱变窄而逐渐降低（图1A，中间），而色觉回路（对立型）的活性则会增强。这是因为兴奋性和在广谱光下，颜色对立通路的抑制性输入会相互抵消，而随着光谱向单色点收窄，这种抵消作用会减弱（图1A，右侧）。亮度和/或消色差对比度的同时降低会进一步凸显这些光谱差异：二者都会严重削弱灰度信号，而颜色通路在刺激空间的这些正交维度上基本保持不变。

斑马鱼幼鱼的视网膜中具备对比灰度和彩色电路所需的所有组件。与许多鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类一样，这种昼行性表层硬骨鱼保留了四种原始视锥细胞类型（红、绿、蓝和紫外光）。鉴于其高度的保守性，这四种原始脊椎动物视锥细胞近期被分别重命名为22“光感受器1-4型”（PR1–4）。其中，包括小鼠和人类在内的真兽类哺乳动物保留了PR1和PR4，却丢失了PR2和PR3。

在此，我们提供直接证据来支持这一假设。首先，通过双光子成像技术，我们证明斑马鱼的视觉具有显著的白色偏好。其次，利用基因消融技术通过对视锥细胞类型及其组合的研究，我们发现这种白色偏向源于PR1/4与PR2/3通路的系统性对比效应。具体而言，我们证实PR1和PR4是实现时空视觉的必要且充分条件，而PR2和PR3既非视觉所必需也非充分条件，反而会抑制PR1/4通路。第三，我们发现PR2和PR3系统的作用相互拮抗。第四，我们在三种古老且高度保守的视觉行为层面验证了研究结果：有光和无光条件下的自发游动、趋光性以及视运动反射。

我们的研究结果共同挑战了教科书上的观点，即脊椎动物光感受器协同作用以驱动视觉行为，而它们的拮抗作用则服务于色觉。相反，我们发现斑马鱼视锥细胞的神经回路从根本上是按竞争机制布线的。尽管其他鱼类中是否存在类似的回路结构尚不清楚，但我们的研究结果初步为视网膜最初的水生回路结构提供了另一种解读视角，为脊椎动物视觉的进化提供了新见解，并表明早期合弓纲（所有哺乳动物的祖先）视觉回路重组的主要驱动因素是陆生化，而非夜行化。

结果

斑马鱼的视觉偏向白光

为评估斑马鱼如何处理时空视觉刺激中的光谱成分，我们利用双光子成像技术对斑马鱼顶盖（硬骨鱼大脑主要的视网膜接收区域）中光诱发的神经活动进行了成像（图1C、图1D；视频S2）。我们使用定制的“四色高光谱”刺激器将刺激物投射到侧向屏幕上，该刺激器的波长与斑马鱼体内视锥细胞的光谱敏感峰近似（从“红光”到“紫外光”：分别为587、470、422和373纳米）。我们调整了刺激物的相对强度，以匹配斑马鱼栖息地自然光的光谱分布（从红光到紫外光：分别为1200、600、300和150微瓦；图S1A–S1C）。因此，四个光谱通道同时激活时近似于“斑马鱼白色”（消色差），而对部分通道的选择性激活则可用于呈现各类“彩色”（色觉）刺激。

在整个研究过程中，我们聚焦于视觉回路计算的三个通用方面：（1）光检测（宽视场亮暗感知），例如与趋光性31,32和视运动反射33相关；（2）宽视场运动（大尺寸移动光栅），例如与视运动/光运动反射 34；以及（3）局部物体运动（小的移动点），例如与视觉猎物捕捉相关联 35-37

其中，对光线（或光线缺失）的检测在任何感光系统（包括眼外感光系统）中原则上均可实现，而后两种检测则需要视网膜处理（以下称为“时空视觉”）。为探究上述刺激空间，我们采用了一种刺激序列，该序列包含宽场移动光栅，以及分别叠加在暗背景和亮背景上的小型亮、暗移动点（图1E-1G）。以斑马鱼为实验对象时，在重复实验中，单个顶盖神经元会对该刺激序列的特定特征产生选择性反应（图1E和1F）：暗背景下的移动光栅与亮移动点（以下简称“亮点”）能引发大量反应，而亮背景下的暗点（以下简称“暗点”）则几乎不引发反应。总体而言，对时空模式化刺激的反应始终局限于顶盖在视网膜拓扑上对应的基底区域，这与受刺激眼睛的直接驱动相符（图1G和1H，对比图1C和1D）。相比之下，亮/暗反应（即光线检测）在整个大脑中均能稳定观察到，无明显的对侧或视网膜拓扑偏向性。

接下来，我们使用不同色调的光重复了该实验（图1G-1J）。结果显示，时空刺激的表征中存在显著的白光偏向，但基础光检测中并无此现象。例如，“可见光”（红、绿、蓝三色[RGB]）缺少紫外线（UV）成分，其引发时空模式反应的效果远不如白光（即RGBU；对比图S1A-S1F）：在白光中占比不足7%的紫外线被剔除后，光栅反应的损失率达85%，亮点反应的损失率达97%（即白光校正后的效率分别仅为15%和3%）。相反，仅激活紫外线通道时，白光校正后的效率也仅为12%（光栅反应）和42%（亮点反应）（图1G-1J）。

其他波长组合也得到了相似的结果（图1J和图S1F）：相较于白光，在所有非白光刺激条件下，光栅反应和亮点反应的占比均出现显著且大幅的下降。对于光栅刺激而言，最有效的非白光刺激是“RGU”（红光、绿光和紫外光），尽管光功率损耗不足9%，但其经白光校正后的平均效率仍达到36%。光谱窄带刺激的效果更差，涉及红光、绿光或“蓝光”通道与白光相比，单独刺激分别引发的光栅反应少于5%、17%和3%。白光也能引发最可靠的亮点反应；然而，与光栅反应不同，且与以往研究30,35,38一致的是，亮点反应的有无还与紫外线的有无直接相关。再次来看，最有效的非白光条件为RGU，其白光校正效率为72%。RU和仅紫外线刺激分别位列第二和第三，效率分别为55%和42%。在无紫外线的情况下，无论其他波长如何组合，亮点反应的白光校正效率最高仅为5%。这些结果表明，对时空模式刺激的反应具有“白光偏好性”，其程度远超仅用刺激强度所能合理解释的范围。

与对模式化刺激的反应不同，关闭反应和开启反应均未专门对白光产生调谐。例如，在两种情况下，仅红光（R）刺激引发的反应与白光引发的反应在统计学上无显著差异（图1J）。

我们得出结论，在斑马鱼幼体的大脑中，对时空调控刺激（如漂移光栅或类似猎物的移动点）的表征，而非对基本明暗转换的表征，受到光谱竞争回路的密切调控，这些回路会抑制对非白色刺激的反应。

图1. 斑马鱼的视觉具有白色偏向性。（A和B）展示了光谱较宽的（白色）光在水下传播距离增加时的衰减情况，以及理想化的“颜色拮抗”探测器和灰度探测器对光谱宽度相应变化的响应（STAR方法学；另见视频S1）。（C）在呈现“四色空间刺激”11时对斑马鱼幼体10顶盖神经元进行双光子成像的实验装置。（D–F）带有标注脑区和感兴趣区域（ROIs）示例的代表性扫描图（D），展示了对一系列宽视场和时空刺激的单次试次（E）和平均（F）响应。（G）所有对侧（上方）和同侧（下方）感兴趣区域对相同刺激序列的平均响应。这些数据来自13条斑马鱼，分别在白光（黑线）、可见光（灰线）和紫外光（粉线）刺激下记录。（H）脑内的空间响应分布。百分比表示相对于白光((=100%))的平均响应丰度。（I）所有对侧（上方）和同侧（下方）对白光、可见光和紫外光的响应，按响应类型排序（参见视频S2）。（J）每种刺激和颜色组合的响应数量统计（STAR方法学）。基于单尾配对Wilcoxon秩和检验并经Bonferroni多重比较校正，与白光列((1st)进行统计比较（无星号表示无显著差异，(rho>0.05)）。完整统计数据见表S1A。另见图S1。

时空视觉不依赖 PR2 或 PR3

为了明确白色偏好的起源，我们构建了转基因斑马鱼品系，通过细菌硝基还原酶的细胞类型特异性表达，可分别消融四种视锥细胞中的任意一种，该酶可将原本无害的前药甲硝唑转化为细胞毒素[40]。随后，我们向急性消融了特定视锥细胞的斑马鱼呈现相同的白色刺激序列。这一实验直接验证了我们假设的9种电路结构：消融PR1（红）或PR4（紫外）视锥细胞，而非PR2（绿）或PR3（蓝）视锥细胞，会导致整体视觉反应性显著丧失（图2A）。这种丧失始终表现为时空模式反应几乎完全停止，而对撤光反应和给光反应仅产生中等程度的影响（图2A-2I及图S2）。

首先，PR1 的消融完全消除了光栅反应，但保留了少量但显著数量的亮点反应（图2B-2F）。其次，PR4 的消融完全消除了光栅反应和光点反应（图2B-2D和2I）。第三，PR2 或 PR3 消融后，光栅反应和亮点反应均持续存在（图2B-2D、2G和2H）。其中，除了PR2消融后的光栅反应外，反应数量在统计学上与对照组无显著差异，该反应虽有轻微但显著的降低（(P_{B-dots }=0.24) [PR2] 和 0.43 [PR3]；(p_{Gratings }=0.013) [PR2] 和 0.23 [PR3]，单尾Wilcoxon秩和检验）。此外，PR2 消融揭示了先前不存在的暗点反应（((p_{D- dots }=0.007) [PR2] 和 0.043 [PR3]）。

敲除PR2或PR3也会导致整体“群体反应”在面对时空模式化刺激时出现多种类型的增强，这一反应既考虑了响应神经元的数量，也纳入了单个神经元的反应幅度（图2B和图2C）。相较于白光，使用光谱窄的光时，这些效应往往会更显著（图2J和图2L）。例如，敲除PR3会增强对红色光光栅（图2J）和紫外线亮点（图2L）的反应。敲除PR2后，相同的反应也会增强；但在这种情况下，效应的分布更为广泛，且显著包括了在所有测试波长下解除暗点反应的抑制（图2J-2L），以及在紫外线照射下时空模式反应的增强（图2L），而PR2本身对紫外线并不敏感（图S1E）。后一现象表明，PR2会间接抑制紫外线反应，例如通过与PR3相互作用实现（图S1E）。

除了上述对时空模式反应的影响外，单个视锥细胞类型消融后，撤光和给光刺激的表征大多仍保持（图2B-2I），且它们的对侧偏向倾向于较弱（撤光）或完全消失（给光），包括在对照条件下也是如此（图2D-2H）。尽管如此，唯一显著的对侧变化同样出现在PR2和PR3消融的情况下。PR2消融后，微弱的对侧撤光偏向性选择性消失，而PR3消融则独特地揭示了给光反应中存在微小但显著的对侧偏向性（图2H）。

这些消融实验的结果综合来看，有力地表明不同类型的基础视觉刺激的处理与视锥细胞的特定亚群存在特异性关联。具体而言，在缺失PR1或PR4的情况下，对时空模式刺激的反应出现了整体的大幅下降，这说明这两种视锥细胞是“正常”视觉所必需的。相反，在消融PR2或PR3后，时空模式反应依然存在——同时还观察到对时空模式的反应性往往有所提升，且新的反应类型能够被显现出来——这表明这些视锥细胞在正常情况下起到抑制而非驱动视网膜输出的作用。

图2. 时空视觉不依赖PR2或PR3。(A) 每条斑马鱼对侧响应的感兴趣区域（ROI）数量（见《STAR 方法》），为呈现我们的时空刺激组合（参见图1，以白色呈现）时的数值减去同侧响应的对应数值。从左至右依次为：对照组，以及分别对PR1（红色）、PR2（绿色）、PR3（蓝色）和PR4（紫外）视锥细胞进行基因消融后的斑马鱼（命名规则见巴登等人22的研究）。统计分析基于双尾威尔科克森秩和检验，并采用邦弗龙尼校正以控制多重比较（详细信息见表S1B）。(B–D) 与图1G和图1H的分析方法一致，但仅展示对照组及不同视锥细胞消融后对白色刺激的响应情况。(D)中的箭头突出显示了暗点响应的显现（另见图S2A–S2E）。(E–I) 每条斑马鱼对侧响应的统计数据，已对同侧响应进行校正。图中显示为每种刺激下响应的感兴趣区域数量占所有响应感兴趣区域的百分比。需注意，该归一化方法会过度低估响应性较差的斑马鱼（例如PR1/4视锥细胞消融后）的响应数量。未校正

PR1和PR4是实现时空视觉的必要且充分条件

视觉中PR1/4和PR2/3通路推断出的相反作用，进一步得到了双消融实验结果的直接证实：同时消融PR1和PR4会导致对侧时空模式反应完全停止（图3A-3F及图S3）。相反，同时消融PR2和PR3后，时空模式反应依然存在（图3G及图S3）。此外，与此前观察到的PR2消融结果（图2）一致，暗点反应被显现出来（图3B和3G），且对侧反应的偏侧性消失。然而，同时消融PR2和PR3 改善了单个视锥细胞类型消融后观察到的时空模式反应的整体“膨胀”现象（图3B和图3J-3L，对比图2B和图2J-2L）。接下来，尽管同时敲除 PR1 和 PR4 大致重现了它们各自敲除的表型，但视觉系统的正常功能取决于它们的关节存在：三重消融，只留下PR1（图3H）或PR4（图3J），两者都导致模式反应的完全丧失。

图3. 视锥细胞1和视锥细胞4对时空视觉既是必需的也是充分的。（A–L）同图2A–2L，但为不同视锥细胞消融的结果。每组面板从左至右依次为：对照组、PR1/4双消融组、PR2/3双消融组、PR2/3/4三消融组以及PR1/2/3三消融组。图E–L的统计数据见表S1B。为清晰起见，图J–L仅展示对照组和PR2/3双消融组的数据。为方便展示，重复使用图2中的对照组数据。另见图S3。

在一起，从这一系列的烧蚀实验的结果强烈建议PR1和PR4的联合存在是必要的和足够的正常时空模式视觉。相反，PR2和PR3的存在似乎是不必要的时空视觉（至少对于测试的刺激空间），和他们的个人缺席突出视觉反应的各个方面。

出现的画面是脊椎动物眼睛的四种祖先类型的锥体可以分为两个相反的系统：PR1和PR4驱动视觉，但PR2和PR3抑制——从而调节——视觉回路。此外，与PR2/3双消融相比，个人PR2或PR3消融后的“膨胀”反应表型进一步暗示PR2和PR3在赋予PR1和PR4回路调节功能之前通常相互作用。

PR2和PR3导致斑马鱼视觉中的白色偏差

接下来，我们系统地结合圆锥消融和光谱刺激来阐明PR2和PR3如何调节视觉。为此，我们同时消融了PR2和PR3，并提出了以前用于探测控件的相同光谱组合（参见图1J和S1F）。这表明，对于光栅和亮点，PR2/3双消融动物相对于对照组进行了系统的重新调谐（图4A、4B和S4A-S4D）。在这两种情况下，光谱响应都以较短的波长为代价向较长的波长移动。此外，白色偏置在很大程度上丢失了。例如，与对照组不同，在PR2/3消融动物中，对红色刺激的光栅响应在统计上与白色刺激没有区别（(p=0.11)配对Wilcoxon秩和检验，一条尾巴）。此外，光栅和关闭响应的光谱调谐功能现在具有可比性（图4A，参见图S4C）。我们得出的结论斑马鱼视觉（图1）引人注目的白色偏见很大程度上源于PR2和PR3对视网膜输出的网络抑制电路相互作用。

图4. PR2和PR3电路相互竞争。（A和B）对照组（灰色）和PR2/3双消融动物（黄色）对光栅（A）或亮点（B）反应的对侧ROI的归一化光谱响应幅度。STAR方法中的详细信息。完整的PR2/3双消融数据总结在图S4A中，暗点和关闭/打开刺激的分布分别显示在图S4B-S4D中。请注意，非白色条件的响应幅度倾向于向“类似白色”的水平增加以下PR2/3消融——特别值得注意的是光栅的红色刺激（A，(4th)对条）。基于单尾Wilcoxon秩和检验与Bonferroni校正的（A）和（B）中的统计比较，用于多次比较(p<0.05)(^{*} p<0.01)(^{*+*} p<0.001)没有星号，(rho>0.05)表S1C中的完整统计数据。（C-F）两步锥形组合模型（STAR方法）的结果，该模型捕获光栅的光谱调谐（C和D，参见A）和基于锥形光谱调谐的亮点响应（E和F，参见B）（参见图S1D和S1E）。热图总结了目标调谐函数和每个可能锥形组合的调谐之间的均方误差（MSE），归一化在0（完美拟合）和1（不拟合）之间。离中心的距离表示模型的线性度，从次线性到向外超线性。虚线圆表示线性点，而封闭和开放圆分别表示整体最佳拟合和最佳线性拟合。相应的最佳拟合显示在图S4E-S4H中。推断的锥体比（2 s. f.）如下：光栅：0.99PR1：−0.1PR4（线性：0.75PR1:0.25PR4）；0.88PR2：−0.12PR3；点：0.45PR1:0.55PR4；0.42PR2：−0.58PR3。（G）整个对照动物群体和PR2、PR3和PR2/3锥体消融后的反应均匀性（STAR方法）。基于相对于对照的每个消融条件的单尾Wilcoxon秩和检验的统计数据，并使用Bonferroni校正进行多次比较。(pPR2 = 0.000036)(pPR3 =)(pPR2/3 = 0.0061)

PR2和PR3电路相互竞争

我们接下来使用对照和PR2/3双烧蚀动物的光谱调谐函数来计算推断光栅和点响应的潜在锥体贡献。这是可能的，通过使用每个光谱刺激条件计算的单个锥体激活作为基础函数（参见图S1A-S1E）。从这里，我们使用了两步锥组合模型15,41（图4C-4F）。来自PR2/3双烧蚀动物的数据用于推断PR1与PR4权重（图4C和4E），而对照和双烧蚀动物之间的差异用于推断PR2和PR3权重（图4D和4F）。总之，这进一步支持了PR1和PR4协同作用，而PR2和PR3相互对立的概念。

对于光栅，PR2/3烧蚀动物的光谱响应最好用PR1单独的次线性驱动来近似（87.3%解释；图4C和S4E）。来自PR4的少量额外贡献实现了接近等效和线性拟合（82.7%；图4C，开放符号）。相反，双烧蚀和对照响应之间的光谱差异最好用PR2的净正贡献和PR3的净负贡献来解释（61.3%；图4D和S4G）。同样，亮点调谐功能最好用PR1和PR4的净正贡献来解释（95.1%；图4E和S4F），但PR2减去PR3的相反贡献（92.4%；图4F和S4H）。因此，两种响应类型都指向单一的底层电路架构：来自PR1和PR4的联合驱动以及来自PR2和PR3的相互相反的调节。光栅和亮点电路的主要区别在于前者是PR1/2占主导地位和（亚）线性，而后者是PR4/3占主导地位和超线性。

除了光栅和亮点之外，对暗点的新未遮蔽反应也遵循亮点样的“U形”光谱调谐曲线，表明伴随的PR1加PR4驱动（图S4B）。在这种情况下，控制动物中暗点反应的稀疏性排除了估计相对PR2/3贡献。然而，观察到暗点反应在PR2消融（图2G）后被选择性地揭露，而不是PR3消融（图2H），指出PR2与PR3系统在对照中的不平等抑制作用。

PR2和PR3的同时消融恢复了单锥消融后失去的平衡

如果PR2和PR3在调节PR1/4驱动的回路时相互对立，那么仅选择性消融这种调节系统的一部分应该会导致视觉回路不平衡。然而，如果整个调节系统被消融，这种平衡应该会改善。例如，如果PR2/3系统受损，动物之间的个体差异可能会更明显，但如果完全缺失，则不会如此。这种效果是在与对照组（图2E）相比，这一事实在PR2或PR3单消融动物的分散反应分布中（图2G和2H）很容易观察到，而PR2/3双消融动物的反应在不同动物间的分布则明显更集中（图3G）。为了量化这一效应，我们计算了每只动物的反应分布（即对光栅、亮点、暗点、熄灭和亮起的相对反应性）与其余群体的相关性，其中1和0分别代表完全同质和随机的群体（图4G）。这证实PR2和PR3单消融动物均显著比对照组更具异质性，而PR2/3双消融动物则显著更具同质性。

为进一步探究这一观点，我们开展了另外两组双消融实验，但此次对核心系统和调控系统均进行“半消融”处理。我们推断，半消融核心系统（即仅消融PR1或PR4，而非两者同时消融）应会破坏时空模式响应，而半消融调控系统（此处仅消融PR2而非PR3）则应能部分抵消这种破坏。实验结果确实如此。PR1/2和PR4/2双消融的动物均比对照组响应性更低，但比PR1或PR4单消融的动物响应性更高（图4H–4K，对比图2和图S5）。此外，值得注意的是，这些“半消融”的动物表现出显著的异质性：在任意一组消融处理后，约有一半的动物对任何时空模式均完全无响应，而另一半的响应水平则完全处于对照组的正常分布范围内（图4L和图4M，对比图2E）。这些结果强调了PR2/3系统内的拮抗平衡，因此对其进行实验性破坏可能会导致高度的表型多样性。

视锥细胞消融会导致自发游泳行为出现类型特异性缺陷

我们接下来探究了不同的视锥回路是否以及如何与行为相关联。我们首先通过在恒定光照或恒定黑暗条件下拍摄自由游动的个体，对自发行为进行了表征（图5、图S6A和图S6B）。结果显示，所有测试的消融实验均导致自发游泳行为出现视锥类型特异性缺陷。

如前所述，42只对照组动物在黑暗环境下的游泳次数和自发转身次数明显多于光照环境（图5A）。相比之下，这种光照依赖性表型在PR1或PR4被消融后基本消失（图5B）。相反，PR1被消融的动物表现得仿佛始终处于光照环境中，而PR4被消融的动物则表现得仿佛始终处于黑暗环境中。这些结果支持了两种视锥细胞同时存在是正常视觉行为所必需的这一观点，并进一步表明，在完整的机体系统中，它们的相对激活状态有助于决定动物的行为状态。

接下来，与PR1或PR4不同，PR3敲除的动物在光照下表现正常，但在黑暗中未能完全达到与对照组相似的活动水平。相反，PR2敲除的动物始终表现出中等水平的活动（图5C）。然而，PR2和PR3的表型在PR2/3双敲除动物中得到了“挽救”，这些动物尽管在光照下的转向率升高，但在所有测试的敲除组中整体表现出最接近对照组的行为学水平（图5D）。这些结果为PR2/3相互竞争以调节而非驱动视觉这一观点提供了直接支持。

然而，尽管PR2/3双消融动物的自发活动水平大致可控，但它们确实表现出另一种独特的行为缺陷：它们出现了“过度转向”现象（图5E和5F）。无论是否光照，这些动物的平均转向幅度均比其他任何测试群体大两倍以上。由此可见，在缺乏“调控性”PR2/3系统的情况下，斑马鱼难以在连续的游动过程中稳定地直线游动。

图5. 视锥细胞类型特异性的自发游泳行为缺陷。(A–D) 持续光照（空心符号）或黑暗（实心符号）条件下自由游动斑马鱼的自发运动统计（STAR 方法）。图中展示了对照组（A）、PR1和PR4消融组（B）、PR2和PR3消融组（C）以及PR2/3双消融组（D）的结果。阴影区域表示对照组中光照和黑暗行为的四分位距。为清晰起见，仅绘制了中位数和四分位距。采用单尾威尔科克森秩和检验进行两组比较：“指标内”比较对照组与消融组（对应范围条内的黑色星号），“条件内”比较光照与黑暗条件（误差条外的彩色星号）。完整统计数据见表S2A。(E和F) 各群体单次游动和转向幅度的中位数定量分析，结果以对照组为基准进行归一化（对照组值=1）。完整统计数据见表S2B。另见图S6。

视锥细胞类型特异性的视动缺陷

我们接下来测试了视锥细胞消融对光运动反应的影响，这可能是一种祖先反射，有助于动物相对于视觉环境稳定其身体位置。我们首先采用“室内”闭环装置，在该装置中，侧向漂移光栅的方向会不断更新，以与主体的主轴对齐。在这种环境中，自由游动的对照组鱼会持续向宽视场漂移的方向转动，从而产生“盘旋行为”（图6A）。相比之下，消融不同类型的视锥细胞会导致多种行为缺陷（图6B和6C）。

图6. 视动行为与趋光性中的视锥类型特异性缺陷。（A和B）闭环视动实验中对照组（A）和PR1敲除动物（B）的典型运动轨迹。 （C）不同条件下视动表现的量化分析（STAR 方法）。统计分析基于单尾Wilcoxon秩和检验，并对多重比较进行Bonferroni校正。评估了两组配对：对照组与敲除组（上），以及PR2/3双敲除动物与PR2、PR3单敲除动物（下）（无星号，表S3A中为完整统计数据）。 （D和E）室外视动实验场的示意图（D）和实拍图（STAR 方法）。 （F）各侧所有鱼随时间变化的平均位置；虚线代表类对照组表现。 （G）（F）中各条件下视动平均表现的量化分析（无星号，表S3B中为完整统计数据）。 （H和I）额外批次对照组与PR2/3双敲除动物的视动平均表现量化（H），以及不同实验间的异质性（I），参见图S7。 （J）对照组趋光性的光谱依赖性（灰色），叠加了经功率校正的黑视蛋白光谱调谐曲线，假设其峰值吸收在480纳米处。 （K）视锥敲除后趋光性的对应光谱依赖性。为简化展示，仅显示中位数和四分位距；虚线代表类对照组表现。光谱位置与对照组的统计差异基于单尾Wilcoxon秩和检验，并对多重比较进行Bonferroni校正（无星号，表S3C中为完整统计数据）。另见图S6和图S7。

总体而言，光栅反应中枢表征的缺陷（图2和图3）是室内光运动表现的强烈预测指标：PR1、PR2和PR4被消融的动物表现出较差的光运动反应，这与大脑中光栅反应的完全丧失（PR1/4；图2D、2F和2I）或中度丧失（PR2；图2D和2G）相一致。相比之下，PR3被消融的动物未表现出明显缺陷，这与其运动光栅的中枢表征完整相符（图2D和2H）。此外，就自发游泳行为而言（图5C和5D），PR2/3的双重消融部分挽救了PR2单消融的表型。这种行为模式还意味着，在完整的神经系统中，PR2神经回路通常发挥着按压PR3回路，而PR3回路又会抑制视运动回路：PR2组与PR2/3双消融组动物之间唯一的实验差异在于PR3视锥的存在与否。因此，或许有悖常理的是，PR2消融组动物较差的行为表现必须归因于PR3视锥去抑制的网络抑制作用。

接下来，高对比度移动光栅的存在也在很大程度上掩盖了PR2/3双消融动物的自发翻转表型（图S6C，对比图5E和5F）。事实上，所有测试的消融变体的转向频率均低于对照组（图S6D），但除PR3外，所有变体均通过增加转向幅度来部分弥补这一降低（图S6C）。

此外，仅PR4消融的动物也表现出运动周期频率降低（图S6D）。后一观察结果进一步表明，除视觉缺陷外，PR1和PR4消融动物不佳的视动表现可能还部分与行为状态的系统性变化有关：PR4消融倾向于降低行为活动，而PR1消融倾向于导致活动亢进（图5B、5E、5F、S6C和S6D）。

仅PR1和PR4消融会在自然日光下导致视动缺陷

受到大脑中移动光栅的表征（图2和图3）与人工但可控的室内条件下的视动表现（图6A-6C）之间高度一致的启发，我们接下来想知道，对照组和不同视锥细胞被消融的动物在更自然的室外条件下会表现如何。为此，我们设计了一个室外视动实验场，基于一个敞口、注满水的水族箱，将其悬挂在电动传送带上以呈现刺激（图6D和图6E；视频S3；STAR方法）。该实验场被放置在正午的阳光下。随后，我们在水面两侧各悬挂一个分隔舱，每个分隔舱内约有25条对照组鱼和不同视锥细胞消融的鱼群，以在实验过程中内部控制光照条件的自然变化（如云层和阴影）。接着，我们来回移动传送带，并随时间量化每侧所有鱼的平均位置（图6F）。总体而言，这种更具自然主义的“室外”视动范式所得结果与室内装置下观察到的行为差异一致——实际上甚至更为显著（图6G，对比图6C）。最重要的是，此时仅PR1和PR4细胞消融的动物与对照组相比，在视动行为方面表现出显著且具有高度统计学意义的缺陷。相比之下，PR2、PR3和PR2/3消融的动物未表现出明显缺陷。事实上，PR3消融的动物表现虽微弱但显著优于对照组。

PR2/3双消融降低视动反应变异性

除了匹配的平均视动表现外，PR2/3双消融动物与对照组相比，视动反应的变异性也似乎更低（图6G）。为探究这一可能的效应，我们在多种天气和水环境下开展了额外实验（STAR方法学；图S7），并比较了它们的平均表现（图6H）与行为异质性（图6I）。无论是对同一批动物在短时间内重复测试时（图S7D上图），还是对比不同动物批次、实验天数及水环境下的结果时（图S7D下图及图S7A-S7C、S7E-S7G；STAR方法学），PR2/3双消融动物与对照组均持续表现出稳定且在统计学上无显著差异的视动表现（图6H）。尽管如此，PR2/3双消融动物的行为表现仍显著比对照组更具内部一致性（图6I）。PR2/3缺失后行为变异性降低——且整体表现并未下降——这一现象与它们在脑对时空模式化刺激的反应层面上异质性相应降低的结果惊人一致（图4G）。

视锥细胞调控同样适用于内在光敏感神经环路

除了视杆细胞（PR0）22和视锥细胞（PR1-n）外，脊椎动物的眼睛还包含内在感光回路，其主要承担“非成像形成”的视觉功能，包括趋光性的调控。这种祖先特征且可能普遍存在的行为，使动物能够利用光的强度和光谱信息，在所处环境中寻找最优区域。在斑马鱼幼体中，对内在感光视网膜神经节细胞（ipRGCs）进行实验性损毁会破坏这一行为。不过，ipRGCs细胞确实接收上游的突触输入，因此可能受到与影响PR1/4驱动回路相同类型的视锥调控作用的影响。

为验证这一设想，我们首先测定了对照组光趋性行为的光谱依赖性。ipRGC 中表达的光色素黑视蛋白对绿光/蓝光敏感（((lambda_{max }) 约480纳米），因此在缺乏视锥细胞额外输入的情况下，光趋性应能被中波长光最佳驱动。然而事实并非如此，相反，光趋性呈光谱双相特征，且能被紫外光或红光最佳驱动（图6J；视频S4）。基于此，我们接下来敲除了不同类型的视锥细胞，以探究哪些类型参与光趋性行为及其作用机制（图6K）。

首先，PR4 消融导致光趋化性能显著大幅下降，即使在 PR4 不敏感的长波长条件下也是如此。因此，虽然紫外线反应的丧失表明 PR4 在驱动光趋化过程中发挥直接作用，但所有波长下反应性的普遍丧失则更倾向于说明 PR4 对行为状态产生了影响。其次，PR1 消融对光趋化性无显著影响。这表明从原理上讲，尽管PR1在时空视觉中看似不可或缺（图1、图2、图3、图4、图5及图6A-6I），但仍能稳健地驱动“基础”视觉行为。第三，PR2的敲除显著增强了趋光行为，此外还使整体光谱调谐发生偏移，与仅由PR4和黑视蛋白共同驱动的潜在效应更为契合。这表明PR2通常会抑制趋光行为。第四，与PR2相反，PR3的敲除降低了趋光表现。因此，PR2和PR3的视锥通路再次表现出相互拮抗的作用。但值得注意的是，在趋光行为中，PR2与PR3的作用发生了反转，PR2发挥主要的抑制作用，而PR3则抵消这一效应。最后，与自发游泳（图5D）和视动反应（图6C）的观测结果一致，同时敲除PR2和PR3后，PR2和PR3单敲除的表型均恢复至接近对照组水平（图6K）。

讨论

关于水生视觉视锥回路组织的另一种观点

我们的研究结果对脊椎动物视网膜中视锥回路祖先水生功能组织的“经典观点”提出了挑战（图7A）。根据这一观点，视觉行为回路由来自视锥细胞加权求和的灰度信号主导。若存在拮抗性的视锥细胞作用，其也仅与色觉相关。

然而，这一观点无法解释以下几点：(1) 消融PR1和PR4后，斑马鱼对测试的时空模式的反应完全消失（图2和图3），因为在PR1和PR4缺失的情况下，PR2和PR3视锥本应继续驱动相对正常的视觉；(2) 斑马鱼视觉普遍存在的白色偏向（图1）、消融PR2/3后该偏向的消失（图4A–4F），以及时空模式反应的同时增强（图2和图3），因为要解释这些结果中的任意一个，都需要认定PR2和PR3对视觉存在净负向贡献；(3) 同时消融两种视锥后，PR2和PR3单消融的表型得到“挽救”（脑功能：图2、3、4；行为：图5、6），因为在经典观点中，消融视锥无法提升视觉表现。

相反，我们的研究结果有力支持斑马鱼视网膜中视锥回路功能组织的另一种模型（图7B）。在该模型中，视觉主要由PR1和PR4的加权贡献单独驱动。PR0（视杆细胞）在幼体斑马鱼中尚未成熟，可能将这一主要驱动延伸至弱光环境。固有感光回路为部分回路提供额外驱动。这四种光感受器系统共同构成了视觉的祖先核心，而要实现正常功能，它们的同时存在可能是必不可少的。与此一致的是，几乎所有现存脊椎动物（包括人类）的眼睛中都保留了这四种系统。

相反，至少在斑马鱼中，PR2和PR3并不负责视觉功能。相反，它们构成了一个辅助系统，负责调控核心神经回路。在辅助回路中，PR2和PR3以相互拮抗的方式相互作用，这种相互作用的最终结果（包括其正负性）决定了向不同核心回路提供调控输入的性质（图7C）。对于斑马鱼的视觉而言，PR2 和/或 PR3 的存在对于强大的视觉能力可能并非必需，这与包括人类在内的众多脊椎动物谱系独立丧失相关视觉相关基因的现象大致相符。

图7. 脊椎动物视锥细胞回路组织的另一种观点。（A）视锥信号协同作用共同驱动行为环路的经典观点。（B）本研究提出的替代环路架构，其中PR1和PR4单独构成视网膜核心环路，共同驱动所有视觉行为。相比之下，PR2和PR3环路形成辅助环路，二者相互拮抗以抑制并进而调控核心驱动。（C）该架构中针对不同视觉-行为环路亚群的权重调整示意。（D）现存脊椎动物的近似系统发育历史， inferred的祖先领地化模式以颜色编码，从水生起源（蓝色）经水陆两栖生活方式（绿色）至完全陆生（橙色）。陆生化过程在现代哺乳动物的演化支中可能快速发生，而在包括鸟类在内的现代爬行类演化支中则更为缓慢。这一模式与大多数非哺乳类四足动物保留祖先视锥辅助结构的普遍现象相关，反之，几乎所有哺乳动物均系统性丢失了这一结构（关于鸭嘴兽的讨论见正文）。参考文献见正文主要内容。

辅助视锥回路可能是一种水生特征

我们已证实，在斑马鱼体内，PR2/3辅助视锥系统的一个核心作用是在光谱层面抑制对背景的视觉反应。然而，这种“前景处理机制”在陆地上却无法发挥作用，因为空气中光的散射和吸收作用会大幅减弱。对于陆生视觉而言，同样的净抑制性视锥结构很可能会降低视觉系统的信噪比，却无法为距离估算带来任何益处。相应地，我们有理由认为，斑马鱼体内辅助视锥回路的功能结构，是对水生视觉的一种适应——而水生视觉正是脊椎动物眼睛的原始功能范畴。

如果是这样，我们应当考虑这样一种可能性：哺乳动物中视锥细胞的系统性缺失——而鸟类、爬行动物或两栖动物并非如此——可能与其早期祖先从水生到陆生的演化速度差异相关（图7D）。大多数两栖动物至今仍与水域紧密关联，爬行动物和鸟类的祖先在首次登陆后的数百万年里，也可能一直处于半水生状态。这种缓慢的登陆过程或许为它们逐步改造原本水生的视网膜结构以适应陆生视觉提供了契机。相比之下，哺乳动物的祖先在与其他羊膜动物分化后不久，便迅速登陆，而辅助视锥细胞系统或许也随之消失了。

重新审视沃尔斯的夜间瓶颈理论

与前述观点相反，沃尔斯的经典理论将哺乳动物视锥细胞的退化与恐龙时代的夜行性联系起来（约2.4亿至6500万年前），他们认为被认为负责色觉的PR2和PR3在约1.7亿年的夜间活动中几乎没有带来优势。然而，这一观点值得重新审视。

首先，视锥细胞丢失反映夜间缺乏光谱信息这一观点值得怀疑：夜间天光在光谱上与日光相似， 且许多非哺乳类脊椎动物和无脊椎动物通过提高受体敏感度实现夜间色觉。其次，我们的数据表明，色觉之外的功能可能是PR2/3丢失的根本原因。在斑马鱼中，PR2/3有助于增强水下前景，但其他非色觉相关功能很可能也存在。第三，PR2/3的丢失可能早于哺乳动物的“夜间瓶颈期”。所有哺乳动物均缺失PR222，因此PR2可能在其谱系与蜥形纲分化后不久（约3.18亿年前）就已消失。除鸭嘴兽外，PR3也均缺失，鸭嘴兽保留了PR3视蛋白基因SWS2和PR3转录因子FOXQ222,。然而，视蛋白的特性并非视锥细胞类型的完整预测指标，且FOXQ2的功能不仅限于视网膜。此外，与小型哺乳动物的普遍情况不同，鸭嘴兽缺失祖先PR4视蛋白SWS1，这使其有可能在PR4中表达SWS2视蛋白。若果真如此，哺乳动物PR3的丢失也可能早于恐龙；反之，这与沃尔斯理论的矛盾可能更为突出——PR3必须在哺乳动物祖先长达约5000万年的夜行生活中一直存在，直至单孔目与有袋动物分化（约1.87-2.10亿年前），且在鸭嘴兽谱系中经历了整个瓶颈期。

绿/蓝系统净抑制性连接的潜在神经环路

PR2和PR3神经环路的净抑制作用可以通过已明确的视网膜组织结构得到合理解释。水平细胞确立了视锥细胞的初始拮抗特性，而双极细胞以类型特异性的方式整合邻近视锥细胞的信号，由此形成平行的ON型和OFF型通路。从整体来看，双极细胞因此以两种极性生成视锥信号的系统性组合，并映射到视网膜内层的固定深度，进而形成“光谱分层”。在鱼类和其他非哺乳动物体内，多分层双极细胞使ON型和OFF型信号可共存于同一视网膜层中。这种解剖结构共同使得视锥信号组合能够灵活地映射到不同的行为模式中。例如，斑马鱼中负责运动感知的神经节细胞分层分布于外层，而负责猎物捕获的神经节细胞则集中分布于中央区域。这种光谱和行为学层面的分层特征在哺乳动物中也得到了保留。综上，在斑马鱼体内，不同视锥信号组合在视网膜内层的系统性映射为从视锥细胞到行为反应之间搭建了一座简洁且灵活的桥梁。  支持这一观点的是，鱼类、鸟类、爬行动物和两栖动物的视网膜向大脑的输出主要由ON-OPFF神经环路主导，而哺乳动物则并非如此。任何“缺失”的视锥信号组合（包括推测中重要的平衡性贡献）都可由无长突细胞来提供。除视网膜外，中枢神经环路可能还会建立额外的视锥对比度，例如在接收视网膜输入的（前）顶盖的广泛抑制神经丛中实现这一过程。

本研究的局限性

尽管PR1–4视锥细胞具有祖先特性，但目前仍不清楚包括水生和陆生在内的其他脊椎动物物种是否以及如何以与幼体斑马鱼研究所得见解相符的方式，利用其多样的视锥细胞组成。目前也不清楚我们的研究结果如何适用于成年斑马鱼的视觉。同样，斑马鱼视锥细胞是否以及如何差异化地连接到下游神经回路以支撑其在视觉中的不同作用，这一点尚未被完全阐明。在此，阐明产生本文所述“白化”效应的神经回路机制与斑马鱼及其他生物中用于“感知性”色觉的机制之间的关联，也将是关键所在。