标题：A high-resolution phenotypic screen identifies regulators of CNS axon diameter in zebrafish

期刊：PLOS Biology

原文链接：https://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.3003895

摘要

神经元形态发生的分子机制仍有待全面阐明。在模式系统中开展发现性筛选是揭示生物过程分子基础的关键一步。本研究利用斑马鱼模型，筛选中枢神经系统中调节轴突直径的分子。轴突直径存在显著差异，较大的轴突具有更快的传导速度。轴突直径影响髓鞘形成，可被动态调控，且在疾病状态下会发生改变。然而，由于体内轴突体积微小且结构复杂，对其直径的研究一直面临挑战。为此，我们构建了自动化高分辨率活细胞成像与分析筛选平台，用于鉴定调控斑马鱼大型毛特纳轴突直径的药理学调节剂。我们对880种化合物进行了筛选，共获得33个阳性候选物。通过验证该筛选流程，我们证实影响β-2肾上腺素能受体和多巴胺信号通路的化合物可增大轴突直径。本研究首次实现了基于体内亚细胞成像的轴突直径变化筛选，为研究神经元形态这一关键特征的生物学机制提供了重要切入点。

引言

我们对体内决定和调控细胞形态与功能复杂性的机制的理解仍有待全面阐明。特别是，我们对脊椎动物中枢神经系统中神经元的巨大多样性和复杂性受何种因素控制的认识尚不完整。通过在果蝇、秀丽隐杆线虫和斑马鱼等模式生物中开展的表型发现筛选，我们对神经元的生长和连接性有了重大认识，这些筛选已确定了轴突寻路、神经支配和突触形成所需的因子。然而，神经元形态的其他特征仍有待进一步研究。相对棘手。例如，我们对控制轴突形态（尤其是轴突直径）的因素的理解相对有限。这在很大程度上是因为难以在完整的系统或神经环路中直观呈现轴突直径的多样性及其动态变化。

以脊椎动物神经系统为例，轴突的直径差异可达100倍以上，从约0.1微米到数十微米不等，这意味着不同轴突占据的横截面积相差约10000倍。轴突直径约100倍的差异，伴随着动作电位沿轴突传导速度约100倍的差异，直径更大的轴突传导速度也相应更快。除了轴突之间的差异，单条轴突的直径也会发生变化，包括分支之间以及随时间推移的变化。轴突直径可通过细胞间相互作用进行动态调控，其中包括来自髓鞘形成胶质细胞的信号（尤其是在周围神经系统中）以及健康状态下的神经元活动。此外，多种疾病和损伤都会导致轴突直径发生改变。目前，我们对轴突直径生长、调控以及疾病中轴突直径变化的分子机制的理解仍不明确，相关认知主要集中在轴突细胞骨架与轴突大小之间的关系上。例如，研究发现轴突直径与神经丝密度及磷酸化水平呈正相关，对于较大的有髓轴突这一关联尤为显著。而在较小的无髓轴突中，微管组织则支撑着轴突直径的生长。近期有研究报道，神经元的肌动球蛋白网络（尤其是肌动蛋白加帽蛋白α-血影蛋白-adducin）能够调控轴突肌动蛋白环的直径生长，进而维持轴突的直径和完整性综述见）。这些关于轴突直径生物学的研究发现，大多是通过电子显微镜、超高分辨率成像等高分辨率成像技术对固定组织样本进行分析得出的。然而，这些方法目前尚无法实现规模化实验应用，因此在模型系统中尚未开展针对轴突直径的发现型筛选研究。

近日，我们建立了斑马鱼作为研究轴突直径的模型，并利用转基因报告基因在体内实时观察轴突直径的生长过程。在针对髓鞘化轴突形成所需新基因的遗传筛选中，我们发现核转运受体ipo13对于超大轴突的直径生长至关重要。这一特性促使我们开发了一个旨在特异性识别轴突直径新型调控因子的发现平台。

为了开展轴突直径的筛选工作，我们认为关键在于采用一种成像平台，使其能够在活体状态下分辨单个轴突直径的细微变化。我们还力求将这一流程自动化，以提升筛选的规模化水平。我们此前的研究表明，Mauthner轴突非常适合用于活体轴突直径的研究，原因在于它具有独特的可识别性，并且在一个特征明确的神经环路的发育和功能成熟过程中，其轴突直径会出现稳定且早期的生长。在此，我们介绍一种自动化成像及基于机器学习（ML）的分析流程的开发过程。为评估斑马鱼中毛特纳细胞轴突直径的变化，该轴突在发育的最初几天内直径会增加数微米。基于此，我们开展了一项大规模的基于化学化合物的筛选实验，并验证了那些能使轴突直径增大的候选化合物。本研究凸显了在体内筛选细胞形态细微变化的潜力，这一方法也可用于评估神经元结构中其他尚不清楚的特征。此外，我们将筛选结果作为资源提供给科研界，以推动对轴突直径生物学的研究。

结果

利用斑马鱼幼虫对轴突直径进行自动化高分辨率活体成像

为探究中枢神经系统中轴突直径的分子调控机制，我们选择毛特纳神经元及其轴突作为模型。毛特纳神经元是一对位于后脑的网状脊髓中枢神经系统神经元，对于介导快速逃逸反应至关重要，它们会沿着脊髓全长投射出长而大直径的轴突，以驱动运动输出。

我们此前对毛特纳轴突直径的评估采用了荧光报告基因的高分辨率共聚焦活细胞成像技术，结果显示轴突直径在受精后2至5天（dpf）间从约1微米增长至约5微米。这类直径测量要么通过人工完成，要么采用半自动化分析，均不适合大规模测量。因此，为了建立适用于大规模筛选发现的方法，我们致力于实现毛特纳轴突直径成像与分析的自动化，在高分辨率成像与高通量检测之间取得平衡。

我们此前利用表达荧光报告基因的斑马鱼进行自动活细胞成像，以筛选影响髓鞘形成胶质细胞数量的化合物。为此，我们采用转盘式共聚焦显微镜（SDCM）进行图像采集，并结合脊椎动物自动筛选技术（VAST）平台，实现斑马鱼幼鱼从96孔板到显微镜的自动递送与成像。

VAST平台将斑马鱼输送至薄壁玻璃毛细管（内径600–750微米）中，斑马鱼在其中被固定并自动定向，以便从特定角度观察该动物。随后，系统将控制权移交至SDCM，以拍摄玻璃毛细管内斑马鱼的图像。本研究中，我们使用转基因报告株Tg(hspGFF62A:Gal4); Tg(UAS:GFP) 来成像毛特纳轴突直径的生长情况。由于毛特纳轴突靠近中线轴，我们需要使用长工作距离物镜，透过轴突上方的组织和玻璃毛细管进行成像。我们测试了10倍和20倍物镜，以及两种成像方案：一种拍摄整个动物（覆盖毛特纳轴突的全长，图1A），另一种仅拍摄特定区域（轴突投射的中段，图1B）（详见方法及图1E中参数对比）。结果显示，以20倍放大倍率拍摄单个z-stack所得到的参数最佳，能够兼顾筛选所需的成像分辨率和通量。

接下来，我们希望确保以这种方式获取的图像能够让我们检测到实验诱导的轴突直径变化。我们在毛特纳轴突完成向外生长后进行操作，理由是这也能限制识别那些通过影响发育或神经元成熟早期阶段而改变轴突直径的假阳性候选物。我们首先评估了是否能检测到通过操纵mTor通路诱导的轴突直径变化，已有研究表明该通路会影响轴突直径。为此，我们在3至5天龄（dpf）、轴突直径处于活跃生长阶段时，施加50微摩尔的mTor抑制剂雷帕霉素，结果确实检测到雷帕霉素处理后毛特纳轴突直径下降了约10%（见图1C，对应标识(n=9)）。需要重点说明的是，尽管0.5%的二甲基亚砜（DMSO）不会影响轴突直径的生长，但与饲养在E3胚胎培养基中的幼虫（对照组）相比，1%的二甲基亚砜会显著降低毛特纳轴突直径（见图1D）。为了筛选约1000种化合物在该尺度下改变轴突直径的潜力，我们预计需要从10000只动物身上获取约10000个Z轴堆叠图像（见图，对应标识((n ~ 10))，其中包含对照组和偶尔的成像失败情况）。这一分析规模促使我们开发出一套完全自动化的图像分析流程。动物的走向与毛细血管管路的中线平行。因此，在获取的图像堆栈中，毛特许雷氏轴突的轨迹并非始终局限于可预测数量的z轴切片。基于这些综合原因，无法直接将3D z轴堆栈转换为2D最大强度投影图来进行阈值分割分析。为此，我们采用了机器学习（ML）技术，以对信号强度或位置不那么敏感的方式分割目标目标物体（图2）。

图1.（A）使用VAST-SDCM系统在10倍/0.5数值孔径物镜下的最大强度投影。比例尺(bar =500 mu m) （B）对6个z堆叠图像进行拼接后，Tg(hspGFF62A:Gal4);Tg(UAS:GFP)斑马鱼约体节15-16处的单tile z堆叠最大强度投影。z堆叠从侧视图采集，结果表明我们可利用图B中的20倍/1数值孔径物镜及成像参数测量轴突直径变化。使用mTOR抑制剂雷帕霉素时，我们检测到毛特纳轴突直径显著降低（(n=9)、(***p<0.0001)）。20倍下的亚细胞分辨率较10倍下有所提升。比例尺=25微米。(bars =25 mu m) （C）基于脚本的半自动化定量分析毛特纳轴突直径，使用(10x/0.5NA)（上方）或20倍/1数值孔径物镜（下方）对Tg(hspGFF62A:Gal4);Tg(UAS:GFP)斑马鱼进行成像。可通过自动化筛选系统可视化并评估轴突直径的变化。（D）对在E3胚胎培养基（对照组）、0.5%（左图）或1%二甲基亚砜（右图）中饲养的幼鱼进行毛特纳轴突直径定量分析。使用1%二甲基亚砜时，我们检测到毛特纳轴突直径显著降低（((n>7)、(p=0.0034)）。使用0.5%二甲基亚砜时未检测到差异（(= 12)、(p=0.94)）（E）在VAST-SDCM系统中，使用10倍或20倍物镜、300毫秒曝光对Tg(hspGFF62A:Gal4);Tg(UAS:GFP)报告基因系进行2×2合并水平的成像分辨率和时间。本图的基础数据可在S1数据中找到。

建立可在5天胚胎期（5 dpf）检测轴突直径变化的成像参数后，我们接下来开发了一套全自动的轴突直径测量分析流程。我们用于标记毛特纳轴突的转基因品系Tg(hspGFF62A:Gal4); Tg(UAS:GFP)，同时也会标记后侧线神经的神经元，且偶尔会在其他细胞（如肌肉和皮肤细胞）中出现异位荧光表达，这在由Gal4:UAS驱动表达的转基因斑马鱼中较为常见（图1A和图2A）。异位荧光表达、自发荧光、皮肤色素沉着以及生物批次/鱼群差异所带来的变异，会导致不同图像之间存在广泛的变异性和质量差异。此外，尽管VAST系统能以极高的精准度将斑马鱼固定在侧面位置，但无法保证其身体中线处于动物的走向与毛细血管管路的中线平行。因此，在获取的图像堆栈中，毛特许雷氏轴突的轨迹并非始终局限于可预测数量的z轴切片。基于这些综合原因，无法直接将3D z轴堆栈转换为2D最大强度投影图来进行阈值分割分析。为此，我们采用了机器学习（ML）技术，以对信号强度或位置不那么敏感的方式分割目标目标物体（图2）。

如今，许多开源和商业的图像分析平台都实现了基于机器学习（ML）或人工智能（AI）的训练与分割功能。本研究利用Arivis Vision4D软件开展多尺度随机森林像素分类，构建了一套自动化分析流程，可对活体斑马鱼中毛特纳细胞轴突直径进行批量、一致性的测量。

按照体节15–16节段对脊髓进行单场成像，操作方法如前所述（另见方法学部分）。将多次实验、涵盖多批样本的共聚焦图像堆栈导入Vision4D软件，构建训练数据集。对每张图像的每个切片进行强模糊处理（高斯模糊，半径146微米，使用ImageJ软件替代），以此生成额外的低分辨率去噪通道。利用该通道与原始通道，训练一个低分辨率随机森林像素分类器模型（见方法学部分），该模型可粗略识别毛特纳轴突，并排除大部分伪影或无关信号（图2A、2B中标注的肌肉（空心箭头）、皮肤自发荧光（实心箭头））。随后，仅使用原始通道的原始数据训练高分辨率模型（见方法学部分）。由此，超出预设尺寸、形态和强度范围的目标物被过滤掉（图2B–2D、图3A流程图中的步骤1–9以及补充视频S1）。成像效果及后续分割质量会因斑马鱼的摆放位置以及与物镜的距离不同而存在差异。为解决这一问题，我们根据轴突相对z轴位置(###)，将其分为“上部”和“下部”两组，以便单独分析分辨率更高的上部轴突。要将轴突目标物按靠近物镜（上部）和远离物镜（下部）进行分类，需采用相对或关联目标物筛选方法（例如，选取两个x质心值“相似”目标物中的“最高”者，或对z质心“相似”的目标物进行分组）。为此，我们编写了一个Python脚本，对Z轴维度的目标物进行聚类，并将聚类后的目标物分为“上部”和“下部”轴突（成像时斑马鱼侧躺朝上）（图2E、2F）。该步骤部分在图像数据处理软件之外执行，因此在流程图中以额外流程呈现（图3A中的虚线箭头）。

为获取每个轴突的平均宽度测量值，我们导出了顶部毛特纳轴突的每切片二值掩码，在Z轴上进行投影，然后在另一款软件（Definiens DeveloperXD）中进行测量。该过程的示例见图2G和2H。流程图（图3A）展示了构建我们全自动图像分析流程所采用的步骤，列出了本研究中使用的工具（粗体文本），并给出了可用于实现类似目标的替代工具或开源工具（斜体文本）。各步骤的脚本和流程合集已存放在爱丁堡数据共享平台（https://doi.org/10.7488/ds/8111）。

为测试自动化图像分析流程的性能，我们使用了一种已有的转基因品系（本文中称为nefmatg/+），该品系的毛特纳轴突直径更小；我们采用标准化的VAST-SDCM设置对其进行成像。随后，我们将自动化分析流程（ML）获得的轴突直径测量结果，与两名不同实验者（手动1和手动2）完成的全人工评估结果进行了对比（参见方法部分、图3B和3E）。对对照组图像的逐样本直接对比显示，ML方法与人工评估者之间、以及两名人工评估者之间的毛特纳轴突直径测量结果均存在差异（图3D）。此外，我们发现人工评估结果的变异性更高，这进一步凸显了无偏自动化测量方法的重要性。值得注意的是，无论采用ML还是人工评估，我们均检测到该报告品系的毛特纳轴突直径相较于对照组出现了约20%的显著下降（图3E）。综合来看，我们认为本研究的成像与分析流程具有足够的灵敏度，能够检测出毛特纳轴突直径的变化。

图2. 构建自动化图像分析流程以测量轴突直径变化：分步目标检测与处理。在Arivis Vision4D中渲染的z轴堆叠图像的正面和顶部三维视图展示了：(A) 高对比度的灰度查找表，用于突出显示有问题的皮肤反射/自发荧光（实心箭头）以及绿色荧光蛋白的异位肌肉表达（空心箭头）。(B) 经训练以排除皮肤和肌肉组织的低分辨率机器学习模型，筛选出候选轴突目标（绿色）。(C) 目标过滤以排除小目标（绿色），保留目标毛特纳轴突（橙色）。(D) 经训练以精准分割清晰区域并可靠测量候选轴突的高分辨率机器学习模型（黄色）。(E) 目标尺寸过滤后，通过Python聚类脚本确定最可能是距离物镜最近的毛特纳轴突的目标（绿色），其余目标（黄色）则被剔除。检测到的轴突。(F) 用于测量的最终分段毛特纳轴突（绿色）。(G) 导出毛特纳轴突对象切片并进行Z轴投影，以生成二维平面掩码。(H) 对二维平面掩码进行多边形化处理，并利用多边形骨架沿其长度进行多次骨架宽度测量

图3 人工评估证实了基于机器学习的毛特纳轴突直径定量分析的可靠性。(A) 流程图展示了构建我们全自动图像分析流程的分步过程；本研究中使用的工具以粗体显示，替代方案建议和开源工具以斜体标注。所有脚本和流程均可通过爱丁堡数据共享平台获取（参见方法部分）。(B) 毛特纳轴突选定区域的代表性热查找表（LUT）阈值图像，叠加了随机测量网格（黄色，间距为 (500 mu m^{2})）。如方法部分所述，每个样本至少对五个网格块进行人工追踪，以计算轴突平均直径。(C) 由我们的机器学习流程（ML）生成的(B)中完整毛特纳轴突掩码的代表性图像。粉色框标注了(B)中所示区域。(D) 通过我们的自动化图像分析流程（ML）以及两名独立评估者（人工1和人工2）对对照组毛特纳轴突进行的逐样本直接比较。每个样本均以颜色匹配，表明三种测量方法下的毛特纳轴突直径值均存在差异。(((n=5))) (E) Nefmatg/+ 小鼠毛特纳轴突直径的变化经标准化至各自评估匹配的对照组，并以百分比计算。与对照组相比，ML流程和人工评估均检测到 Nefmatg/+ 小鼠毛特纳轴突直径出现了相当且具有统计学显著性的下降。采用单因素方差分析结合多重比较检验评估统计学显著性。误差棒代表均值及标准差。P值标注为 (p<0.05)、答 (p<0.01)、全全 (p<0.001)、(Scale bar =20 mu m)。本图的基础数据可在 S1 数据中获取。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003895.g003

化学筛选揭示了能改变毛特纳轴突直径的化合物

建立好成像和分析流程后，我们接下来希望开展筛选，以鉴定出能改变轴突直径的因素。我们选用了(LOPAC ^{1280})文库，原因是该文库的化合物特征已得到充分阐释，其标注的靶点涵盖多种不同通路。此外，文库中与神经传递和离子通道功能相关的化合物占比尤其高。此前有研究表明，离体状态下神经元活动可使轴突直径发生变化，因此我们推断该文库可能更易筛选出在体内影响轴突直径生长的化合物。

在斑马鱼筛选实验中，LOPAC 文库中的化合物通常以约 10 微摩尔的浓度使用，以避免对斑马鱼健康造成严重影响。由于我们的目标是在稍晚的阶段（受精后3-5天）处理斑马鱼幼体，我们首先以2、10、50和100微摩尔的浓度对30种随机选取的药物进行了测试，并评估了斑马鱼的存活情况与健康状态。在10微摩尔浓度下，我们观察到幼体的健康状况和存活率几乎未受影响（死亡率约1%），因此将10微摩尔选定为每种化合物的主要测试浓度。对于在10微摩尔浓度下确实导致幼体死亡的化合物，我们在初步筛选中以2微摩尔的浓度重新进行了测试。为了提高筛选通量并在每块96孔板中测试更多化合物，我们每孔放置3条斑马鱼，这样每块板可测试30种药物（每种药物设置3个孔，每个化合物共9条鱼），同时设置6个孔作为对照组：每块96孔板中每孔3条鱼的成像工作约需5小时完成。考虑到不同批次斑马鱼卵的轴突直径存在差异，以及成像过程中轴突直径可能发生的变化，我们在96孔板中分散设置了3个孔，每孔3条鱼，用0.5%的二甲基亚砜（DMSO）处理，作为批次特异性对照组。在本次筛选中，我们从受精后3天至5天对斑马鱼进行化合物处理，于受精后5天对其进行成像，并通过自动化分析流程进行评估（图4A）。为了评估测试化合物对轴突直径的影响，我们将化合物对轴突直径的作用相对于对照组进行标准化处理，并计算Z值，以对化合物与对照组的差异程度进行排序。具体做法是将每种药物处理样本的轴突直径测量值与对应的二甲基亚砜处理批次及板特异性对照组的测量值进行比较（计算方法详见实验方法）。这种标准化方法是高通量药物筛选中的常规操作，能够消除不同孔、不同板以及不同批次之间的差异性，同时可对筛选出的阳性化合物的作用效果进行排序。由于我们采用亚细胞分辨率进行成像，目标是检测如毛特纳轴突这样大的轴突上小至10%的直径变化，因此我们设定阈值(z-score >+1.2)或小于-1.2，来界定初步筛选中的阳性化合物。为了最大限度减少技术、成像或分析相关的误差，我们对每一个候选阳性化合物及其对应的对照组的Z轴堆叠图像和分割掩码进行了人工检查。在部分情况下，成像误差（如斑马鱼在Z轴上的漂移）会导致毛特纳轴突的检测错误。因此，我们从分析中剔除了所有轴突识别不准确以及基于掩码测量无效的数据点（各步骤的详细说明见实验方法）。

我们总共测试了880种药物对轴突直径的影响能力。我们发现，28/880种药物（3.18%）在10微摩尔和2微摩尔稀释浓度下均具有致死性，且154/880次处理（17.5%）因技术难题（图像质量差、毛特纳细胞误检、(n number <4)）而不得不被排除。在剩余的化合物中，653种（74.2%）未达到Z值阈值，而45/880种化合物（约5%）被归类为命中化合物（图4B和4C）。

图4 表型筛选可鉴定出改变毛特纳轴突直径的化合物。(A) 示意图展示筛选流程的工作流程。(B) 在初筛中，对880种药物化合物分别以2微摩尔或10微摩尔的浓度进行测试，以探究其改变毛特纳轴突直径的潜力，且约5%的化合物最初被鉴定为有效化合物。另有3%的化合物在两种稀释度下均导致斑马鱼死亡，17.5%的化合物因技术问题被排除。(C) 通过将每种药物与其对应的二甲基亚砜（DMSO）处理的同批次对照组进行比较，计算Z值。Z值大于1.2或小于-1.2的(>1.2)或(<-1.2)被认为是直径发生变化的标准。28种化合物使毛特纳轴突直径减小，17种化合物使其增大。(D)明场图像显示了外观健康的对照组（上图）、体型较小的幼虫（中图）和外观不健康的幼虫（下图）。比例尺=1毫米。(E) 随后从明场图像中评估每种有效化合物及其对应的DMSO处理同批次对照组的体型指标（长度和面积）。身体面积变化超过3%且长度变化超过2.5%的化合物被列为排除标准（粉色标注）。有毒化合物以红色标注。(F) 初筛结果展示了按Z值（X轴）排序的有效化合物，并通过学生t检验（Y轴）对每种有效化合物与其DMSO处理的同批次对照组进行统计学评估。33种候选有效化合物按作用类别进行颜色编码（青绿色代表离子通道，黄色代表神经递质，绿色代表诱导型一氧化氮合酶/内皮型一氧化氮合酶相关物质，灰色代表其他类别）。总计18种药物化合物使毛特纳轴突直径减小至Z值阈值-1.2以下，15种药物化合物使其增大至Z值阈值1.2以上。化合物的说明参见补充表S1。本图的基础数据可在补充数据S1中获取。图A的示意图由BioRender制作。莱昂斯，D.（2026）https://BioRender.com/puyi62e。

为了检测每个候选阳性化合物可能对鱼类健康产生的影响，我们人工评估了VAST获取的所有配套明场RGB图像，检查是否存在变色（患病迹象）或畸形情况。我们排除了2种化合物，因为对应的鱼类出现变色或脊柱轻微畸形（图4D）。接下来，我们需要确保剩余的43种阳性化合物不会通过影响鱼类整体体型，进而间接改变轴突直径。为了排除主要影响身体尺寸的候选阳性化合物，我们测量了所有经阳性化合物处理的鱼类及其各自对照组的身体面积和长度。仅凭肉眼判断鱼类体型的相对细微变化（例如10%左右的变化，图5A）难度极大，因此我们采用了进一步的自动化方法。此次，我们训练了一个随机森林像素分类器来识别完整的鱼幼虫（图5B）。我们按照方法部分所述，利用DeveloperXD内置的测量工具测量了身体面积和长度（目标区域、长度（边界框））。为了确定排除标准，我们首先评估了全身面积和鱼体长的变异程度。我们将不同批次和成像轮次中经DMSO处理的对照组的面积和长度值进行汇总，计算出其平均值和标准差。所有对照组体长平均值（3.93毫米）的一个标准差为2.25%，面积平均值（1.41平方毫米，对应标识1.41 mm ((1.41 ~mm^{2}))）的一个标准差为2.92%。因此，我们将阳性化合物表现出的超过一个标准差的变化视为可能影响鱼类体型的情况，并将体长2.5%、面积3%的变化设定为身体尺寸改变的排除阈值（参见方法部分；图4E中的虚线）。这一标准导致我们排除了10种阳性化合物（图4E）。对这些排除标准的验证结果显示，被排除的10种阳性化合物中，身体面积和体长的变化与轴突直径显著相关（面积对应标识(R^{2}=0.72)，长度对应标识(R^{2}=0.69)）（图5C）。相比之下，剩余的33种候选阳性化合物中，轴突直径与身体面积或体长均无相关性（面积对应标识(R^{2}=0.02)，长度对应标识(R^{2}=0.01)）（图5D），这表明这些化合物对轴突直径的改变作用独立于身体尺寸。

在剩余的33种命中化合物中，有18种使毛特纳轴突直径减小，15种使其增大（图4F及补充表1）。值得注意的是，全部33种命中化合物中有19种与神经传递和离子通道功能相关。这一富集结果与LOPAC文库的组成相符，该文库中约60%的化合物均为与神经传递和离子通道相关的化合物。相比之下，其余化合物则靶向一氧化氮物质、脂质信号传导、磷酸化、细胞骨架和细胞外基质。为了补充z值排名的结果，我们开展了学生t检验，将每种命中化合物仅与经DMSO处理的对照组进行比较，以此实现标准化效应量评估，并为筛选验证优先级化合物提供指导。该分析发现33种化合物中有18种能显著改变轴突直径。补充表1列出了所有命中化合物，包括其排名指标和作用类别。

总之，我们开展了首个旨在筛选调节轴突直径化合物的体内发现筛选实验。在880种测试化合物中，经过严格的数据筛选，我们共鉴定出33种影响毛特纳轴突直径生长的化合物。我们将全部命中化合物列表提供给神经科学界，作为资源以助力后续研究。

图5. 身体尺寸排除标准的评估。(A) 在VAST-SDCM上获取的两张所示DMSO处理对照组的明场图像面积相差10%，我们无法通过肉眼手动评估。(Scale bars =1 ~mm) (B) 通过在DeveloperXD中训练机器学习分类器，在VAST-SDCM的明场图像上计算身体尺寸（长度和面积）。排除标准（面积变化3%和长度变化2.5%）是基于不同DMSO处理对照组的平均变异估算得出的（详细方法见方法部分）。(C) 基于体型被排除的活性化合物以粉色显示。对于这些化合物，面积和长度均与轴突直径相关（(R^{2}=0.72) 面积，(R^{2}=0.69) 长度）。(D) 身体尺寸无变化的活性化合物以黑色显示（右侧），其面积或长度与轴突直径之间无相关性（(R^{2}=0.02) 面积，(R^{2}=0.01) 长度）。本图的基础数据可参见S1数据。

命中化合物的验证表明，β2-肾上腺素受体激动剂和多巴胺拮抗剂能增大毛特纳轴突的直径生长

接下来，我们希望验证初筛中的命中化合物。我们首先评估了化合物的作用类别，并优先筛选那些可能通过调节神经元活性来影响轴突直径生长的命中化合物。此外，我们还根据以下标准对化合物进行优先级排序：（1）其z值和效应量排名；（2）同类作用化合物在命中结果中重复出现的情况；（3）同一类别中同时存在对直径产生相反作用的拮抗剂和激动剂；（4）它们增大已较大的毛特纳轴突直径的能力。基于这些筛选步骤，我们首先聚焦于与肾上腺素受体相关的化合物（2种拮抗剂可减小直径，1种激动剂可增大直径）以及多巴胺信号通路相关的化合物（2种拮抗剂可增大轴突直径）。

我们从不同供应商订购了相同的化合物或靶向同一通路的化合物。为评估新化合物对毛特纳轴突直径的剂量依赖性效应，我们进行了1至100微摩尔的系列稀释，并通过肉眼手动评估化合物毒性，以确定哪些浓度会诱导幼体出现发育畸形或致死现象。我们将这些浓度排除在进一步分析之外。如有可用，我们以初始筛选所用浓度（10或2微摩尔）重新测试了原LOPAC文库化合物。尽管VAST-SDCM系统和我们的成像流程支持我们开展大规模初筛，但验证实验无需高通量成像。为实现更高分辨率的成像，我们采用了此前建立的共聚焦超高分辨率成像技术来测量轴突直径（图1D、6F及6F′）。我们对药物处理组和二甲基亚砜（DMSO）处理组对照组幼体的毛特纳轴突进行成像，并使用半自动脚本测量轴突直径，因为我们基于机器学习的图像分析方法是为VAST-SDCM平台采集的图像量身定制的。为消除批次特异性差异，我们通过计算与DMSO处理对照组的相对变化来对轴突直径进行标准化。

我们的验证实验显示，β2-肾上腺素受体激动剂福莫特罗在4微摩尔浓度下会使毛特纳细胞轴突直径增大（增幅约8%），而原始化合物(LOPAC ^{1280})在10微摩尔浓度下也使轴突直径显著增大（增幅约11%）（图6A）。为评估另一种β2-肾上腺素受体激动剂，我们使用了氢溴酸非诺特罗，发现其在2和10微摩尔浓度下均能使轴突直径显著增大（增幅约8%至9%，图6B）。使用α-肾上腺素受体拮抗剂盐酸芬司匹利时，我们未检测到毛特纳细胞轴突直径发生变化，而该化合物在初步筛选中曾使轴突直径减小（图6C）。我们未能在市场上购得第三种肾上腺素受体相关化合物A315456。接下来，我们评估了两种靶向多巴胺信号通路的命中化合物：多巴胺拮抗剂多潘立酮和依替普利。在验证实验中，这两种化合物均使轴突直径显著增大，增幅在6%至10%之间（图6D–6F图6E图6F′）。

接下来，我们想探究这些命中化合物是否会影响其他轴突的直径，尤其是那些直径小于毛特纳神经元的轴突。本研究全程使用的转基因品系 Tg(hspGFF62A:Gal4) 同时也标记了外周神经系统后侧线（PLLn）神经的神经元。为了检测我们能否观察到后侧线轴突直径的变化，我们使用了 Nefmatg/+ 品系，结果发现其轴突直径相较于对照组显著下降约 22%（对照组为 1.226 微米，Nefmatg/+ 品系为 1.027 微米，编号 (n>15)）。当使用福莫特罗或多潘立酮时，我们未检测到后侧线轴突直径存在统计学上的显著差异（图 6I 和 6J）。尽管如此，福莫特罗组的平均值显示，二甲基亚砜处理的对照组为 0.921 微米，福莫特罗处理的幼虫为 0.997 微米。这一约 70 纳米的平均差异对应着 8% 的增幅，与毛特纳轴突的增幅（8.9%；图 6A）非常接近，表明β2 肾上腺素受体激动剂福莫特罗存在使轴突直径增大的趋势。有关检测轴突直径细微变化时效力计算的相关考量，请参见数据来源文件。

命中化合物对不同神经元区室表现出复杂影响

斑马鱼的活体成像技术可在体内评估整个神经元的形态。因此，我们测试了我们的首批命中化合物如何影响毛特纳细胞的胞体大小和树突形态、轴突始段（AIS）的长度与直径，以及轴突始段之后轴突最近端区域的直径。为此，我们使用了一种转基因用标记神经元和轴突膜的品系（Tg(hspGFF62A:Gal4)；Tg(UAS:mem-Scarlet)，图7A），在体节16处对Mauthner轴突直径影响最显著的浓度下，为每类化合物添加一种药物。

对于福莫特罗（4 µM），我们发现毛特纳细胞体体积显著增加（图7B），但树突面积和长度无变化（图7D），轴突始段直径和长度无变化（图7F），且轴突始段后最近端区域的直径呈上升趋势（图7H），这与我们在筛选和初步验证中观察到的轴突远端部分轴突直径显著增加的结果一致。相比之下，多潘立酮（20 µM）处理对神经元和轴突形态的改变更为复杂，表现为毛特纳细胞体大小轻微但显著减小（图7C），树突面积和长度（图7E）或轴突始段直径和长度（图7G）均无变化，但轴突始段后近端轴突区域的直径增加了22%（图7I）。

综合来看，我们验证了两类候选化合物——β2肾上腺素受体激动剂和多巴胺拮抗剂，均会影响毛特纳神经元轴突直径的生长。我们的筛选成功识别出轴突直径的相对细微变化，这一事实证明了利用斑马鱼进行体内筛选，以识别细胞形态亚细胞特征调控因子的可行性。

图6. β2-肾上腺素受体激动剂和多巴胺拮抗剂促进毛特钠轴突直径的生长。对来自不同供应商的选定命中化合物，在不同浓度（1–50微摩尔）下进行验证，并与用0.5%–1%二甲基亚砜处理的对照鱼进行比较。致死或影响健康的稀释液被排除在外。每种药物对毛特钠轴突直径的影响均以同批次二甲基亚砜处理组为基准进行标准化以百分比进行对照和计算。若有可用的原始药物 (LOPAC1280)，按其原始稀释度（LP）进行测试。(A) β2 肾上腺素受体激动剂福莫特罗在 4 微摩尔浓度下，以及在 10 微摩尔浓度下测试原始 LP 稀释度时，均使毛特纳轴突直径显著增加。(B) 第二种β2 肾上腺素受体激动剂非诺特罗氢溴酸盐在 1 和 4 微摩尔浓度下使毛特纳轴突直径增加。(C) α 肾上腺素受体拮抗剂盐酸芬司匹利未出现最初检测到的毛特纳轴突直径减小现象，未检测到显著变化。(D、E) 多巴胺拮抗剂多潘立酮和依替普啶均使毛特纳轴突直径显著增加。(F–F′) 采用蔡司 LSM880 共聚焦显微镜搭配 AiryScan FAST 模式，以 40 倍物镜、1.8 倍变焦对斑马鱼成像，用于验证实验。(F′) 处的典型共聚焦图像及放大图显示，斑马鱼经多巴胺拮抗剂多潘立酮和依替普啶处理后，毛特纳轴突直径增大。(G) 对比对照组与 Nefmatg/+ 斑马鱼的后侧线神经（PLLn）轴突典型图像。(H) 与对照组相比，Nefmatg/+ 转基因品系的后侧线神经轴突直径显著减小。(I、J) 福莫特罗（I）和多潘立酮（J）均未使后侧线神经轴突直径出现统计学上的显著变化，但福莫特罗显示出直径增大的趋势。如适用，不同批次斑马鱼分别以空心圆和实心圆表示。所有图表中单个数据点代表样本数量（N）。采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Dunnett 多重比较检验（A–E）或 Student t 检验（H–J）评估统计学显著性。每个图面板均标注了校正后的多重 p 值，分别表示为 (* p<0.05)、(** p<0.01) 和 (*** p<0.001)。误差棒代表均值及标准差（SD）。比例尺为 (bars =10 mu m)。本图相关基础数据可参见 S1 数据。

讨论

斑马鱼是体内发现筛选的强大模型，随着生物传感器、报告基因、成像技术和图像分析技术的不断创新，如今研究人员已能探究此前难以攻克的生物学过程。本研究将斑马鱼可规模化的高分辨率高内涵成像技术应用于轴突直径的生物学研究，轴突直径是神经元形态以及神经环路结构与功能中一个长期被忽视但却至关重要的特征。

技术考量

筛选亚细胞形态学参数（如轴突直径）变化的主要限制因素，是平衡检测有效表型所需的分辨率与拍摄相关图像所需的时间。为筛选轴突直径可能存在的亚微米级变化，我们以毛特纳神经元为模型，因为其轴突在受精后5天（5dpf）直径可长至约5微米，这意味着我们的共聚焦自动筛选系统（VAST-SDCM）能够分辨其直径变化。我们通过一套可靠的自动化分析流程，对880种化合物改变轴突直径的潜力进行了检测。

未来，将发现性筛选的范围进一步扩大至关重要，以便更好地理解轴突直径的改变与神经元形态其他特征之间的关联。例如，在我们的验证研究中，我们评估了命中化合物对多种其他因素的影响——相对于轴突直径，这些因素包括细胞体大小和树突形态——这也凸显了同时筛选神经元形态多种特征的潜力。事实上，神经元形态的评估可通过对神经元和轴突分子成分的平行分析来补充，例如借助日益丰富的转基因报告工具库。此外，正如我们此前所指出的，斑马鱼能够评估直径显著更小的轴突发生的变化，这一点将对未来的探索性研究具有重要意义。我们所报道的 VAST-SDCM 系统实现方案的分辨率相对有限，为 0.286 微米/X–Y 像素，最适合检测大型毛特纳轴突的变化。要能够对神经元形态的其他精细特征进行稳健且可扩展的分析，或在活体中评估轴突直径更小的不同神经元，就需要在显微镜技术方面进一步创新，以提升图像采集的灵敏度和分辨率。例如，我们用于验证命中化合物的成像采用了超分辨率共聚焦活细胞成像技术，其 X–Y 像素尺寸为 0.054 微米；若能以更高速度实现这一成像效果，将有助于开展更高通量的分析。

除了需要高分辨率快速成像外，规模化的筛选还需要高效的数据采集和分析流程。如前所述，在我们报道的筛选实验中，我们从VAST-SDCM中为每只动物采集单张3D z-stack图像，每块板筛选30种化合物（每种化合物最多9个样本，另设对照组）需要约5小时，这意味着筛选约1000种化合物需要约33次这样的成像操作。原则上，可将其他高速图像采集方案应用于发现性筛选，例如光片显微镜。但需要注意的是，这需要具备高效处理大量复杂数据能力的图像处理和分析流程。例如，执行与我们筛选相关的自动化图像分析流程非常耗时。我们最初在独立的个人电脑工作站上进行分析，每个图像栈需要约15分钟，因此处理和分析筛选过程中获取的约10000张共聚焦z-stack图像需要约2500小时。我们最近使用新购置的专用服务器运行Arivis软件对图像分析流程进行了测试，将每个成像栈的处理时间缩短至约5分钟。因此，后续筛选约1000种化合物的图像处理工作将耗时约800小时。尽管此类自动化图像分析仍然耗时，但随着基于机器学习的技术不断发展并更易获取，图像分析流程的效率有望进一步提升。

筛选实验执行中的一个关键考量是假阳性和假阴性命中物的发现。我们的筛选鉴定出33种改变毛特纳轴突直径的候选化合物。验证研究证实了部分候选化合物的作用（详见下文），但也发现了假阳性命中物，这在发现类筛选中是常见情况。在本次筛选中，还有几点值得注意：

1. 确定轴突直径的变化对我们通过筛选可能观察到的效应量构成了限制。与旨在识别目标细胞类型或结构有无的筛选不同，我们的筛选旨在识别单一维度参数的相对微小变化。在此，我们旨在重点发现对轴突直径生长具有特异性作用的因素，因此仅在3至5日龄龄期用化合物处理动物，以评估轴突长度完全生长后的时期其产生的影响。尽管在这2天的时间内毛特纳轴突会生长，但在我们筛选所检测的区域内，其直径仅增加约1.5微米[20]。这一情况限制了复合处理在此期间可能产生的绝对影响。此外，我们在筛选中排除了那些会影响动物整体生长/体型的药物，这类药物可能会更显著地影响轴突直径，例如通过影响动物的整体生长状况或健康水平。此外，目前尚不清楚在这些发育阶段中，毛特纳轴突的直径能以多快的速度增长，这意味着我们所记录的相对较小的效应值，可能反映了轴突在此期间直径增长速度存在上限。

2. 尽管毛特纳轴突的形态具有高度定型性，但其直径在不同个体之间（即使是同一批孵化的个体之间）仍存在约±10%的变异性。鉴于我们的筛选能够检测到的效应量相对较小，这种变异性增加了以高置信度检测表型所需的样本量（n值）。我们此前计算得出，每个条件下需要9条实验动物（对应“c4ffe135-d59e-4bf1-ab25-a13fda8c146714”），才能保证筛选实验具有足够的效力来检测细微变化。尽管VAST-SDCM系统在递送和成像实验动物方面总体效率较高，但筛选过程中处理的许多样本被舍弃，导致部分化合物的样本量未达预期，这很可能是造成假阳性和假阴性结果的原因之一。例如，我们遇到了17.5%的技术性样本剔除情况。这些剔除源于成像过程中，实验样本在VAST-SDCM系统的成像毛细管中发生漂移，导致图像质量下降，而在筛选精细形态特征的变化时，这种情况是无法接受的。此外，我们的图像分析流程对毛特纳轴突的模糊特征较为敏感，会将这类特征排除在分析范围之外。同时，由于转基因报告基因的特性，部分批次的斑马鱼会表现出其他细胞发出更高的异位荧光，若这一情况影响了毛特纳神经元的检测或掩膜生成，也会导致样本被剔除。未来针对亚细胞形态变化的筛选实验，应增加实验动物的数量，以确保所需的样本量能顺利完成整个分析流程。通过对内源性基因座进行报告基因的靶向敲入等手段，可最大限度减少基于转基因报告基因带来的变异性。

3. 由于化合物浓度偏离预期值、蒸发等板效应以及边缘效应，化学筛选可能存在变异性。在筛选场景下测定斑马鱼幼虫组织内的化合物浓度具有较大挑战性，且需注意化合物在体内的剂量-反应活动可能表现出复杂的非线性效应。

在体内进行初步筛选存在这些一般性注意事项，这意味着正如我们所概述的那样，严格的验证步骤是必不可少的。尽管如此，我们的筛选和验证流程已经确认了那些确实会影响轴突直径的候选化合物，即那些影响多巴胺信号传导和肾上腺素受体的化合物。

生物学考量

多潘立酮和依托必利均为D2多巴胺受体拮抗剂，且被发现可增大毛特纳轴突的直径。已有研究表明，多潘立酮会影响斑马鱼的运动行为，且D2受体拮抗作用在脊椎动物中均与神经元兴奋性升高相关。值得注意的是，多巴胺能神经元已被证实可调控声音诱发的毛特纳细胞介导的C型惊跳反射。这表明全身性多巴胺调控可能会影响逃逸回路的活性，包括毛特纳神经元的活性，而这又可能反过来影响轴突直径。  支持神经元活性可能影响轴突直径这一前提的证据来自海马神经元的离体实验，该实验显示轴突在高频刺激下可局部增宽。然而，我们对多潘立酮作用的进一步分析揭示了该化合物对神经元形态的复杂影响——轴突直径增大的同时，毛特纳细胞体的体积却减小了。因此，要厘清神经元活性与轴突直径、细胞生长之间的调控机制，尤其是在多巴胺信号调控的背景下，还需要进一步深入研究。  本研究强调了采用整体研究方法探究各类因素对神经元整体形态影响的重要性。福莫特罗和氢溴酸非诺特罗均为β2肾上腺素受体激动剂，可增大毛特纳轴突直径。β2肾上腺素受体是G蛋白偶联受体，介导多种生理过程，能被去甲肾上腺素和肾上腺素等内源性儿茶酚胺在神经系统中激活，并影响行为。此外，它们在神经系统内外均发挥作用，在平滑肌松弛及后续血管舒张过程中扮演重要角色。与D2作用化合物对毛特纳细胞体和轴突大小产生的差异性影响不同，β2肾上腺素受体使神经元整体尺寸普遍增大，既包括毛特纳细胞体及其轴突，在外周神经系统的侧线神经神经元中也呈现增大趋势，这表明其可能影响神经元的一般生长通路。除了厘清当前已验证的活性化合物如何影响轴突直径外，还需开展未来研究来测试并确认我们筛选实验中其他活性化合物的活性。这将有助于我们更全面地理解可能影响轴突直径的多种机制，包括筛选实验所提示的机制，如脂质信号传导、通路特异性磷酸化以及细胞外基质/细胞骨架调控。

本研究是首次专门探索轴突直径生长分子基础的工作。后续研究需明确命中化合物对中枢神经系统和周围神经系统中不同特定神经元的影响，这些神经元的轴突大小各异，且处于系统和神经环路成熟的不同阶段。此外，要探究化合物诱导效应背后的分子机制，还需对候选通路进行互补性的基因扰动。在此过程中，一个重要的考量是选择用于评估命中化合物候选靶点作用的基因操作方法。这可能需要在体内对命中化合物的候选靶点进行条件性（空间和时间上）激活或抑制，而以斑马鱼作为模型系统，这一操作的可行性正不断提高。同时，将斑马鱼中的研究发现拓展到哺乳动物（包括人类模型）的体外和体内研究也至关重要。综上，本筛选为科研界提供了基础与资源，有助于进一步加深对轴突直径生物学特性的理解。

方法

伦理声明

成年斑马鱼按照标准程序在爱丁堡大学女王医学研究所的斑马鱼设施中饲养和维护。所有实验均严格遵守英国内政部的规定，依据其项目许可证 PP5258250 和 PP3290955 下的相关条例开展。

斑马鱼饲养与转基因品系

成年斑马鱼置于14/10小时的光暗周期环境中。胚胎通过成对交配产生，在受精后2小时内（hpf）收集，每培养皿放置50枚胚胎，于28.5℃条件下，在10毫摩尔羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲的E3胚胎培养基或含亚甲基蓝的处理过的水族箱水中饲养。所有实验均使用受精后5天内（5 dpf）的斑马鱼幼鱼，其背景为野生型（AB/WIK/TL）或nacre−/−[71]品系。在该发育阶段，斑马鱼尚未发生性别分化。本研究使用的转基因品系包括：Tg(hspGFF62A:Gal4)、Tg(UAS:GFP)[、Tg(UAS:mem-Scarlet)、Tg(UAS:memGFP)、Tg(nefma-mcherry。在对Tg(nefma-mcherry)转基因报告基因（本研究中称为Nefmatg/+）进行特征分析时，我们发现杂合子形式的毛特纳轴突直径减小，因此将其作为轴突直径较小的模型。对照组为同批次的同胞个体。

硬件设置（VAST-SDCM 平台）

初级LOPAC筛选中的所有动物均使用Early及其同事[48]中描述的VAST-SDCM平台进行成像。简要来说，将三条斑马鱼装入96孔板的每个孔中，然后通过结合低通滤光片（LP）的方式，将其送至安装在Zeiss检测框架上的配备双AxioCam（Zeiss）506相机的CSU-X1转盘式共聚焦显微镜（Yokogawa）单元。采样器和VAST机器人流体系统（Union Biometrica公司）。我们使用了W Plan-Apochromat 10×/0.5NA M27 75毫米浸液物镜（蔡司公司），并为整条斑马鱼的全景图像生成了6张拼接的z轴堆叠图像（图1A）。除此之外，在进行轴突直径测量时，系统配置为使用W Plan-Apochromat 20×/1.0NA Corr DIC M27 75毫米物镜（蔡司公司），在幼鱼头尖端远端1900微米处采集单张z轴堆叠图像。该单张333×249×300微米（X/Y/Z）的堆叠图像采用2×2合并模式（像素尺寸286纳米），曝光时间为300毫秒，在保证图像处理的信噪比的同时实现了最优采集速度。

化学筛选：幼体制备与化合物处理

将 Tg(hspGFF62A:Gal4);Tg(UAS:GFP) 转基因品系与 nacre 鱼进行回交，用于初步筛选。胚胎在受精后2小时内收集，每皿培养50枚胚胎。为降低整体变异性，对每一批胚胎均单独进行分析。胚胎在受精后24-30小时用灰色链霉菌蛋白酶（0.5毫克/毫升，处理6分钟，Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州圣路易斯市）进行酶法脱膜，并用E3培养基洗涤。之后，每孔手动排布3枚胚胎至96孔板，每孔加入225微升E3培养基。在受精后2天和3天，检查幼体的存活情况；移除不健康个体，并用同批次健康幼体等体积替换。首先，将10毫摩尔/升的化合物二甲基亚砜储备液（(LOPAC ^{1280})，第1-11板；Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州圣路易斯市）用多通道移液器连续稀释至2毫摩尔/升，同时设置100%二甲基亚砜对照组，于-80℃冷冻保存。药物处理当天，取5微升或1微升储备液加入245微升E3培养基，制备4倍浓度的处理液（最终浓度分别为40微摩尔/升和8微摩尔/升，二甲基亚砜浓度为2%-0.4%）。在受精后70-75小时，向幼体孔中直接加入75微升该4倍储备液，使最终浓度为10微摩尔/升或2微摩尔/升，二甲基亚砜浓度为0.5%-0.1%。每种化合物在3个孔中进行测试，每孔3条幼体（((n=9))），并与同板内同批次0.5%二甲基亚砜处理的阴性对照组（((n=9-12))=9-12）进行比较。处理板在标准温度条件下孵育2天，期间不更换含化合物的培养基。受精后5天，用600微摩尔/升三卡因麻醉幼体后进行成像。一块含30种化合物及相应对照的96孔板在4.5-5.5小时内完成成像。对照孔分散排布于板上并/或在全天分时段成像，以分散成像过程中幼体发育带来的对照变异性，同时对活体动物进行连续成像。

自动化图像分析流程

研究从9次独立成像运行中获取的CZI格式完整XYZ堆叠图像，在Arivis Vision4D v3软件中构建了涵盖研究中所有样本和图像变化范围的机器学习训练集。利用“机器学习训练器”功能构建了两个随机森林像素分类器：LowResML和HighResML。两个分类器均设置为使用100%缩放比例，且适配所有像素尺寸下的所有特征。LowResML使用高斯模糊处理和原始未处理的两种数据通道进行训练，分类类别为轴突、模糊和背景；HighResML仅使用原始未处理的数据通道训练，分类类别为高分辨率轴突、高分辨率模糊、高分辨率肌肉和背景。  本数据集的37张图像上对训练样本进行了标注，具体数量如下：LowResML——轴突类（71个样本，正类）、模糊类（271个样本，负类）、背景类（139个样本，负类）；HighResML——高分辨率轴突类（88个样本，正类）、高分辨率模糊类（461个样本，负类）、高分辨率肌肉类（72个样本，负类）、背景类（166个样本，负类）。  两个模型需按顺序执行，以在全分辨率下成功检测目标毛特纳轴突。首先通过LowResML识别目标毛特纳区域，排除大部分皮肤自发荧光和异位肌肉绿色荧光蛋白（GFP）表达（图2A、2B）。对低分辨率分割对象进行尺寸和形状筛选后（图2C），再应用HighResML进行分割（图2D）。仅保留分类为正确高分辨率轴突类、且包含在低分辨率轴突类内的高分辨率分割对象（图2E）。随后通过与Vision4D关联的Python脚本，将高分辨率轴突片段分为上、下和单独的毛特纳轴突三类（图2F）。导出单平面二值掩码，在FIJI中进行Z轴投影，再导入Definiens DeveloperXD软件，测量多边形骨骼宽度。

斑马鱼整体尺寸分析

VAST-SDCM 拍摄的彩色照片被用于根据 z 分数评估经命中化合物处理的鱼的健康状况和整体尺寸。将每条鱼的图像导入 Definiens DeveloperXD 图像分析软件（德国 Definiens 公司）。从 20 张图像中制作蒙太奇图，用于训练随机森林像素分类器，以检测在毛细管内拍摄的鱼。训练好的机器学习分类器被应用于自动化的 DeveloperXD 流程中，以检测所有鱼、排除那些接触照片边缘的鱼，随后使用内置的对应函数测量每条鱼的面积和长度（边界框）。鱼的整体外观通过人工进行评估。

为估算体长和面积的变化量，我们对14个不同批次的二甲基亚砜（DMSO）处理对照组鱼的相关数值，以及10次独立的VAST-SDCM运行结果取平均值。我们将对照组的这一波动范围视为体长和面积的正常变化幅度。在制定排除标准时，计算出了面积变化均值的单个标准差（2.92）和长度变化均值的单个标准差（2.25）。当某一数值与对照组的面积和长度变化量相比，均超出单个标准差时，我们认为该数值代表了实验动物体型的变化，因此将排除标准设定为：面积变化对应(>3%)，长度变化对应(>2.5%)。若某一命中化合物的数值同时超出这两项标准，即判定其导致实验动物体型发生变化，将其排除（共排除10个命中化合物）。我们还进行了皮尔逊相关分析，以验证排除标准的有效性。

候选物验证

为验证初筛中的命中化合物，从托克里斯（Tocris）、剑桥生物科学（Cambridge Bioscience）、西格玛（Sigma）、圣克鲁斯（Santa Cruz）、凯曼化学（Cayman Chemicals）等不同公司订购了相同的化合物。再次将胚胎铺板，每皿50枚并去除绒毛膜。根据药物的价格和可获取量，将斑马鱼以每皿50条或置于96孔板中处理，每孔3条。每个实验均设置了批次特异性的二甲基亚砜（DMSO）处理对照组，处理方式与药物处理的斑马鱼一致。若原始化合物 (LOPAC ^{1280}) 仍有库存，则将其纳入并按原稀释度作为阳性对照使用。药物按照初筛中的稀释梯度进行系列稀释，浓度范围为1、2、4、10、20、50至100微摩尔。处理从受精后第1天（1 dpf）或第3天（3 dpf）开始，每日更换化合物溶液。会剔除导致斑马鱼状态不佳的稀释浓度。仅选取外观健康且鱼鳔充盈的斑马鱼，随后在蔡司LSM880 Airyscan共聚焦显微镜上采用高分辨率快速自动扫描技术（FAST）进行成像。

活体成像

在所有验证实验中，我们使用的是Tg(hspGFF62A:Gal4);Tg(UAS:GFP)品系，仅在图6G和6H中使用了Tg(nefma-mcherry); Tg(hspGFF62A:Gal4);Tg(UAS:mem-GFP)品系。对于图7的评估实验，我们使用的是Tg(hspGFF62A:Gal4);Tg(UAS:mem-Scarlet)品系。所有幼鱼均在E3培养基中用600微米烷基苯甲酸三卡因进行麻醉，随后固定在盖玻片培养皿的1.5%低熔点琼脂糖中，并覆盖三卡因/E3培养基以维持麻醉状态。采用配备超分辨率模式Airyscan FAST的蔡司LSM880显微镜，搭配20倍或40倍物镜（蔡司平场复消色差20倍干物镜，编号(NA=1.0)；蔡司平场复消色差40倍水浸物镜，编号(NA=1.0)，数值孔径1.0）获取拼接Z轴堆叠图像（Z轴步长为最优值）。所有毛特纳细胞图像（单张拼接）和所有侧线图像（2-4张拼接，重叠率5%）均采用蔡司Zen Black 2.3软件的默认Airyscan处理设置进行处理。毛特纳细胞图像分别取自脊髓以15-16体节为中心的侧面视图，或后脑的背侧视图。所有侧线图像均取自脊髓以25-27体节为中心的侧面视图。所有侧面视图图像均以左侧为前方、上方为背侧，背侧视图图像则以顶部为前方。图版使用Fiji软件（v1.51n）和Adobe Illustrator 2020（24.0.2）进行制作。

轴突直径、毛特讷细胞体及树突形态的人工与脚本量化分析

对VAST-SDCM图像进行毛特纳神经元直径的手动定量分析。为手动定量毛特纳轴突直径，将Z-stack图像加载到Fiji/ImageJ（v1.51n）软件中。将查找表（LUT）设置为“热色”，并通过最小值/最大值对图像进行阈值处理。为确保与自动化图像分析流程的一致性，仅分析最上方的毛特纳轴突（距离物镜最近的那一根）。叠加一个间距为500微米的随机网格，选取沿该轴突纵轴每隔一个且与轴突相交的正方形进行测量。在每个选定的正方形内，通过多边形选择工具手动勾勒毛特纳轴突的轮廓（由热色LUT标记的青绿色像素识别）。每个样本需沿轴突长度至少勾勒5个区域。计算直径时，将每个片段的面积除以其对应宽度，取5至6个片段的平均值用于分析。将这5至6次直径测量的平均值作为最终数值。由于由于人工测量和基于机器学习的流程由不同人员完成和执行，因此轴突轮廓定义方面存在细微差异是意料之中的（例如，基于热查找表突出的蓝绿色像素的人工描迹，与机器学习模型中基于训练的分割的对比）。为了考虑这种变异性，通过计算相对于每组特异性对照的变化百分比，对轴突直径测量值进行了标准化处理。随后，将标准化后的直径变化以相对于对照组的百分比差异形式绘制出来。研究中仅对最接近物镜的那一根轴突进行了定量分析。

基于脚本的ImageJ定量分析：针对AiryScan FAST 880共聚焦图像的毛特神经直径测定。参照Bin及其同事[20]的详细描述，我们使用自定义编写的ImageJ宏和Fiji软件对AiryScan FAST共聚焦图像中的轴突直径进行测量。简要来说，首先使用“轴突分离工具”从完整幼体的z轴堆叠数据集中分离出两条相邻的毛特神经轴突，为每条毛特神经轴突生成两个独立的最大强度投影图像。随后，利用“轴突追踪工具”根据轴突的强度分布，沿其长度追踪出大致的中点。接着，通过“轴突校准工具”测量所选毛特神经轴突沿其长度的平均直径。直径测量仅针对距离成像物镜最近的轴突进行。为了消除不同批次间的特异性差异，我们通过计算与同批次二甲基亚砜（DMSO）处理对照组的相对变化值，对轴突直径进行了标准化处理。本研究仅对距离物镜最近的那一条轴突进行定量分析。

针对AiryScan FAST 880共聚焦显微镜图像的PLLn轴突直径进行人工定量分析。为人工量化侧线轴突的直径，将Z轴堆叠图像加载到Fiji/ImageJ（v1.51n）软件中。使用多边形选择工具勾勒并人工追踪单条轴突。数据集仅纳入清晰可辨的区域和有髓鞘轴突。每只斑马鱼标记有1至3条侧线轴突，每条轴突的总测量长度至少达到100微米。计算直径时，将每个单独追踪的轴突节段的面积除以其对应宽度，再取所有节段直径的平均值用于分析。为消除鱼群特异性差异，二甲基亚砜（DMSO）处理的对照组与药物处理的幼鱼始终来自同一鱼群，且每个实验均包含多个鱼群的数据。

基于脚本对毛特纳神经元胞体进行定量分析，对树突和轴突初始节段大小进行人工定量分析。将七张涵盖不同强度和采集参数范围的样本图像上传至蔡司ArivisCloud深度学习平台，作为训练数据集。通过在每张图像的多个z轴切片上绘制“胞体”和“背景”的感兴趣区域（ROI）示例对数据集进行标注。对模型进行训练并检查结果，经过三轮标注、训练和优化，才成功在样本训练集中实现胞体的精准分割。将该模型导入ArivisPro软件，并在分析流程中用于检测所有样本的胞体。以单盲方式对检测结果进行人工质量控制（相关定量分析见图7）。为评估树突和轴突初始节段的形态，生成了同一后脑z轴堆栈的最大强度投影图像。在Fiji软件中手动追踪外侧树突，并获取其长度和面积测量值。针对相同图像，我们也手动追踪轴突初始节段，通过将面积除以对应宽度来计算其直径。

统计分析

使用 GraphPadPrism 10 以及基于 Python 的脚本和基于 Excel 的模块脚本组合进行了统计分析，以适配筛选数据的海量规模和复杂程度。图注中包含了 p 值，S1 表中包含了Z值评分排名的数值以及活性化合物的p值。显著性定义为(p<0.05)。除非另有说明，n值代表独立斑马鱼的数量，相关信息标注于图注或S1表中。所有原始数据和统计评估结果详见S1数据。效能分析与可视化工作借助Anthropic完成。(2026)。Claude Sonnet 4.6 [大型语言模型]。https://claude.ai/。效应量采用Cohen’s d系数，以每次比较的合并标准差计算得出。目标效能设定为90%。包括组大小、均值、标准差、效应量及最终效能估算值在内的所有输入参数均在图注和S1数据中予以报告。