题目：Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish

原文链接:：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6570580/PMC

期刊：Cell

研究亮点

• prkdc⁻/⁻ il2rga⁻/ 37℃饲养的斑马鱼可移植多种人类癌症

• 生长情况和治疗反应可在单细胞分辨率下动态可视化

• 奥拉帕利联合替莫唑胺可杀伤异种移植的人横纹肌肉瘤

• 移植患者来源的癌症为个性化治疗开辟了新途径

摘要

将人异种移植细胞移植到免疫缺陷小鼠体内已成为评估癌症药物临床前疗效的金标准，但对单细胞表型进行直接可视化仍存在困难。本文报道了一种光学透明的斑马鱼，该斑马鱼缺失适应性免疫细胞和自然杀伤细胞，可在37摄氏度条件下移植多种人类癌症，并能对移植的单细胞进行动态可视化观察。例如，光转换细胞谱系追踪在人类横纹肌肉瘤（一种儿童肌肉癌症）中识别出了具有迁移和增殖特性的细胞状态。额外实验证实，奥拉帕利（PARP抑制剂）联合替莫唑胺（DNA损伤剂）的组合疗法对横纹肌肉瘤具有有效的临床前疗效，并通过四色FUCCI细胞周期荧光报告系统可视化了治疗反应。这些实验表明，联合治疗可使横纹肌肉瘤细胞在细胞周期G2期停滞，随后诱导细胞凋亡。最后，患者来源的异种移植物可成功移植到该模型中，为未来开发个性化治疗方案开辟了新途径。

图形摘要

引言

细胞移植已成为评估正常和恶性细胞表型的重要实验工具（Goyama 等人，2015年）。在癌症研究中，细胞移植方法已被用于明确驱动肿瘤持续生长、转移和治疗反应的机制（Bakhoum等人，2018；Stewart等人，2017；Tian等人，2017；Das等人，2016）。利用这些方法，基因工程小鼠模型中产生的癌症可轻松移植到同基因小鼠的近交系中（Kelly等人，2007；Bruce和Van Der Gaag，1963；Curtis等人，2010）。或者，也可将人类癌症异种移植到免疫缺陷小鼠体内。最值得注意的是，目前人类癌症移植的金标准是NOD.Cg-Prkdcscid (II2 rg^{tm 1 wjl / SzJ})小鼠（Ito等人，2002）。研究人员还构建了其他表达人类细胞因子的免疫缺陷小鼠模型，这些模型能促进正常血细胞亚群以及急性髓系白血病的高效移植（Rongvaux等人，2014；Das等人，2016）。尽管免疫缺陷和人源化小鼠模型的种类不断增加，但仍存在固有局限性。例如，小鼠成本高昂且需要大量的饲养空间，这限制了实验规模。小鼠体表有毛发，通过皮肤进行成像也较为困难。事实上，单细胞成像技术主要通过制作手术窗口并利用复杂的多光子成像技术来实现体内细胞可视化（Ellenbroek和van Rheenen，2014）。由于这类窗口必须在肿瘤移植前制作，因此无法对整只动物体内的播散性癌细胞进行无偏倚的成像。

为解决这些问题，其他研究团队开发了斑马鱼异种移植方法，在适应性免疫系统发育之前的阶段，将人类癌症移植到两天大的幼鱼体内。这项精妙的研究已成功实现人类肿瘤细胞的移植，并揭示了转移和生长的新型机制（Fior 等人，2017；Chapman 等人，2014；Welker 等人，2017）。尽管取得了这些成果，但幼鱼只能移植数百个细胞，而这些细胞往往不包含长期持续肿瘤生长所需的癌症干细胞。此外，移植的斑马鱼在非生理温度（≤34℃）下饲养，因此癌细胞的增殖速率与在小鼠或人体中生长时的速率不同。移植动物也不会形成与人类相似的组织学类型肿瘤，且移植研究必然局限于幼鱼出生后10天内的实验，因为鱼类最终会产生获得性免疫反应来杀死人类癌细胞。虽然该模型对于便捷的短期药物筛选极具价值，但评估幼鱼的治疗反应时，需将整条鱼浸泡在含药水中，因此往往无法确定药物的渗透情况和准确的口服摄取量。最后，浸泡给药法无法实现精准的药物剂量、优化的给药方案，也无法在一周以上的时间内评估药效动力学——而这些都是将临床前动物研究推进到人类临床试验所需的关键终点指标。

本团队此前已利用同基因成年斑马鱼以及部分免疫缺陷型斑马鱼品系开展了大规模异体细胞移植实验（Blackburn 等人，2012；Tang 等人，2014；Ignatius 等人，2012；Moore 等人，2016a；Smith 等人，2010；Tenente 等人，2014；Moore 等人，2016b）。成年斑马鱼具备多项优势，使其成为理想的细胞移植模型，包括繁殖力高、成本低廉、身体透明，且可开展高通量药物筛选与肿瘤演化研究（Chen 等人，2014；Tang 等人，2014）。然而，截至目前，尚未有将人类癌症和组织高效移植到37℃饲养的免疫缺陷斑马鱼中的报道，这是由于缺乏同时缺失T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞的复合突变品系，且高免疫缺陷型品系的饲养条件也不够完善。本研究成功培育出光学透明的prkdc（蛋白激酶DNA激活催化多肽）和il2rga（白介素-2受体γa）双缺陷斑马鱼。该斑马鱼品系缺失T细胞、B细胞和NK细胞，可高效移植人类癌细胞，这些癌细胞的生长动力学和组织病理学特征与在NSG小鼠中生长的癌细胞高度相似。此外，我们还建立了可在体内以单细胞分辨率追踪肿瘤迁移与增殖的方法。利用这些方法，我们在横纹肌肉瘤细胞中发现了驱动增殖和迁移的关键功能多样性，为奥拉帕利聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制剂联合替莫唑胺DNA损伤剂治疗儿童横纹肌肉瘤提供了临床前理论依据。最后，我们针对多种癌症类型建立了患者来源异种移植模型（PDXs）细胞移植模型，为该模型未来应用于精准医学研究奠定了基础。

结果

透明化 prkdc 基因缺陷型斑马鱼（il2rga）可成功移植人类癌症

在此，我们报道了一种prkdc和il2rga基因缺陷的光学透明斑马鱼。这些复合突变体斑马鱼缺乏T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（Tang等人, 2017）。具体而言，prkdc⁻/⁻ il2rga⁺/号斑马鱼在正常实验室条件下饲养，且杂交完成后，所得子代在正常实验室条件下饲养，于2至3月龄时通过鳞片切除进行基因分型，随后在37℃、添加抗生素的环境中饲养至6月龄。正如预期的那样，在基因分型时，prkdc⁻/⁻ il2rga⁻/⁻基因型的斑马鱼以预期的孟德尔比例出现（4850条鱼中，(n=1,205) 基因型的鱼占(prkdc)、(il2rg)，占比24.8%），在添加抗生素的条件下饲养至6月龄的鱼存活率为84.6%（26条鱼中存活(= 22) 条；图S1A-S1C）。  为评估这些斑马鱼移植人类癌症的能力，将2月龄的(prkdc)、(il2rga) 基因型斑马鱼分别腹腔注射接种了一组慢病毒-GFP标记的人类癌细胞（每条鱼注射(5 ×10^{5}) 个细胞）。总体而言，我们使用16种荧光标记的癌症类型实现了高移植率，这些癌症类型包括黑色素瘤、肾细胞癌、慢性髓系白血病、套细胞淋巴瘤、三阴性乳腺癌以及多种肉瘤（图1A-1F和图S1D-S1M；表S1）。  重要的是，移植效果持续了(28 days) 时间，在此期间肿瘤显著生长，且与移植操作相关的总体发病率如(being <15%) 所示（图S1C）。对移植肿瘤的分析显示，每种癌症类型的肿瘤均具有相似的组织病理学和细胞形态学特征（图1和图S1），包括诊断性基因表达标志物的表达以及特征性基因融合（图1C和图S1N-S1S）。  无论是在(prkdc)、(il2rga) 斑马鱼还是在NSG小鼠中，移植的横纹肌肉瘤（RMS）、黑色素瘤和乳腺癌均具有相似的增殖和凋亡率（图1D、1E、1J、1K；(n=6) 小鼠为每株肿瘤细胞系的移植小鼠数）。综上，我们的研究结果表明，prkdc⁻/⁻ il2rga⁻/⁻ 基因型斑马鱼在37℃条件下能稳定移植多种人类癌症，这些肿瘤的生长动力学与移植到NSG小鼠中的肿瘤相似，组织学特征也与之类似。

图1. 人类癌症移植到 prkdc、il2rga 斑马鱼或NSG小鼠后，具有相似的生长动力学、组织学特征以及增殖和凋亡速率。移植后0和28天成像的整个斑马鱼的荧光和明场图像（dpt； A）并与移植小鼠的图像进行比较（G，左人类癌症具有相似的生长动力学，组织学，以及移植到prkdc i/2rga斑马鱼或NSG小鼠时的增殖和凋亡率(EGFP+)人类肿瘤细胞植入prkdc，II2rga 37C生长的斑马鱼（A-F）或NSG小鼠生长28天的相同肿瘤（G-L）合并面板）和切除的肿瘤（G，右面板）苏木精和伊红染色切片（斑马鱼，B；小鼠，H）和immunohistochem‐istry细胞谱系标记（斑马鱼，C；小鼠，I），Ki67（斑马鱼，D；小鼠，J）和TUNEL（斑马鱼，E；小鼠，K）与阳性细胞的平均百分比±均方差指出（n ≥3动物/肿瘤类型）。量化植入prkdc  II2rga ^{-1-}斑马鱼（F）和NSG小鼠（L）的相对肿瘤生长。人胚胎横纹肌肉瘤RD（ERMS RD）、肺泡横纹肌肉瘤Rh41（AR管理系统Rh41）、黑色素瘤UACC62和三阴性乳腺癌MDA-MB-231。比例尺代表0.25厘米（A）；50毫米（B-E，H-K）；和0.5厘米（G）。另见表S1和图S1。

prkdc、il2rga双突变斑马鱼可移植患者来源异种移

为了将免疫缺陷斑马鱼用作评估患者对治疗特异性反应的临床前模型这一长期目标，我们接下来评估了六株患者来源异种移植模型（PDXs）在(prkdc)、(il2rga)斑马鱼体内的移植情况。这些模型包括胶质母细胞瘤（GBM9）（Tchoghandjian 等人，2012年）、两株胚胎型横纹肌肉瘤（SJRHB000026_X1和SJRHB012_Y）（Stewart 等人，2017年）、两株由BRAFV600E突变诱导的转移性黑色素瘤（MEL167C和MEL268C）（Luo 等人，2014年），以及一株对治疗耐药的(ER+/PR+/Her2)小叶乳腺癌（BRx-07）（Yu 等人，2014年）。这些PDX模型的构建方式包括：在球体诱导细胞培养条件下传代GBM9细胞、直接从小鼠体内传代（SJRHB000026_X1和SJRHB012_Y），或从患者的循环肿瘤细胞中分离后在无锚定条件下进行短期培养（MEL167C、MEL268C和BRx-07）。正如我们在细胞系移植研究中所预期的那样，全部六株PDX模型均能高效地在(prkdc)、(il2rga)斑马鱼体内移植超过28天，在实验过程中，部分斑马鱼最终因肿瘤负荷过重而死亡（图2及表S1）。通过GFP慢病毒标记（GBM9、MEL167C和MEL268C）或使用细胞质染料（对SJRHB000026_X1和SJRHB012_Y胚胎型横纹肌肉瘤[ERMS]细胞使用CSFE，对BRx-07使用DIL），也能轻松观察到肿瘤细胞的移植情况（Fior 等人，2017年）。

图2。斑马鱼植入患者来源肿瘤的相关图像与分析。移植后0天和28天（dpt）对斑马鱼进行成像的荧光与明场合并图像（A）。苏木精-伊红染色切片（B）以及Ki67（C）和TUNEL（D）的免疫组织化学染色结果，标注了阳性细胞的平均百分比±标准差（每种肿瘤类型对应3条鱼/肿瘤样本）。移植细胞相对生长率随时间的定量分析（E）。需注意，Viafluor和DiL标记的细胞强度预计不会随时间增加，因为实验全程100%的荧光强度代表肿瘤细胞完全保留。比例尺：（A）0.25厘米；（B-D）50微米。

以单细胞分辨率可视化人类癌细胞过程

癌症是高度异质性的，通常由肿瘤细胞类型组成，这些细胞类型在驱动生长、然而，迄今为止，在移植小鼠中成像个体人类癌细胞行为一直具有挑战性，需要手术窗口构建和复杂的成像技术（Ellenbroek和van Rheenen，2014年）。建筑侵袭、基于Casper透明斑马鱼的光学透明特性（White等人，2008年），我们接下来优化了一种将人类癌细胞移植到眼周肌肉的方法，并利用共聚焦显微镜动态观察荧光标记的肿瘤细胞（图S2）（5.3×10⁵个细胞/条鱼）。该方法实现了移植后21天以上的长期移植及生长评估（图S2）。组织学分析、细胞增殖率和凋亡情况与通过腹腔注射移植到prkdc⁻/⁻斑马鱼或在NSG小鼠体内生长的癌症相似（图S2I-S2Q）。最后，通过计数移植斑马鱼体内单个增强型绿色荧光蛋白阳性（EGFP⁺）肿瘤细胞，直接实现了肿瘤生长的定量分析（图S2D和S2H），这为在体内以单细胞分辨率观察和定量分析癌细胞生长提供了前所未有的手段。

接下来我们优化了在体内长时间动态可视化癌细胞单细胞行为的方法。我们的研究重点是对横纹肌肉瘤（RMS）中的细胞生物学差异进行成像分析，横纹肌肉瘤是一种儿童软组织肉瘤，由在不同成熟阶段停滞的肌肉细胞构成。横纹肌肉瘤主要包含两种亚型：由致癌RAS信号通路驱动的胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）（Langenau等人，2007；Chen等人，2013；Shern等人，2014），以及由PAX3-FKHR或PAX7-FKHR染色体易位驱动的腺泡型横纹肌肉瘤（ARMS）（Barr等人，1993；Davis等人，1994）。本研究中，我们构建了表达核定位光转换H2b-Dendra2蛋白的人源RD ERMS细胞和Rh41 ARMS细胞（图3A-3E）。将单个细胞暴露于405纳米紫外激光下后，核定位的H2b-Dendra2蛋白会不可逆地转换为红色可通过546纳米激光检测的荧光蛋白（Chudakov等人，2007年）。我们运用这一方法，在体内对人类横纹肌肉瘤细胞进行了单独标记，并在7天的时间里对单细胞行为进行了可视化观察（图3F）。每只荷瘤鱼总共对2至3个细胞进行了光转化，随后分别在24小时、48小时、96小时和168小时对其进行重新成像（每次实验总共涉及n=50个细胞）。通过这一分析，我们发现了三种功能不同的横纹肌肉瘤癌细胞类型，分别是（1）高迁移性细胞、（2）活跃增殖细胞，以及（3）在7天成像期间不分裂也不移动的旁观者细胞（图3G和图S3）。该分析还表明，横纹肌肉瘤细胞的增殖能力和迁移能力在很大程度上是相互排斥的。增殖细胞可分化为迁移性细胞类型，反之则不行，这与我们此前在斑马鱼胚胎横纹肌肉瘤研究中的发现一致（Ignatius等人，2012年）。这项研究意义重大，因为它鉴定出了三种表型不同的人类横纹肌肉瘤细胞类型，而这些类型此前是基于斑马鱼体内模型研究推测得出的（Ignatius等人，2012）提出，但尚未在人体横纹肌肉瘤的体内实验中得到直观证实。

图3. 利用光转换Dendra2-H2b和单细胞命运图谱鉴定功能不同的横纹肌肉瘤细胞类型。（A–E）移植 H2b-Dendra2 标记 RD 细胞的prkdc⁻/⁻ il2rga⁻/⁻斑马鱼。肿瘤细胞接种至眼周肌肉，于移植后第 7 天成像。图 A 为斑马头部落射荧光全景图；图 B 为 100 倍共聚焦放大视野，图 C–E 为 200 倍共聚焦放大视野。图 B、C 是 405 nm 紫外光光转换前拍摄图像；图 D、E 为紫外照射后即刻成像，其中图 E 叠加 488 nm、563 nm 双激光通道融合成像。（F）三株经光转换标记的胚胎型横纹肌肉瘤（RD ERMS）细胞时序追踪成像。细胞经伪彩标记，分别在光转换后 0、24、48、96、168 小时连续拍摄追踪；下方示意图用波浪线代表细胞迁移轨迹，直观展示细胞命运走向。（G）胚胎型横纹肌肉瘤（RD ERMS）、腺泡型横纹肌肉瘤（Rh41 ARMS）单细胞行为定量统计，柱状图标注了每种表型对应的观测细胞数量。标尺规格：图 A 为 0.1 厘米；图 B–E 为 50 微米；图 F 为 200 微米。另参见附图 S2、附图 S3。

临床前模型鉴定出奥拉帕尼联合替莫唑胺可用于治疗横纹肌肉瘤

为进一步确立 prkdc 和 il2rga 斑马鱼作为临床前治疗模型的地位，我们接下来验证了以下假设：PARP 抑制剂奥拉帕尼与替莫唑胺这种 DNA 损伤剂结合使用时，可在体内抑制横纹肌肉瘤（RMS）的生长。在小鼠异种移植研究中，类似的药物组合能够抑制人类尤文肉瘤的生长，并已迅速进入针对该疾病的 II 期临床试验（Garnett 等人，2012；Stewart 等人，2014）。然而，迄今为止，该药物组合尚未在横纹肌肉瘤的临床前疗效研究中得到测试。为验证奥拉帕尼和替莫唑胺在斑马鱼体内的药代动力学与小鼠和人类的相似性，我们以 50 毫克/千克的等效剂量对成年斑马鱼进行了口服灌胃奥拉帕利或33毫克/千克替莫唑胺，此前已用于临床前小鼠研究，其给药剂量与人类研究中报道的剂量相近（Rajan等人，2012；Sun等人，2018；Diez等人，2010；McMahon等人，2016；Agarwala与Kirkwood，2000）。具体而言，在每个时间点通过心脏穿刺从25只动物体内采集血液，将血液混合后通过质谱法进行定量分析。正如预期的那样，奥拉帕利和替莫唑胺的血浆浓度与小鼠临床前模型及人类体内检测到的浓度相近（图S4A和S4B）（Rajan等人，2012；Sun等人，2018；Diez等人，2010；McMahon等人，2016；Agarwala与Kirkwood，2000；Stewart等人，2014）。接下来，我们评估了每种药物单独或联合使用时，在斑马鱼prkdc⁻/⁻ 、il2rga体内抑制移植的表达绿色荧光蛋白（GFP）的腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS，细胞系Rh30和Rh41）、胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS，细胞系RD和SMS-CTR）以及对照尤文肉瘤细胞（A673）生长的临床前疗效。移植后7天对斑马鱼进行拍照，随后对其单独或联合口服给药每种药物。以7天为间隔对动物给药三次，并在28天时成像观察其对肿瘤生长的影响。

（图4及图S4C-S4I）。正如预期的那样，单一治疗对整体肿瘤生长几乎没有影响，而联合治疗则能有效促使尤文肉瘤的肿瘤消退（图S4C-S4E），这与临床前小鼠异种移植实验的结果一致（Stewart等人，2014；Gill等人，2015；Garnett等人，2012）。值得注意的是，这种药物联合治疗还在所有四种测试的疾病模型中，彻底清除了移植的(EGFP+)人横纹肌肉瘤细胞（图4B-4F），而单药治疗组的动物仅出现部分缓解。

为独立验证这些结果，研究人员在实验结束时处死移植动物并对其进行切片处理，通过苏木精-伊红（H&E）染色检测组织学特征，通过Ki67抗体染色检测细胞增殖，同时采用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。组织学分析证实，单一药物治疗组动物的细胞总数整体减少，而联合治疗三个周期后，增殖细胞几乎完全消失（图4C-4E及图S4G-S4I）。综上，本研究利用临床前斑马鱼模型，揭示了人类横纹肌肉瘤对奥拉帕利联合替莫唑胺治疗的显著敏感性。

图4. 替莫唑胺与PARP抑制剂奥拉帕利联合治疗可降低移植了prkdc、il2rga斑马鱼的人横纹肌肉瘤细胞的生长。实验设计示意图（A）。移植了(EGFP+) RD细胞的prkdc、il2rga斑马鱼的荧光合并明场图像（B）。移植斑马鱼在药物给药前7天（B，左）和完成三轮药物给药后28天（B，右）的全动物成像图。移植RD横纹肌肉瘤细胞的斑马鱼的苏木精-伊红染色（C）、Ki67免疫染色（D）和TUNEL染色（E）切片。标注了阳性细胞的平均百分比±标准差（每组n = 5条斑马鱼）。RD、SMS-CTR、Rh41和Rh30细胞在给药后横纹肌肉瘤相对生长的定量分析（F）。

为了将我们的研究结果推广到更传统的小鼠异种移植模型中，我们接下来评估了单药及联合药物治疗对移植到NSG小鼠体内的横纹肌肉瘤（RMS）肿瘤的效果。具体而言，我们将表达荧光素酶的人RD和Rh41横纹肌肉瘤细胞移植到NSG小鼠的侧腹肌肉中。当肿瘤长至(300 ~mm^{3})大小时，对小鼠连续五天口服灌胃赋形剂对照、奥拉帕尼（50毫克/千克）、替莫唑胺（25毫克/千克）或联合药物（德拉普金等人，2018年）。通过生物发光法每周评估肿瘤生长情况，持续28天。在本实验中，接受单药治疗的小鼠最初，这些肿瘤在治疗后早期出现了应答，但在治疗后28天，其生长速率恢复到了与赋形剂对照组处理的动物相似的水平（图S5A–S5F）。相比之下，接受联合疗法给药的荷瘤小鼠在治疗后14天就出现了显著的肿瘤消退，且在整个随访期间，肿瘤体积始终保持较小（图S5A–S5F）。这些实验表明，联合疗法（而非奥拉帕利和替莫唑胺的单药给药）足以抑制NSG小鼠中的横纹肌肉瘤生长。

为进一步验证奥拉帕利联合替莫唑胺抑制横纹肌肉瘤（RMS）在小鼠异种移植物中生长的有效性，我们接下来将研究扩展至更大规模的NSG小鼠队列，并在更长时间内监测药物反应。具体而言，将表达荧光素酶的RD和Rh41横纹肌肉瘤细胞移植到NSG小鼠体内（n=8 / arm）。持续监测小鼠直至肿瘤体积达到(300 ~mm^{3})，随后对小鼠连续五天灌胃给药，并使其休息16天，此周期重复进行（图S5G-S5P）。在给药后10天，处死每个治疗组的两只小鼠，以量化药物对Ki67染色和TUNEL的影响（图S5I、S5J、S5N和S5O）。对表达荧光素酶的肿瘤进行生物发光成像结果显示，两个周期的联合药物治疗抑制了横纹肌肉瘤的生长，而赋形剂对照组小鼠的肿瘤持续生长（给药后14至35天，RD和Rh41细胞对应的(p<0.002)，Student’s t检验）。正如预期的那样，联合药物治疗导致了整体细胞密度降低、Ki67阳性细胞减少以及凋亡性TUNEL阳性细胞数量增加（图S5H-S5J和S5M-S5O）。最后，我们在胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）的患者来源异种移植（PDX）模型中检测了奥拉帕尼联合替莫唑胺的疗效。具体而言，将SJRHB000026_X1和SJRHB012_Y横纹肌肉瘤（RMS）肿瘤移植到NSG小鼠体内(n = 6/arm)，并按上述方法评估其对联合治疗的反应（图5）。不出所料，两种PDX模型在给药两个周期后均出现了显著的肿瘤消退，而对照组处理的肿瘤则持续生长（42天时P=0.008，费希尔精确检验；图5B和5E）。与载体对照组处理的小鼠相比，移植人横纹肌肉瘤PDX的小鼠生存期也显著延长（SJRHB000026_X1，(p=0.007)；SJRHB012_Y，(p=0.0001)，曼特尔-考克斯对数秩检验；图5C和5F）。总体而言，我们使用细胞系和PDX模型开展的小鼠异种移植实验结果，与斑马鱼异种移植研究中的观察结果一致，有力地证实了奥拉帕尼联合替莫唑胺作为人横纹肌肉瘤有效治疗方案的临床前疗效。

图5. 替莫唑胺与PARP抑制剂奥拉帕利联合治疗可降低NSG小鼠中患者来源横纹肌肉瘤的生长。（B）、(C)、(E)和(F)中的红色箭头标注了药物给药方式。另参见图S5。42天联合药物治疗（42天，A和D）。分别对应B和E中数据的42天相对生长量化结果为p=0.001和p=0.008。移植了两种独立的横纹肌肉瘤患者来源的异种移植物（RMS PDXs）并经口服赋形剂对照的小鼠代表性图像，展示了治疗后21天（21天）的情况；Fisher精确检验结果，以及图(C)和(F)中的Kaplan-Meier生存分析（图内标注了p值，采用对数秩检验，每组n=6只小鼠）。持续五天

利用斑马鱼异种移植模型在单细胞分辨率下可视化药物反应的药效动力学

为了探究上述药物反应对细胞周期的影响，并实现体内联合治疗药效反应的实时可视化，我们接下来构建了稳定表达的人RD横纹肌肉瘤细胞和Rh41腺泡横纹肌肉瘤细胞FUCCI4 细胞周期荧光报告系统（Bajar 等人，2016）。这种四色报告系统在 G1 期发出蓝绿色与 Kusabira-橙荧光的组合信号，S 期为蓝绿色与三叶草荧光的组合信号，G2 期仅发出三叶草荧光，M 期则是三叶草与栗色荧光的组合，因此能够以单细胞分辨率实时追踪活的横纹肌肉瘤细胞的增殖情况与细胞状态（图 6A）。由于鱼类和小鼠移植的人类肿瘤具有相似的增殖速率，因此当 RD 和 Rh41 细胞分别在免疫缺陷斑马鱼和 NSG 小鼠中培养时，各细胞周期状态下细胞的总体占比相同，这一结果并不意外（图 S6）。我们接下来通过将 FUCCI4+ 横纹肌肉瘤细胞移植到眼周肌肉中培养 7 天，随后给鱼类灌胃载体对照、单一药物或联合药物，以单细胞分辨率评估治疗响应的动力学。随后在处理后 1、2、4 和 7 天对这些鱼类进行成像检测（图 6B；n=100 为每个时间点/药物处理的移植细胞，n=3 为实验动物数量）（按每个条件进行分析）。采用该方法，与对照组或单药治疗组的斑马鱼相比，联合治疗早在药物处理后两天就加速了G2期阻滞的RD和Rh41细胞的出现时间与数量（图6C至6I），这表明在联合治疗的动物体内，G2期阻滞先于细胞凋亡发生。综上，本研究证实奥拉帕利联合替莫唑胺是横纹肌肉瘤异种移植研究中的有效治疗方案，并确立prkdc⁻/⁻ il2rga⁻/⁻斑马鱼模型作为 in 体内工具，可在单细胞分辨率下动态成像体内药效治疗反应。

图6. FUCCI4 细胞周期成像显示，奥拉帕利 PARP 抑制剂与替莫唑胺联合处理可使移植到 (prkdc)、(il2rga) 斑马鱼中的人横纹肌肉瘤细胞快速发生 G2 期细胞周期阻滞。FUCCI4+细胞报告基因示意图（A）和实验设计（B）。表达FUCCI4的RD细胞的单荧光通道或合并图像，(FUCCl4) RD横纹肌肉瘤细胞经眼周移植至prkdc/、(il2rga)斑马鱼体内（C-G）。右侧的合并图像表示单个细胞的细胞周期状态。药物处理前（C）以及接受对照溶剂（D）、替莫唑胺（TMZ；E）、奥拉帕尼（F）或TMZ+奥拉帕尼（G）治疗7天后细胞的高倍放大图像。RD胚胎横纹肌肉瘤（ERMS）细胞（H）和Rh41腺泡横纹肌肉瘤（ARMS）细胞（I）细胞周期效应的定量分析。绿色星号表示与溶剂对照组相比，G2期阻滞细胞数量存在统计学差异；黑色星号表示单独使用奥拉帕尼或单独使用替莫唑胺治疗的动物与联合治疗的斑马鱼相比存在差异（通过Fisher精确检验，p 0.05，每个时间点分析n=100个细胞，n=3只动物/条件）。比例尺为10微米（C-G）。另见图S6。

讨论

Casper 品系的 prkdc、il2rga 免疫缺陷斑马鱼模型能够稳定移植多种人类癌症，可在37摄氏度条件下培养，可实现对癌细胞移植的长期单细胞可视化。基于该模型的光学透明特性，我们采用多种细胞标记方法，在体内以单细胞分辨率追踪细胞迁移、生长及治疗反应。我们预计，更多的报告基因和成像技术将能便捷、动态地可视化癌症的诸多其他特征。例如，我们此前曾利用fli1:mCherry荧光转基因斑马鱼，在活体动物中可视化癌相关血管网络的形成（Moore等人，2016b），并优化报告基因品系，基于体内肌源性转录变化动态观察横纹肌肉瘤癌症干细胞（Ignatius等人，2012；Hayes等人，2018）。其他研究人员则利用荧光报告基因量化发育过程中的细胞凋亡（To等人，2016），并通过转录读数在斑马鱼幼虫中可视化治疗反应（White等人，2011；Kaufman等人，2016）。将这些方法应用到我们的模型中后，将广泛适用于开展调控癌症多种进程的药物和基因筛选研究。

我们的模型能够稳定移植患者来源异种移植物（PDXs）的癌症，这一点也尤其令人振奋。尽管利用免疫缺陷小鼠模型可以实现从切除肿瘤细胞和循环肿瘤细胞中移植PDXs（Luo等人，2014；Yu等人，2014），但我们设想利用免疫缺陷斑马鱼培养患者自身的肿瘤，开展大规模临床前测试，以帮助对患者进行分层，使其进入最有可能预测肿瘤产生应答的临床试验。结合斑马鱼模型在大规模、高通量药物筛选方面的固有优势，还可以通过灌胃给药开展联合药物筛选，实现精准且符合临床相关的给药剂量。我们在斑马鱼上的研究还确立了评估体内药物应答药代动力学的方法，并能利用成年斑马鱼实时动态可视化药效动力学。与NSG小鼠类似，我们设想这些模型也可用于移植更广泛的组织类型，包括胚胎干细胞（ES）、诱导多能干细胞（iPSCs）以及正常干细胞群，极大拓展干细胞和再生医学领域中可通过异种移植物完成的活细胞成像实验类型。

我们的研究还揭示了人类横纹肌肉瘤（RMS）细胞中显著的功能多样性。例如，通过光转换dendra2-H2b细胞系追踪，我们在体内对单个细胞进行了可视化观察并追踪了其细胞命运。我们观察到三种不同的肿瘤细胞行为：包括主动迁移的细胞或相互排斥的分裂细胞，以及在七天成像过程中几乎无活动的旁观者细胞。这一发现表明，具有迁移能力和增殖能力的人类横纹肌肉瘤细胞主要局限于不重叠的细胞亚群，这与我们此前在斑马鱼横纹肌肉瘤中的研究结果一致（Ignatius等人，2012年）。这些发现也与对移植有人乳腺导管癌的小鼠进行的活体成像研究结果相符，该研究证实了具有增殖能力的癌症干细胞和无增殖能力的迁移细胞状态的存在（Beerling等人，2016年）。另有研究表明，黑色素瘤和乳腺癌也存在不同但呈动态变化的细胞状态，这些状态在自我更新、治疗反应和/或迁移方面存在差异（Roesch等人，2010年；Chaffer等人，2013年）。事实上，一部分横纹肌肉瘤细胞可基于特定因素在干细胞状态与分化细胞状态之间发生动态转变NOTCH1 表达升高相关（伊格内修斯等人，2017年），这为未来在人异种移植肿瘤中识别和成像这些罕见的细胞状态变化提供了可能性。

我们在斑马鱼身上进行的临床前模型研究还发现，将PARP抑制剂奥拉帕尼与DNA损伤剂替莫唑胺联合使用，是在体内清除人类横纹肌肉瘤细胞的有效疗法。当在小鼠异种移植模型中使用横纹肌肉瘤细胞系和患者来源的异种移植物（PDXs）测试相同的药物组合时，我们进一步证实了结果的一致性。值得注意的是，尽管胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）和腺泡型横纹肌肉瘤（ARMS）由不同的致癌驱动因子转化而来，但二者均对联合治疗有反应。更令人惊喜的是，所有六个测试的模型都对联合治疗产生了反应，这表明我们的临床前模型可能找到了一种可用于治疗多种横纹肌肉瘤的强效药物组合。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）在修复单链DNA切口方面发挥着重要作用，阻断PARP活性会使细胞依赖同源重组途径修复DNA断裂。因此，乳腺癌易感基因1（BRCA1）、BRCA2或BRCA2结合辅助定位因子（PALB2）缺陷的肿瘤无法有效修复DNA断裂，导致接受PARP抑制剂治疗的细胞死亡（Ray Chaudhuri等人，2016）。尽管PARP抑制剂最初被认为主要通过抑制酶活性发挥作用，但奥拉帕尼还有另一种作用模式：它将PARP与DNA紧密结合并锁定，从而阻断DNA复制（Murai等人，2012）。这些发现表明，奥拉帕尼与DNA损伤剂的联合治疗在包括横纹肌肉瘤在内的DNA修复通路完整的肿瘤中具有更广泛的应用前景。其他肿瘤细胞的体外实验显示，奥拉帕尼与替莫唑胺联合治疗可将细胞阻滞在G2期（Murai等人，2014；Garnett等人，2012），但在本研究之前，尚未在活体异种移植动物中以单细胞分辨率实现联合治疗的体内药物反应和动力学研究。由于奥拉帕尼联合替莫唑胺的治疗方案目前正在尤文肉瘤的II期临床试验中评估疗效，我们的研究为在更广泛的儿童肉瘤（包括横纹肌肉瘤）中评估该药物组合提供了迫切需要的临床前依据。

方法细节

慢病毒载体与稳定细胞系的构建

将2毫克的pLenti-CMV-GFP-puro、pLKO.1-CMV-mKate2-Luc、pLenti-CAG.H2B-Dendra2.W（Addgene #51005）、pLL3.7m-CloverGeminin (1-110)-IRES-mKO2-Cdt (30-120)（Addgene #83841）以及pLL3.7m-mTurquoise2-SLBP (18-126)-IRES-H1-mMaroon1（Addgene #83842）与2毫克pCMV-dR8.91、0.2毫克pVSV-g以及TransIT-LT1转染试剂（Mirus Bio公司产品）共同转染至HEK293T细胞中。收集含有慢病毒的细胞上清液，经过滤后，在4毫克/毫升聚凝胺（Millipore公司产品）存在的条件下，添加至本研究使用的细胞系中。在本研究的部分实验中，将含有pLenti-CMV-GFP-puro的病毒颗粒添加至细胞系；将含有pLKO.1-CMV-mKate2-Luc的病毒颗粒添加至RD和Rh41细胞系，并通过荧光激活细胞分选（FACS）进行筛选；将含有pLenti-CAG.H2B-Dendra2.W的病毒颗粒添加至RD和Rh41细胞系，同样通过FACS筛选；将含有pLL3.7m-Clover-Geminin (1-110)-IRES-mKO2-Cdt (30-120)和pLL3.7m-mTurquoise2-SLBP (18-126)-IRES-H1-mMaroon1的病毒颗粒依次添加至RD和Rh41细胞系，再通过FACS完成筛选。

人癌细胞移植至斑马鱼及肿瘤生长定量分析

人类癌细胞系在T75细胞培养瓶中培养至90%汇合度，若为贴壁细胞则用胰蛋白酶处理，计数后重悬于基质胶（Corning）中，其中UUID为(2.5 ×10^{7} cells / mL)。随后向注射混合物中加入氯膦酸脂质体（Clodrosome，Encapsula nanoscience公司，1毫克/毫升），以在最初7天内抑制巨噬细胞对移植细胞的早期吞噬。使用30号半针头（BD公司，UUID为5 ×10^{5}）向受体鱼的腹腔注射10至20微升细胞悬液，每尾鱼注射对应数量的细胞。眼肌注射则注射2微升细胞悬液，每尾鱼注射对应数量的细胞（UUID为5 ×10^{4}）。随后将受体斑马鱼置于37℃、含上述抗生素的灭菌鱼水中饲养。使用相同的紫外线强度和相机曝光时间进行全动物落射荧光成像（显微镜：Olympus MVX10，相机：Olympus DP74）。通过Image J软件量化二维图像面积，并乘以绿色荧光蛋白（GFP）平均荧光强度来计算肿瘤体积。这些方法目前是该领域的标准手段，与在小鼠模型中开展的荧光素酶生物发光成像是类似的（Kaufman等人，2016；He等人，2016；Cox等人，2016；Lobbardi等人，2017；Yan等人，2015；Li等人，2019；Chen等人，2014）。部分实验还利用共聚焦显微镜在100倍放大倍数下直接计数绿色荧光蛋白阳性（GFP+）细胞（Zeiss LSM710倒置显微镜，详见下文）。此类实验中，从150至200微米的图像堆栈（每个共聚焦切片10微米）生成最大投影图像，并进行人工计数。当受体鱼因肿瘤大量生长濒临死亡时，或在UUID为(≥28dpt)的时间点将其处死，用4%多聚甲醛固定，随后按照先前描述的方法进行切片和组织学检测（Tang等人，2014；Moore等人，2016b）。针对标记有其他荧光报告基因的癌细胞以及患者来源的异种移植（PDX）肿瘤的移植实验，也采用了类似的方法。

共聚焦成像技术对活体斑马鱼进行单细胞成像

使用倒置LSM 710共聚焦显微镜（蔡司公司）并结合Zen软件平台（蔡司公司）对眼周移植细胞进行成像，具体方法参考秦等人的研究（唐等人，2016年）。将移植后的斑马鱼用0.01%低剂量三卡因（西方化学公司产品）麻醉，放置于36毫米玻璃底培养皿（赛默飞世尔科技公司，产品编号150680）中，并用1%低熔点琼脂糖（赛默飞世尔科技公司）包埋其躯干，以固定斑马鱼便于成像。为保证成像过程中斑马鱼持续处于麻醉状态，将其浸没在5毫升含0.01%三卡因的养鱼水中。成像仅持续2至3分钟，通过放置在成像载物台上的四个热敷袋（OccuNomix公司）将实验温度维持在37摄氏度。使用10倍物镜（数值孔径0.45）进行连续Z轴堆叠成像，总放大倍数达到100倍。单细胞命运追踪和FUCCI4细胞周期成像研究均在肿瘤成功移植7天的斑马鱼中开展。值得注意的是，连续7天使用0.01%低剂量三卡因麻醉对移植斑马鱼进行每日成像，整体死亡率较低（45条斑马鱼中仅5条在连续成像后死亡）。

通过使用488纳米的(emission =493-586 ~nm ) (emission = 575-703 nm)激光，以30%的激光功率持续2分钟进行连续Z-stack成像，完成了对RD-H2b-Dendra2和RH41-H2b-Dendra2细胞的细胞谱系追踪。后续成像在转化后的24、48、96和168小时进行。在Dendra转化实验中，使用ImageJ对细胞进行了伪彩色处理。FUCCI4 细胞周期成像研究对 mTurg2 ( excitation =458 ~nm)、(emission =472-508 ~nm）、Clover ( excitation =488 ~nm)、(emission =493-586 ~nm )、mKo2 (excitation =561 ~nm)、(emission =575-703 ~nm) 以及 mMaroon1 ( excitation =633 ~nm)（发射波长为 599-689 纳米）进行了成像。使用 ImageJ 对图像进行人工注释和计数（从 n ≥3 只动物的每个分析时间点统计 (n=100) 个细胞），并采用费希尔精确检验进行定量分析。

检测斑马鱼中奥拉帕尼和替莫唑胺的血浆浓度

野生型斑马鱼经口灌胃给予50 mg/kg奥拉帕利或33 mg/kg替莫唑胺。在给药后0、2、24、48和96小时，每个时间点采集25只动物并合并样本（n=25/时间点/药物）。将动物置于冰水中安乐死并擦干。使用涂有EDTA的胰岛素针头（BD生物科学公司）刺破动物心脏采集血液。斑马鱼血浆在4℃、1000倍重力下离心10分钟后获得澄清上清液。血浆浓度的测定方法参考既往报道（Sun等人，2018；Peer等人，2016）。简要而言，将氘代替莫唑胺和氘代奥拉帕利的储备液溶解于酸性甲醇（由乙酸铵缓冲液配制，并用10%的1当量盐酸溶液稳定）或微温甲醇中。向鱼血浆中加入200微升氘代替莫唑胺工作液或250微升氘代奥拉帕利工作液。加入1毫升乙酸乙酯进行液-液萃取。将上清液干燥后，分别用10毫摩尔/升乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸，10毫摩尔/升，pH 3.5）-甲醇（体积比20:80）或0.1%甲酸水溶液复溶，对应替莫唑胺和奥拉帕利。所有质谱实验均在Triple TOF 6600系统（AB Sciex公司）上进行，并与岛津HPLC LC20AD液相色谱系统（美国岛津公司）联机。奥拉帕利或替莫唑胺在15厘米×2.1毫米、2.7微米的Ascentis express肽ES-C18分析高效液相色谱柱（Sigma-Aldrich公司）上分离，该色谱柱前接C18保护柱（内径2.1毫米，Phenomenex公司）。

评估斑马鱼异种移植物的治疗反应

将荧光标记的RD、Rh41、SMS-CTR、Rh30和A673细胞通过腹腔和/或眼周移植到受体鱼体内。在注射后7天筛选移植成功的鱼，并经口给予10毫升药物。工作储备液为1毫克/毫升奥拉帕利、0.66毫克/毫升替莫唑胺，或0.5毫克/毫升奥拉帕利与0.33毫克/毫升替莫唑胺的组合（溶剂为含1%二甲基亚砜的1×磷酸盐缓冲盐水）。使用汉密尔顿22G针头和22G软头导管进行灌胃（Dang等人，2016）。分别在移植后7天、14天和21天对受体鱼进行口服给药，并按上述方法对受体鱼进行成像。28天时，将动物固定在4%多聚甲醛中，进行切片和组织学检查。组间比较采用方差分析（ANOVA），随后进行Student's t检验（n=5为每个处理组的鱼数量）。

小鼠异种移植研究

将人类肿瘤细胞以1:1的比例包埋在基质胶中，每100毫升含2–5个(2-5 ×10^{5})细胞，然后皮下注射到8周龄麻醉的雌性NO (D.Cg-Prkdc ^{scid } | 2 rg^{tm 1 Wil} / SzJ () NSG小鼠（Charles River Laboratories）的侧腹。对于未标记的肿瘤，使用卡尺测量监测其生长。对于移植了表达荧光素酶的肿瘤细胞的动物，以75毫克/千克的剂量腹腔注射荧光素，每周进行成像（IVIS，珀金埃尔默）。实验结束时，处死移植受体小鼠，取出肿瘤，用4%多聚甲醛固定，然后切片进行组织学检查，具体步骤如下。这些实验方案与先前报道的相似（Yu等人，2014；Hayes等人，2018）。

一部分实验评估了奥拉帕利联合替莫唑胺治疗在接种荧光素酶表达的RD和Rh41细胞系或未标记PDX模型（SJRHB000026_X1和SJRHB012_Y）的小鼠中的疗效。对于所有横纹肌肉瘤模型，细胞以(1 ×10^{6})的剂量接种，皮下注射至8周龄雌性NSG小鼠的侧腹。当移植肿瘤体积达到300 mm (300 ~mm^{3})时，对动物进行载体对照（1%羧甲基纤维素或10%2-羟丙基-β-环糊精/PBS）、奥拉帕利（50 mg/kg）、替莫唑胺（25 mg/kg）或联合药物的灌胃处理。奥拉帕利每日给药两次，间隔8小时，而替莫唑胺在首次给予奥拉帕利后4小时每日给药一次。动物接受5天治疗，休息16天，在部分实验中重复该周期。肿瘤生长通过整体荧光素酶生物发光成像的差异或卡尺测量进行量化，如先前所述（Yu等人，2014；Drapkin等人，2018；Hayes等人，2018）。组间比较采用方差分析（ANOVA），随后进行Student t检验。

组织学、免疫组织化学与荧光原位杂交检测

移植有人源肿瘤的斑马鱼和小鼠经4%多聚甲醛（PFA）固定，石蜡包埋后切成5微米厚的切片。切片通过苏木精-伊红（H&E）染色、免疫组化（IHC）或荧光原位杂交（FISH）进行染色。免疫组化染色所用一抗为：兔单克隆抗Ki67抗体（Abcam）、兔多克隆S100抗体（Leica）、小鼠单克隆泛角蛋白抗体（Abcam）、兔多结蛋白抗体（Abcam）、小鼠单克隆抗myod抗体（Dako）、兔多克隆抗肌生成素抗体（Santa Cruz）、兔单克隆CD99抗体（Abcam）以及TUNEL试剂（赛默飞世尔科技）。二抗为生物素化山羊抗兔IgG抗体（Vectorlabs）和生物素化马抗鼠抗体（Vectorlabs），显色步骤使用Vectastain ABC试剂盒（Vectorlabs）完成。荧光原位杂交实验在福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤切片上进行，针对A673异种移植瘤使用LSI EWS1双色断裂分离探针（雅培-Vysis），针对Rh30和Rh41异种移植瘤分别使用Vysis FOXO1断裂分离FISH探针（雅培-Vysis），实验操作严格遵循制造商的说明书。

分别通过Ki67和TUNEL的免疫组化（IHC）染色对细胞增殖与凋亡进行定量分析。随机选取三个包含肿瘤的视野，使用奥林巴斯BX41显微镜在400倍放大倍数下进行成像。NA Iftimia在不知情的情况下完成定量分析，其收到的图像未附带处理标签，并使用免疫组化分析工具（ImageJ）进行分析。为对所选视野内的免疫组化和TUNEL染色进行无偏倚的定量评估，采用固定阈值对样本进行分析[26]。通过将药物处理样本中阳性染色细胞的数量除以总细胞数，计算增殖细胞（Ki67）和凋亡细胞（TUNEL）的百分比。苏木精-伊红（H&E）染色切片在400倍放大倍数下成像，并以单位面积内的细胞数量进行定量分析。

定量与统计分析

包括样本量（n值）、P值和统计检验方法在内的统计细节，详见研究方法、研究结果及图表图例。柱状图中的数据以绝对数呈现，并标注了平均值±标准差（SD）。如图所示，采用方差分析（ANOVA）和学生t检验计算组间显著性差异。部分实验采用费希尔精确检验来比较两个样本的数值。p ≤0.05  0.05被认为具有统计学意义。所有实验中，斑马鱼和小鼠均被随机分配至实验组。所有统计分析均使用Prism 7软件（Graphpad公司）完成。

补充图表

图S1.与图1相关的prkdc、il2rga斑马鱼的生存分析和异种移植定植分析。对prkdc斑马鱼进行的Kaplan-Meier生存分析：这些斑马鱼在生命60至90天时通过鳞片切除进行基因分型，随后直接放回无抗生素处理的系统水中，在28.5℃下饲养（A）；或在补充了抗生素的独立4升水箱中饲养，在37℃下培育（B）。 对prkdc、 il2rga⁻/⁻鱼进行的Kaplan-Meier生存分析：这些鱼注射了假手术对照或人癌细胞，在我们补充了抗生素的循环系统中于37℃下饲养（C，181只移植动物中有(n=155)只存活至移植后60天）。 对数秩检验，无显著性差异（NS）。 在prkdc-/-、II2rga⁻/⁻ 斑马鱼中生长的EGFP+人癌的代表性荧光与明场合并图像（D和I）。图像分别显示移植后0天（左侧，D和I）和移植后28天（右侧，D和I）。 移植肿瘤的苏木精-伊红染色切片（E和J）。 Ki67免疫组化分析（F和K），以及TUNEL染色（G和L），并标注阳性细胞的平均百分比±标准差（每种肿瘤类型(n≥3条鱼）。 成功定植于单个prkdc、il2rga斑马鱼体内的EGFP+人癌细胞的相对生长定量分析（H和M）。 最左侧图（D）和（I）的右上角标注了肿瘤类型，细胞系名称见左下。慢性粒细胞白血病（CML）、平滑肌肉瘤（LMS）、恶性周围神经鞘瘤（MPNST）、胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）以及腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）。比例尺代表0.25厘米（图D和I）；50毫米（图E-G和J-L）。对异种移植的Rh30腺泡状横纹肌肉瘤（图N和O）、Rh41腺泡状横纹肌肉瘤（图P和Q）以及A673尤因肉瘤（图R和S）进行临床诊断标志物和特征性基因融合表达的免疫组织化学检测。采用荧光原位杂交（FISH）技术对FKHR（图O和Q）或EWS1（图S）进行诊断性检测。由于探针跨越已知的FKHR或EWS1基因组断裂点，信号分离代表发生了易位。比例尺代表50毫米（图N、P和R）和5毫米（图O、Q和S）。

图S2。H2b-EGFP+横纹肌肉瘤细胞在prkdc il2rga斑马鱼眼周肌肉中的植入，与图3相关。(A–H) 横纹肌肉瘤（RMS）肿瘤细胞的活细胞成像及随时间的定量分析（胚胎性横纹肌肉瘤RD：A–D；腺泡状横纹肌肉瘤Rh41：E–H）。移植(EGFP+)肿瘤细胞的斑马鱼a prdc⁻/⁻ 、i/2rga头部区域的明场与荧光合成图像，展示移植后21天（dpt）的情况（A和E）。移植后0天（0 dpt，B和F）及21天（21 dpt，C和G）的连续Z-stack共聚焦图像。(EGFP+)细胞随时间的定量分析（D和H）。(I–Q) 移植至眼周肌肉的肿瘤的组织学分析，于治疗后21天进行分析（胚胎性横纹肌肉瘤RD：I–M；腺泡状横纹肌肉瘤Rh41：N–Q）。苏木精-伊红染色切片（I和N为低倍镜图像；J和O为框选区域的高倍镜图像）。Ki67（K和P）和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（TUNEL，M和Q）的免疫组化分析，标注阳性细胞平均百分比±标准差（n ≥3条鱼/肿瘤）。比例尺：0.1厘米（A和E）；50微米（B、C、F和G）；200微米（I和N）；50微米（J–M和O–Q）。

图S3。利用光可转化Dendra2-H2b和单细胞命运图谱鉴定功能不同的横纹肌肉瘤细胞类型，与图3相关。（A–F）分别为光转换前后，经眼周移植到 prkdc⁻/⁻、II2rga 斑马鱼体内的 RD-H2b-Dendra2 细胞的单通道图像，对应时间点为 0（A 和 B）、24（C）、48（D）、96（E）和 168（F）小时。488 纳米成像（上图）和 546 纳米成像（下图）。比例尺为 200 微米（A–F）。每个表型的 n = 50、n=50、n=18 均标注在每个命运图谱渲染图的左侧。

图S4 替莫唑胺与PARP抑制剂奥拉帕利联合治疗可在体内抑制人尤因肉瘤和横纹肌肉瘤的生长，与图4相关。成年斑马鱼经口灌胃后奥拉帕尼（A）或替莫唑胺（B）的血浆浓度（红色，n = 25 鱼/时间点），并与既往发表的小鼠（蓝色）和人体研究（绿色）数据进行对比。（C）移植了(EGFP+) A673 尤因肉瘤细胞的prkdtc、il2rga⁻/⁻斑马鱼的荧光与明场合并图像。在移植后0天、7天（给药前）和移植后28天（完成三个给药周期后）对斑马鱼进行成像。（D）通过随时间变化的荧光强度评估相对生长量的量化结果，标注了单只斑马鱼的编号。（E）瀑布图展示相同数据，以从第0天到第28天的相对生长量呈现。采用Student's t检验，++ p<0.001、(n=5)。无显著性差异（NS）。prkdc、il2rga 斑马鱼的荧光与明场合并图像。（F）移植了EGFP+Rh41细胞的斑马鱼全身成像。在移植后0天、7天（给药前，F左）和移植后28天（完成三个给药周期后，F右）对移植斑马鱼进行成像。（G-I）移植了Rh41横纹肌肉瘤细胞的斑马鱼（n ≥3 只斑马鱼/处理组）的苏木精-伊红染色（G）、Ki67免疫染色（H）和TUNEL染色（I）切片。比例尺：（C、F）0.25厘米；（G-I）50毫米。

图S5。联合奥拉帕里和替莫唑胺，但不是单一药物给药，抑制NSG小鼠中人RMS生长，与使用RD ERMS（A-C和G-K）和Rh41 AR管理系统（D-F和L-P）的异种移植研究相关。给药前（0天）和治疗指定天数（A、D、G和L）后RMS细胞的荧光素酶生物发光成像。在药物治疗后14天评估时量化给药后相对RMS生长的瀑布图（B和E）。随着时间的推移与单个动物的相对RMS生长的量化表示（C和F）。五天的药物*p<0.05 n=3单一药物治疗的小鼠（n=3只动物/治疗）。（G-P）联合治疗也抑制了NSG小鼠更大队列中的RMS生长。RD ERMS（G-K）和Rh41 AR管理系统（L-P）。苏木精和伊红染色切片（H和M）。Ki67（I和N）和TUNEL（J和O）的IHC，平均阳性细胞百分比±均方差。量化单个动物随时间的相对RMS增长表示（K和P）。给药天数表示p<0.002

图S6。FUCCI4细胞周期报告动力学在prkdc、il2rga斑马鱼或NSG小鼠中移植的人横纹肌肉瘤之间没有差异，与图6相关。在NSG小鼠（A）或斑马鱼（B）中生长28天的人RD ERMS的低温恒温器切片。在NSG小鼠（C）或斑马鱼（D）中生长28天的人Rh41 AR管理系统的低温恒温器切片。注意到单个荧光通道。向右合并的图像表示单个细胞的细胞周期状态。（E）用于慢病毒转染RD和Rh41 RMS细胞的FUCCI4+细胞报告器示意图。RD ERMS中细胞周期的量化（F；n=311细胞计数跨3斑马鱼和n=621 celis计数跨6只小鼠）和Rh41 AR管理系统（G；n=283细胞计数跨3斑马鱼和n=701细胞计数跨6只小鼠）。当由学生的t测试(p > 0.05)评估时，在免疫缺陷鱼类或小鼠中生长的肿瘤之间的细胞状态没有显著差异。标尺条代表10 m（A-D）。