题目：Repurposing Triamterene as Chloride Intracellular Channel 1 Inhibitor via LigandBased Approach: A Novel Adjuvant Treatment for Glioblastoma

原文链接:：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2026.07.035

期刊：Molecular Therapy

摘要

鉴定胶质母细胞瘤的有效疗法是临床肿瘤学领域尚未满足的需求。降糖药二甲双胍已被推荐作为胶质母细胞瘤的老药新用治疗药物，其主要作为氯离子细胞内通道1（CLIC1）的阻断剂发挥作用，而CLIC1是胶质母细胞瘤干细胞（GSC）增殖的关键调控因子。然而，二甲双胍复杂的药代动力学特性以及较低的抗肿瘤效力限制了其临床转化。本研究通过基于配体的方法和计算研究，发现利尿剂氨苯蝶啶是一种此前未被发现的CLIC1阻断剂。全细胞膜片钳电生理实验表明，氨苯蝶啶可抑制胶质母细胞瘤干细胞中的CLIC1活性，其半数有效浓度（EC50）比二甲双胍低约200倍。这一效应与二维和三维培养中胶质母细胞瘤干细胞增殖减少、三维模型中侵袭性降低以及胶质母细胞瘤干细胞异种移植斑马鱼胚胎体内的抗肿瘤活性相关。氨苯蝶啶在有限稀释实验和三维培养中还能选择性清除胶质母细胞瘤干细胞，而对人永生化星形胶质细胞、少突胶质细胞和脑内皮细胞的活性仅产生轻微影响。此外，氨苯蝶啶可增强替莫唑胺的抗肿瘤效力，并提升联合放疗/替莫唑胺治疗诱导的细胞毒性。综上，氨苯蝶啶作为一种老药新用的抗胶质母细胞瘤药物，其效力和肿瘤选择性均优于二甲双胍。结合其已知的良好药代动力学特性，氨苯蝶啶成为胶质母细胞瘤患者临床转化的潜在候选药物。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）被世界卫生组织（WHO）归类为成人异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型弥漫性胶质瘤，是成人中最常见的原发性脑肿瘤。1 胶质母细胞瘤为4级肿瘤，是恶性程度最高的胶质瘤类型，其分级依据组织学特征（微血管增生和/或坏死）或特定的基因改变（端粒酶逆转录酶启动子突变、表皮生长因子受体扩增、7号染色体获得及10号染色体缺失）。

胶质母细胞瘤还根据影响肿瘤生物学行为的分子特征被分为四种亚型：原神经型、神经型、经典型和间充质型。3 原神经型亚型以PDGFR-α的表达、杂合性丢失、TP53突变以及少突胶质细胞成熟相关基因的高表达为特征。神经型肿瘤与星形胶质细胞和少突胶质细胞分化相关，且神经元标志物的表达水平升高，包括神经丝轻链、突触结合蛋白1、GABAA受体α1亚基以及溶质载体家族12成员5（SLC12A5）。经典型亚型表现出EGFR的高表达以及与Notch和音猬因子通路相关的基因高表达，同时存在细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A基因的缺失。间充质型胶质母细胞瘤以神经纤维瘤病1型和PTEN等肿瘤抑制基因突变，以及YKL-40、MET、肿瘤坏死因子-α和核因子κB通路调节剂的上调为特征。

胶质母细胞瘤目前的标准治疗策略包括神经外科手术、放疗联合替莫唑胺化疗。5 替莫唑胺是一种DNA烷化剂，可诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡，但其应用常因化疗耐药肿瘤细胞的快速出现而受限。6 具体而言，替莫唑胺的疗效需要6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因甲基化，因为在未甲基化状态下，MGMT基因会编码一种DNA损伤修复酶，该酶可逆转替莫唑胺的作用，导致肿瘤对替莫唑胺产生耐药性。7 此外，现有疗法未能显著改善胶质母细胞瘤患者的预后；即便接受强化治疗，患者的平均生存期也仅为12-18个月，在接受最大剂量增强对比切除术后，确诊后存活5年的患者仅占约6%。

治疗耐药性的主要公认原因之一是存在具有干细胞样特征的肿瘤细胞亚群，这类细胞被称为胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）。9 根据癌症干细胞（CSC）模型，70 肿瘤呈现层级组织结构，其中占肿瘤细胞小部分的癌症干细胞位于顶端，负责肿瘤的发生与进展。71 胶质母细胞瘤干细胞通过分化过程产生所有不同的亚群，导致肿瘤团块内出现细胞异质性，73 这是胶质母细胞瘤的特征之一。10 有趣的是，在一些非恶性人类脑肿瘤中也发现了类癌症干细胞群体，74 即脑膜瘤11 或垂体腺瘤，12 这表明层级模型是所有脑肿瘤发生发展的基础。75 76

胶质瘤干细胞为胶质母细胞瘤赋予了所有恶性特征，包括高增殖率与高存活率、对细胞凋亡的耐药性、浸润脑实质的能力、新生血管生成及血管生成拟态的激活、免疫监视逃逸、静息态与激活态之间的动态转化、代谢谱的改变、肿瘤微环境的重塑，更重要的是对放疗和化疗的耐药性。

尽管已鉴定出多种参与胶质母细胞瘤干细胞（GSC）获得并维持干细胞样特征的分子标志物（如骨形态发生蛋白、血清和糖皮质激素调节激酶1、 sprouty2、去乙酰化酶1、生殖细胞相关螺旋-环-螺旋转录因子1、趋化因子配体12/趋化因子受体4、细胞朊蛋白以及WNT/β-连环蛋白通路）16-22，但截至目前，尚无针对GSC的分化疗法获批。因此，现有疗法的局限性以及创新靶点的缺失，凸显出胶质母细胞瘤（GBM）迫切需要新型、多靶点且更安全的治疗方案。

主要的临床前和临床研究均以药物重定位策略来探索不同的治疗方法，即针对不同疾病获批的临床药物，需在不同临床适应症中检测其对已知或新型分子靶点的作用。23,24 在寻找胶质母细胞瘤（GBM）分子靶点的过程中，细胞内氯离子通道1（CLIC1）被确定为胶质母细胞瘤干细胞（GSC）增殖和致瘤活性的关键调控因子。25-27 CLIC1具有变构结构特征，可从可溶性胞质状态转化为整合膜通道形式（tmCLIC1）。28 氧化后，单体CLIC1发生结构重排，暴露出疏水区域并形成可溶性非共价二聚体。随后，多聚体CLIC1复合物从胞质转移至质膜，获得形成氯离子通道的能力。然而，CLIC1在胶质母细胞瘤干细胞质膜中呈组成型表达29，且组成型激活以促进细胞周期进程。29 值得注意的是，抗糖尿病药物二甲双胍及其他双胍类分子被证实是CLIC1离子门控活性的强效抑制剂，这与其对胶质母细胞瘤干细胞增殖的抑制作用存在生物化学关联。25,29-31 多项临床前研究表明，二甲双胍可通过多种胞内通路对多种肿瘤的干细胞样细胞发挥抗增殖作用。32-41 因此，多项临床试验相继启动。42 但截至目前，其在肿瘤学领域的临床转化尚未取得阳性结果。这主要归因于其较差的药代动力学特性43以及较低的抗肿瘤效力——体外研究中需达到毫摩尔级浓度才能发挥作用，25 这使得在患者体内实现治疗窗的可行性大幅降低。此外，虽有研究提出多种创新给药途径以改善药代动力学和肿瘤内药物浓度，44-47 但目前仍未获得确定性结果。

由于抑制CLIC1是根除胶质瘤干细胞（GSCs）的极具潜力的靶点，本研究采用基于配体的方法，从CLIC1抑制剂出发，在已获批药物中筛选新型潜在的CLIC1阻断剂。

先前研究中鉴定出的双胍骨架。31 该分析使我们确定了曲安奈德110（TMT）——一种临床批准的保钾利尿剂——为最佳命中化合物，随后在体外和体内测试了其作为抗肾小球基底膜111药物的药理特性。利用该蛋白可溶性形式的现有112X射线结构，确定了TMT的推定结合模式

结果

基于配体的方法鉴定氨苯蝶啶为潜在的CLIC1抑制剂

CLIC1蛋白在形成116跨膜通道时，其潜在配体结合位点缺乏任何结构信息，这限制了基于蛋白靶点的方法来识别能够干扰其活性的分子的应用。基于这一情况，基于配体的方法是一种补充策略，可推导结合所需的空间和功能条件，从而推动潜在新先导化合物的计算机辅助筛选。被鉴定为CLIC1通道抑制剂的双胍类化合物的构效关系表明，该官能团的环化显著提高了生物活性（即二甲双胍 (IC_{50}: ≈10 mM) 与环氯胍 (IC_{50}: ≈180 mu M) 的对比）（图1）。[31] 因此，研究人员利用这一结构特征在DrugBank数据库（https://go.drugbank.com）中寻找潜在的CLIC1调节剂，采用药物重定位策略，将搜索范围限定于已获批药物。研究目的124是筛选出具备此前鉴定的活性相关官能团，且125可能具有新颖结构特征的化合物，这类化合物相较于已知的CLIC1抑制剂，有望在亲和力/效价方面取得突破。通过环氯胍的杂环核心（即4,5-二氢-2,6-二氨基-1,3,5-三嗪）进行子结构初步搜索，仅检索到环氯胍本身。同样，对1,3,5-三嗪-2,4-二胺的搜索仅得到三亚蜜胺（即2,4,6-三（二甲氨基）-1,3,5-三嗪），但由于其氨基发生了广泛甲基化，预计会对活性产生不利影响——而游离氨基是二甲双胍衍生的CLIC1抑制剂的共同特征，[31] 因此该化合物被排除。最终，对2,4-二氨基嘧啶的搜索得到6个潜在候选化合物，列于补充图S1中。其中，乙胺嘧啶和TMT与环氯胍的结构相似度最高，因为这两种化合物的杂环基团均连有直接结合的苯环部分。然而，乙胺嘧啶仅在杂环骨架的氮原子数量（2个 vs 3个）以及乙基（乙胺嘧啶）替代二甲基（环氯胍）这两点上与环氯胍不同，预计其活性与环氯胍相当。相比之下，TMT作为候选化合物则更具研究价值，因其具有此前未被研究过的富氮双环骨架（蝶啶），同时保留了环氯胍相关的139结构特征。蝶啶环可视为胍基的延伸，140能够探索结合位点的新区域，且有望成为具备141新型结构的先导化合物对 CLIC1 具有更高的亲和力/效价。基于这一原因，TMT 被选用于后续的 142 项生物学实验。

图1. 用于实验的二甲双胍、环氯胍、2,4-二氨基嘧啶和氨苯蝶啶的二维结构。(IC50) 这些数值指的是在先前报道的研究中，这些化合物阻断 CLIC1 活性的能力。

氨苯蝶啶可直接抑制胶质瘤干细胞中CLIC1介导的离子电流

为证实氨苯蝶啶（TMT）可阻断 CLIC1 离子电流，我们对胶质母干细胞（GSCs）开展全细胞膜片钳电生理实验（图 2）。实验先采用标准细胞外液记录对照组电流（图 2a），随后施加 100 微摩尔 / 升（µM）氨苯蝶啶处理（图 2b），最后加入 100 µM 茚氧基乙酸 94（IAA94，一种跨膜型 CLIC1 选择性抑制剂）（图 2c）。该实验方案可分离总电流中分别对 TMT、IAA94 敏感的电流组分，其中仅对 IAA94 敏感的电流部分，就是由跨膜 CLIC1（tmCLIC1）介导的特异性电流（图 2d、e）。研究绘制量效曲线，明确抑制跨膜 CLIC1 所需的有效药物浓度（图 2f）。实验数据显示，100 µM TMT 可将跨膜 CLIC1 电流抑制约 50%；但当药物浓度达到 200 µM 时，氨苯蝶啶会造成细胞活力下降，无法采集可靠的电生理检测数据。

图2. 氨苯蝶啶对胶质母细胞瘤干细胞中CLIC1介导的离子电流的影响。a、b、c) 胶质母细胞瘤干细胞的代表性全细胞电流，在 -60 至 +60 mV 电压下以 20 mV 增量测量得到。所示电流分别记录于静息状态（a，对照组）、用 100 微摩尔 TMT 灌流后（b）以及用 100 毫摩尔 TMT 和 100 微摩尔 IAA94 灌流后（c）。d) 对照组细胞（圆形，CTR）的电流-电压（I/V）曲线，经100微摩尔TMT灌流后（三角形），以及经100毫摩尔TMT加94微摩尔吲哚-3-乙酸（IAA94）灌流后（正方形）。添加吲哚-3-乙酸（IAA94）是为了评估TMT灌流后残留的氯细胞氯离子通道1（CLIC1）电流 (n=5)。e) TMT 100 mM敏感电流的I/V曲线（圆形）以及TMT 100 μM联合IAA94 100 μM敏感电流的I/V曲线（三角形，n=5）。f) TMT对CLIC1离子电流的剂量-反应曲线。归一化电流值通过计算IAA94敏感电流与TMT敏感电流的差值得到，并以IAA94敏感电流（即tmCLIC1电流的总量）进行归一化。CLIC1抑制作用的计算得到的TMT半最大抑制浓度 (IC50) 为138.8微摩尔。

我们进一步研究了TMT是否与二甲双胍在CLIC1上具有相似的作用位点，二甲双胍是一种双胍类药物，我们之前的研究已证实其可抑制胶质母细胞瘤干细胞中的跨膜CLIC1。29,31 二甲双胍在Arg29位点与跨膜CLIC1相互作用，且其突变（R29A）可消除二甲双胍对tmCLIC1的抑制作用及其抗肿瘤功效。

因此，我们在CLIC1野生型被沉默且表达CLIC1 R29A突变体的胶质瘤干细胞（GSCs）上测试了TMT的活性。实验方案与之前一致，仅在基线记录后、TMT处理前增加了二甲双胍灌流步骤。这验证了突变细胞对二甲双胍敏感性的丧失。如预期的那样，二甲双胍处理并未显著降低电流。相反，100微摩尔的TMT显著抑制了tmCLIC1的活性，几乎完全消除了离子电流（补充图S2a-f）。我们随后在CLIC1 R29A背景下进行了TMT的剂量反应曲线实验，计算得出的(IC50)显著降至26.42微摩尔（补充图S2g）。这些结果不仅表明R29A突变不影响TMT与tmCLIC1的结合能力，还表明与野生型相比，该突变增强了tmCLIC1对TMT的敏感性。

基于计算机模拟识别氨苯蝶啶在可溶性 CLIC1 蛋白上的潜在结合位点

为了确定 TMT 在 CLIC1 蛋白上的潜在结合位点，本研究开展了计算机分子对接研究。

CLIC1的特征是可溶性胞质形式（补充图S3A、B）与膜结合构象之间发生自发相互转化。这一过程受多种因素调控，包括氧化⁴⁸、胞内锌离子释放⁴⁹、pH值⁵⁰,⁵¹以及膜成分⁵²。胆固醇与该蛋白结合，诱导结构重排和不同的低聚状态，这是膜插入所必需的⁵³。Houssain等人⁵²证实，CLIC1仅在胆固醇存在的情况下才能插入磷脂单分子层，而胆固醇的作用不仅是促进与……的结合膜，还能促进其更深入地渗透进脂质单分子层。尽管其插入脂质双分子层的机制仍有待完全阐明，但光谱学研究支持的一种拟议模型54表明，N端结构域包含一个跨膜区域（β1-α1-β2），该区域会发生结构重排以形成单个长的跨膜α螺旋，而荧光共振能量转移数据与6-8个亚基形成的低聚体的情况相符55。然而，迄今为止，尚未获得膜结合构象或通道低聚体状态的高分辨率结构数据，仅获得了还原态和氧化态下可溶性形式的相关数据。理论上，TMT的抑制活性可能通过配体与蛋白质的可溶性形式结合来介导，以阻止其构象转变为具有膜结合能力的形式，也可能通过配体与蛋白质的膜结合形式结合来实现。

CLIC1 可溶性形式与 NSC602247（4-[[2-[(4-羟苯基)氨基]-6-甲基-嘧啶-4-基]氨基]苯酚，PDB 编号：7FBQ，补充图 S4A）结合的近期 X 射线结构¹⁸⁵促使我们通过计算机模拟研究 TMT 与 CLIC1 之间的相互作用。NSC602247 是一种被专利为阿尔茨海默病潜在治疗剂的化合物¹⁸⁶（专利号：EP-1473289-A1）。为了确定 TMT 在 CLIC1 可溶性单体形式上的潜在结合位点，我们开展了全面且无偏的分子对接和分子动力学（MD）模拟。如方法部分详细所述，我们进行了多次分子对接实验，既聚焦于 NSC602247 结合位点，也覆盖整个蛋白（全盲对接）。我们还考虑了由 NSC602247 结合稳定的 CLIC1 二聚体形式⁵⁶。此外，计算机模拟研究还进一步拓展至 CLIC1 与谷胱甘肽结合的 X 射线结构（PDB 编号：1K0N）⁵⁷（该结构未与 NSC602247 结合），以及 CLIC1 的氧化形式（包括单体和二聚体，PDB 编号：1RK4）⁴⁸。事实上，在氧化条件下，CLIC1 单体的 N 端区域会因分子内二硫键（Cys24-Cys59）的形成而发生结构转变，从β-折叠变为α-螺旋构象，进而暴露一个较大的疏水区域，该区域对应溶液中的二聚化界面，也可能是膜结合界面⁴⁸。二聚体能够形成功能性氯离子通道，而还原条件或 Cys24、Cys59 突变为丝氨酸均会阻碍通道的形成与活性。据此，CLIC1 的氧化形式可被视为膜结合通道形式的早期阶段。而 CLIC1 与谷胱甘肽结合的结构则被用于评估 TMT 与谷胱甘肽在 CLIC1 催化位点之间可能存在的稳定相互作用，该相互作用原则上可能会干扰其氧化还原酶活性⁲⁰²。结合结合能最优和聚类丰度最高的最佳构象，我们以其为起点开展了长达 1 至 2.5 微秒的分子动力学模拟，以评估构象稳定性并观察可能的重排。仅保留至少稳定 500 纳秒的构象作为代表性构象进行详细分析（补充图 S4B-E）。通过分子动力学轨迹分析，CLIC1 还原单体形式出现了四个潜在结合位点，均位于谷胱甘肽结合位点的对侧（补充图 S3A、B）。结合位点 1 跨越硫氧还蛋白区域β-折叠2和α-螺旋1之间的209结构域。在该位点发现两种构象：在构象1a（图3a）中，TMT与天冬酰胺42侧链和苯丙氨酸41羰基主链形成稳定氢键，而苯环被210芳香残基苯丙氨酸31、色氨酸35和苯丙氨酸41包围。构象1b（图3B）相对于构象1a旋转了(≈90^{circ})：与缬氨酸43的NH主链相互作用。相反，苯环现在指向异亮氨酸21，位于连接硫氧还蛋白结构域β-折叠1和α-螺旋1的环上。在分析不同对接构象的其他分子动力学（MD）模拟中也发现了同一位点。位点2靠近位点1，但向C端结构域的最后一个螺旋偏移，涵盖C端螺旋、连接β-折叠1和α-螺旋1的环以及α-螺旋1之间的区域。在该位点，配体（构象2，图3C）与天冬氨酸225侧链形成氢键相互作用，而苯环与硫氧还蛋白结构域上的苯丙氨酸31侧链形成芳香堆积。位点3由全螺旋C端结构域中连接螺旋2和3以及螺旋4的环构成。TMT 219的结合（构象3，图3D）由氢键网络稳定，该网络涉及天冬酰胺212（螺旋4）和谷氨酰胺164（环）220侧链以及甘氨酸205（螺旋4）和苏氨酸145（环）的羰基主链。杂芳族双环核心和221苯环与精氨酸208（螺旋4）和精氨酸165（环）侧链相互作用。位点4对应于NSC602247 222结合位点（构象4，图3E和F、图S4A）。后一种构象具有更高的柔性（参见补充图S4D），这是因为在分子动力学轨迹中观察到两种主要排列，分别称为构象4a和构象4b，如图3E、F所示。这些构象的特征是TMT氨基形成的氢键模式不同：组氨酸207（构象4a，图3E）或组氨酸185（构象4b，图3F）。在两种构象中，杂环骨架均与酪氨酸214形成芳香堆积。该位点对应于7FBQ晶体堆积中观察到的二聚化界面，我们进一步利用二聚体结构进行对接和分子动力学模拟以探究该界面。二聚体复合物的代表性分子动力学框架如图S4F所示。结合构象概括了单体形式中观察到的构象4a（图3E），与组氨酸207形成氢键，并分别通过与另一个单体的组氨酸74和苯丙氨酸83的极性作用和芳香堆积进一步稳定。与仅配体与单体结合的分子动力学模拟中观察到的情况相比，配体与第二个单体之间的相互作用稳定了配体构象（补充图S4G与S4D对比）。总之，该计算234方法在可溶性形式的CLIC1上鉴定出四个推定的热点区域，即位点1-4。除了在CLIC1-NSC602247复合物中观察到的位点4（补充图S4A）外，位点3在结合中仍涉及螺旋H4。有趣的是，位点1在一定程度上与人类谷胱甘肽转移酶P1-1（PDB：6Y1E）中2-（N-吗啉代）-乙磺酸（MES）和IAA94的结合位点重叠，该位点位于硫氧还蛋白结构域的β-折叠2和螺旋1与全螺旋结构域的C端螺旋之间的界面处。这些已鉴定的结合位点与二甲双胍的结合位点相距甚远29，与膜片钳实验获得的结果一致，后者显示TMT和二甲双胍表现出不同的行为。241位点2的结合将C端螺旋锚定到硫氧还蛋白结构域。由于蛋白质的柔性242这似乎是插入膜的一个先决条件，53 个 TMT 与位点 1-4 的结合可通过整体结构的刚性化来阻止胞质向膜的转变。

为了通过实验验证 TMT 可能通过这一机制阻止 CLIC1 插入细胞膜从而降低其活性的可能性，研究人员在 GBM 3 胶质瘤干细胞中通过荧光强度检测了 tmCLIC1 的质膜定位情况，具体是将细胞与 TMT 共同孵育 1 至 48 小时后进行检测。在每次处理结束后，洗去 TMT，再通过荧光强度检测法在 48 小时后测定 tmCLIC1 的荧光值。与对照组细胞相比，经 TMT 处理的细胞在孵育 5 小时后，tmCLIC1 的水平显著降低。这一效应是暂时性的，因为延长孵育时间至 48 小时后，其荧光信号与对照组已无明显差异（图 3G）。

此外，针对二聚体和单体氧化形式的CLIC1开展的对接结合加分子动力学模拟研究，还发现了TMT的另一个潜在结合位点，该位点位于全螺旋N端与C端区域的交界处，靠近疏水二聚体界面。在该位点，TMT存在两种稳定的结合构象：构象1中，TMT通过由Phe31、Phe41和Arg51侧链参与的芳香族与极性相互作用网络，以及与Ser221和Cys223主链羰基形成的氢键实现稳定（图3H及补充图S4E）；构象2中，TMT通过Gln56和Gln63参与的芳香族-酰胺相互作用，以及与Glu53的极性相互作用实现稳定（图3I及补充图S4E）。鉴于CLIC1的氧化形式可能更能真实反映tmCLIC1的结构转变，我们通过单通道电生理实验验证了TMT与该通道是否存在直接相互作用。采用 outside-out 记录模式的膜片钳技术，证实了TMT可直接抑制tmCLIC1单离子通道。图3L展示了在对照条件和TMT灌流后，来自GBM3胶质瘤干细胞的tmCLIC1单通道连续记录数据。结果显示，TMT灌流2分钟后，tmCLIC1的活性已出现下降，持续施加TMT 10分钟后，单通道电流被完全抑制。值得注意的是，在大多数outside-out单通道实验中，药物洗脱3分钟即可使通道活性完全恢复（图3L）。

图3. 氨苯蝶啶在可溶性形式CLIC1的1-4号结合位点上的推定结合构象。CLIC1-氨苯蝶啶复合物的代表性分子动力学构象。CLIC1 还原型的结合构象根据相应位点编号如下：A) 构象1a；B) 构象1b；C) 构象2；D) 构象3；E) 构象4a；以及F) 构象4b。配体以深灰色显示，CLIC1 N端结构域（残基：1-95）以金色显示，C端结构域以棕褐色显示。配体的重原子以及配体的(5 AA)范围内的蛋白质侧链均采用棍状模型表示。氢、氮、氧、硫原子分别以白色、蓝色、红色和黄色绘制。氢键采用绿色线条模型表示。G) 氨苯蝶啶治疗会阻碍CLIC1的跨膜表达。GBM3胶质瘤干细胞在与180微摩尔氨苯蝶啶孵育不同时间后，跨膜CLIC1的相对荧光强度。均值±标准差，(***p<0.001)（单因素方差分析，图基多重比较检验，(n=5）。H-I) 氨苯蝶啶与氧化型 CLIC1 结合构象的代表性分子动力学模拟帧（PDB 编号：1RK4），分别为二聚体（构象 1，图 G）和单体（构象 2，图 H）。配体显示为深灰色，蛋白质的着色方式与图 A-F 所述一致。在图 H 中，1344 1345 1346 1347 1348 1349 1350 1351 1352 1353 1354 1355 1356 1357 1358 1359 1360 1361 1362 1363 1364 c) 报告TMT效价的表格，以半数最大抑制浓度（IC₅₀，IC_{50}）值表示 1365 1366 1367 1368 1369 1370 1371 1372 1373 1374 1375 1376a) 来自1377 GBM 3的对照组和处理组3D胶质瘤干细胞类器官的代表性共聚焦荧光显微镜图像，经EdU（绿色）和DAPI（蓝色）染色。(Scale bar =500 mu m)。b) 类器官中EdU阳性和DAPI阳性细胞核的百分比定量分析。(*p<0.05，单因素方差分析，事后分析采用图基检验，1379 (^{*} p<0.05) (**p<0.01) , (n=3)

氨苯蝶啶对人类胶质瘤干细胞体外增殖的抑制作用

在分析了TMT与CLIC1相互作用的分子和生理基础后，我们验证了其对胶质瘤干细胞（GSC）恶性行为的影响。首先，通过剂量反应实验确定了TMT对胶质瘤干细胞增殖的作用。为应对已知的胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤间异质性，我们在源自8个独立肿瘤的胶质瘤干细胞富集培养物中开展了此项分析，其中包括6种神经亚型和2种间充质亚型（患者及肿瘤特征见补充表S1）。经转录组测序（RNA-seq）和蛋白质印迹（Western blot）分析，我们发现所有分析的胶质瘤干细胞培养物中均存在高表达的CLIC1，仅胶质母细胞瘤39样本中CLIC1表达极低（补充图S5a、b、c）。相反，其他CLIC亚型（CLIC2-6）则未出现以显著的方式表达，除了 CLIC4 之外，在所有分析的 276 个胶质母细胞瘤（GBM）样本中均检测到其 mRNA 高水平表达，包括 GBM39（补充图 S5a）。通过 MTT 实验，我们发现 TMT 处理 48 小时 277 会对所有测试的表达 CLIC1 的胶质瘤干细胞（GSC）培养物的增殖产生剂量依赖性抑制作用，其 IC 278 值范围为 74.8 至 30.3 微摩尔，最大效能范围为 -60% 至 -82%（图 4a、b 及 279 补充表 S2 提供统计分析）。我们采用多种实验方法验证了这些结果，包括在二维（2D）培养中基于图像的细胞汇合度测定（使用 Incucyte 技术）以及对活跃合成 DNA 的细胞进行 EdU 标记（补充图 S6a 和 S6b）。在这两个实验中，TMT 的作用均呈浓度和时间依赖性，且随着处理时间的延长 283 284 效能逐渐增强。

相反，在天然缺乏CLIC1表达的GBM39来源的神经干细胞样细胞中（参见补充图S5a、285b、c），即使在测试的最高浓度（300微摩尔）下也未观察到细胞增殖受到抑制，286这证实了CLIC1抑制是TMT发挥抗胶质母细胞瘤活性所必需的（图4c）。287

将这些结果与二甲双胍在相同的7种表达CLIC1的胶质母细胞瘤干细胞（GSC）培养物中所展现的效力和效能进行比较，我们证明了尽管两种药物的最大抗增殖活性相当（效能：TMT为-73%，二甲双胍为-83%），但TMT的效力显著高于二甲双胍（0.069对12.17毫摩尔）（图4d）。

通过细胞计数和台盼蓝排斥试验进行活力评估，我们观察到TMT的作用主要292取决于细胞抑制活性，且尽管存在一定的瘤间差异（即在GBM23中观察到更高的疗效293），但仅在测试的最高TMT浓度（300微摩尔，图4e）下才出现细胞毒性294。事实上，我们证实了TMT对细胞增殖的抑制作用依赖于细胞周期295的放缓以及细胞在G1期的蓄积296。具体而言，通过剥夺生长因子72小时使细胞同步于G1/G0期，随后在T0时刻通过添加完全培养基释放细胞，同时设置不加TMT或加入100或200微摩尔TMT的条件（染色细胞的代表性图像见补充图S7297，各细胞周期阶段细胞定量分析见补充图S8298）。随后在6、12、24和36小时后分析细胞的299细胞周期阶段分布300。对照组细胞逐步进入S期，随后进入G2/M期，到36小时时超过60%的细胞已离开G1期301。相反，经TMT处理的细胞表现出剂量依赖性的细胞周期阻滞，从生长因子饥饿状态释放后36小时，约80%的细胞仍停滞在G1期302。

图 4 氨苯蝶啶抑制患者来源胶质母干细胞（GSC）增殖。a）采用 MTT 法检测药物处理 48 h 后，氨苯蝶啶（TMT）对胶质母干细胞增殖的量效曲线。本分析共使用 7 株分离自不同患者的胶质母干细胞，所有细胞均表达 CLIC1（见补充图 S5）。数值均以未加药对照组细胞为基准进行归一化处理，数据为 3 次独立实验的平均值 ± 标准差，每组实验设置 4 个平行复孔；统计学差异详见补充表 S2。b）采用 MTT 法检测药物处理 48 h 后，GBM39 细胞株的胶质母干细胞增殖量效曲线，该细胞株不表达 CLIC1（见补充图 S5）。数值以空白对照组为基准归一化，数据为 2 次独立实验的平均值 ± 标准差，每组实验设置 4 个平行复孔。c）表格汇总所有受试胶质母干细胞中氨苯蝶啶的药效参数，以半数抑制浓度（IC₅₀，代表药物效价）和最大抑制效果（代表药物效能）呈现，每组实验重复 3 次。d）汇总 7 株 CLIC1 阳性胶质母干细胞的平均反应曲线，对比氨苯蝶啶（TMT）与二甲双胍（MET）的平均量效曲线、效价与效能，每组实验重复 3 次。e）通过细胞总数计数证实，氨苯蝶啶可抑制胶质母干细胞增殖，且不会造成明显细胞活力损伤；活细胞数量采用台盼蓝拒染法统计。左侧纵轴：黑色柱代表总细胞数，白色柱代表活细胞数，分别展示空白对照组（CTR）与氨苯蝶啶处理组；右侧纵轴：各组活细胞占总细胞的百分比。数据为 3 次独立实验平均值 ± 标准差。组间统计学差异标注：P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001（相较于空白对照组）；°°°P＜0.001（同浓度下相较于总细胞数）；统计学方法采用单因素方差分析，事后检验为图基检验（Tukey 法）。

重要的是，在用EdU标记的GBM3 3D类器官中也观察到了类似的结果。正如此前304项研究报道的那样30，在3D培养体系中，增殖的胶质瘤干细胞（GSCs）主要定位于类球体的边缘，尽管如EdU掺入DNA的结果所示（图5a），每个切片内部区域的细胞也在积极增殖。TMT处理使所有类器官组成中的增殖细胞数量出现了具有统计学意义且剂量依赖性的减少（图5b）。

图 5 氨苯蝶啶以剂量依赖性方式抑制三维胶质母干细胞（GSC）的增殖。a）对照组与氨苯蝶啶处理组 GBM3 来源三维胶质母干细胞类器官的共聚焦荧光显微镜代表性图像；EdU 标记增殖细胞（绿色），DAPI 标记细胞核（蓝色），比例尺 = 500 微米。b）类器官内 EdU 阳性细胞核占比定量统计。*p＜0.05，**p＜0.01；统计学方法采用单因素方差分析，事后多重比较采用图基检验，实验重复 3 次。

随后我们检测了TMT的抗肿瘤效应是否对干细胞样胶质母细胞瘤细胞具有选择性，这一点与二甲双胍等其他CLIC1阻断药物的观察结果一致29,309。为此，我们比较了TMT对从胶质母细胞瘤3号、5号、19号和23号样本中分离的胶质瘤干细胞（GSC）培养物的作用，以及与这些培养物经分化后获得的细胞（通过在培养基中用胎牛血清替代生长因子培养14天得到）的作用。如图6a所示，TMT在抑制胶质瘤干细胞增殖方面的高效力和有效性在分化细胞中显著降低（单个胶质母细胞瘤的曲线见补充图S9a）。此外，通过极限稀释分析（ELDA）我们证实，TMT呈剂量依赖性地将培养物中干细胞样细胞的频率估计值从1/6（对照组细胞）降低至1/27（30微摩尔TMT处理组）和1/75（100微摩尔TMT处理组）（图6b）。值得注意的是，利用从19号胶质瘤干细胞培养物中获得的三维类器官，我们发现100微摩尔TMT处理48小时会导致代表胶质母细胞瘤干细胞样细胞的Sox2阳性细胞显著耗竭，而胶质母细胞瘤分化的GFAP阳性细胞则未受影响（代表性图像见图6c，定量分析见图6d；单通道图像见补充图S9b）。这些数据证实了极限稀释分析的结果，即TMT对胶质母细胞瘤干细胞样细胞（Sox2阳性）的疗效显著高于其对分化细胞（GFAP阳性）的疗效，具有选择性。

图6. 氨苯蝶啶的抗肿瘤活性对胶质瘤干细胞的存活率具有选择性影响。a) 来自同一肿瘤（胶质母细胞瘤3、5、19和23号）的胶质瘤干细胞和胶质母细胞瘤分化细胞的浓度-反应曲线。处理48小时后通过MTT法测定细胞活力。数值以未处理细胞为基准进行标准化。曲线显示4株胶质母细胞瘤细胞培养物的平均值±标准差，数据来自n=3次独立的(n=3)次独立实验，每次实验均进行四次平行测定。各株胶质母细胞瘤细胞培养物的单独曲线见补充图S9a。统计显著性指的是分别对GSC和GBM对照组进行区分（单因素方差分析，事后分析采用图基检验）。(**p<0.01)、(***p<0.001)。b) 类干细胞频率（以球体形成能力测定）通过极限稀释分析（ELDA 软件）测得。将 GBM3 胶质瘤干细胞进行梯度稀释后接种至 96 孔板中。箱线图展示了所测频率的中位数及数值范围，相关数据已列于表格中。胶质瘤干细胞的干细胞频率以 1/x 的比值估算，并标注了 95% 置信区间的上下限（其中 1 代表干细胞，x 代表所有细胞）。同时列出了组间比较的卡方分析所得 P 值。c) 对照或 TMT（100 微摩尔，48 小时）处理的 GBM19 胶质瘤干细胞类器官中 Sox2 和 GFAP 表达的代表性图像。细胞核用 DAPI（蓝色）进行复染。单通道图像见补充图 S9b。比例尺 100 微米。d) 3D类器官中类干细胞（Sox2+）和分化细胞（GFAP+）胶质母细胞瘤19细胞的定量分析。数值以(Sox2+)（或GFAP+）细胞与总细胞数（经DAPI染色的细胞核）的比值获得。TMT处理可选择性减少胶质母细胞瘤干细胞类器官的含量，而不影响分化细胞。数据为每组两个独立类器官的6个不同区域的25个Z轴堆叠图像的平均分析结果。(^{*} p<0.05)（非配对t检验）。

最后，我们通过比较胶质瘤干细胞（GSCs）中观察到的抗增殖活性，与在干细胞允许培养基中培养的儿科低级胶质瘤细胞（RES186：毛细胞型星形细胞瘤，世界卫生组织1级；RES259：星形细胞瘤，世界卫生组织2级）或非肿瘤组织来源细胞（永世人星形胶质细胞、少突胶质细胞、脑内皮细胞或人脐带间充质干细胞）培养物中的药物作用，来探究肿瘤治疗药物（TMT）的特异性。在这些实验中，我们将从TMT浓度-反应曲线中得到的(IC50)与所分析的7种胶质瘤干细胞培养物的平均值进行比较，以计算药物治疗的选择性指数（SI）。58

TMT 导致低级别星形细胞瘤培养物的细胞活力降低，这与在胶质瘤干细胞（GSCs）中观察到的结果几乎一致（半数抑制浓度 [m (RES186 = 86.6)；(RES259 = 84.9 vs) (GSCs =69.6)]）（统计分析见补充图 S10a、b 及补充表 S2）。

相反，TMT 对正常细胞的活性显著更低，且在永生化人星形胶质细胞（SVG-A）、少突胶质细胞（MO3.13）或脑内皮细胞（HBEC5i）中无法达到显著的 333 (IC50)，而 ucMSCs 中计算出的 IC 334 (IC 50) 远高于 GSCs（226.7 对 69.6 微摩尔）（统计分析见补充图 S10a、b 及补充表 S2）。335

根据“选择性标准”（选择性指数＞10），与人类星形胶质细胞、少突胶质细胞、脑内皮细胞或非肿瘤干细胞（人脐带间充质干细胞）相比，336 (SI>10) 58 TMT 对胶质瘤干细胞或低级别胶质瘤细胞表现出高选择性；不过在非肿瘤干细胞的情况下，观察到的胶质瘤干细胞选择性虽稍不明显，但仍具有显著意义 (SI>3)（补充图S10b）。

氨苯蝶啶对人类胶质瘤干细胞侵袭性的抑制作用

胶质瘤干细胞（GSCs）快速侵袭脑实质的能力是胶质母细胞瘤（GBM）对当前神经外科和放射治疗方法反应不佳的主要特征之一。因此，我们采用三维（3D）模型来评估三甲基锡（TMT）削弱GSCs从类器官中脱离并侵袭周围包埋基质（Matrigel）的能力的潜在效果。来自胶质母细胞瘤3号、5号、19号和23号样本的对照培养物表现出高侵袭性，接种后仅15小时就已显现（图7a）。所分析的四种GSC培养物的细胞外基质（ECM）侵袭能力相似，不过在胶质母细胞瘤5号样本中观察到的侵袭面积略小。同时，用浓度为30微摩尔和100微摩尔的TMT处理三维培养物，15小时后检测侵袭情况。需重点指出的是，在该时间范围内，TMT不会对细胞增殖产生显著抑制作用。100微摩尔的TMT显著抑制了所有GSC培养物的细胞外基质侵袭（所有GSC的平均抑制率约为56%），而在最低测试浓度30微摩尔下，仅在胶质母细胞瘤3号和23号样本中观察到统计学上的显著差异（图7a）。重要的是，当我们在从胶质母细胞瘤39号样本中分离出的、本身不表达氯离子细胞内通道1（CLIC1）的GSCs中开展相同实验时，发现这些细胞侵袭球体植入的细胞外基质的能力显著缺失。实际上，仅有极少数细胞能够离开球体并进入基质胶（图7B），这表明GSC的侵袭性需要活性的氯离子细胞内通道1。此外，TMT并未改变这种微弱的侵袭能力，这进一步证实了其发挥抗胶质母细胞瘤活性依赖于对氯离子细胞内通道1的抑制。

氨苯蝶啶的体内抗肿瘤活性 357

在斑马鱼胚胎脑部通过异种移植荧光标记的GBM3来源神经胶质瘤干细胞（GSCs）后，测试了TMT对抗所形成肿瘤生长的体内活性。注射后359天，检查胚胎肿瘤形成情况，并通过向鱼水中添加TMT（50、100和250微摩尔）进行处理。在进一步培养24小时和72小时后，通过比较肿瘤细胞占据的面积分析肿瘤生长情况。在对照组动物中，肿瘤生长使肿瘤面积平均增加约5倍，不过观察到动物间存在个体差异。TMT处理几乎完全抑制了肿瘤生长，在所有测试动物中均达到相当的效果（图7c）。然而，我们发现使用50微摩尔TMT时即达到统计学显著性，肿瘤体积生长减少约4倍（图7c）。100微摩尔TMT处理得到了相似结果，而最高浓度（250微摩尔）对胚胎产生了一定毒性，仅评估了少量动物，无法进行有效的统计学分析（图7d）。在GBM19和GBM23来源的GSCs中，100微摩尔TMT发挥了相似的抗肿瘤活性，使GSC生长减少约5倍（补充图S11）。我们还对比了TMT与二甲双胍对斑马鱼体内GSC肿瘤发生的作用效果，二甲双胍是另一种氯细胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）阻滞剂，且已被重新用作胶质母细胞瘤（GBM）的潜在治疗药物。如先前报道，27高剂量二甲双胍（1-10毫摩尔）可显著抑制斑马鱼中GBM3来源GSC的生长（补充图S12），但该效果不仅效力显著更低（100微摩尔对比10毫摩尔），且疗效也不如TMT（图7e）。重要的是，我们通过高效液相色谱（HPLC）分析证实，TMT在体内的水平按照之前实验处理的斑马鱼头，其浓度达到了61.4-76.5微摩尔（图7f），与体外实验中确定的IC值相符。外源性给药药物对脑部肿瘤细胞的作用，是衡量其穿透血脑屏障（BBB）能力的指标。然而，由于斑马鱼胚胎的血脑屏障尚未成熟，我们通过建立体外Transwell共培养系统模型，检测TMT的细胞毒性以评估药物穿透血脑屏障的能力。将原代小鼠脑内皮细胞接种于Transwell小室上室，并在胶质干细胞（GSCs）预处理的培养基中培养72小时。随后向上室加入100微摩尔TMT，下室接种胶质干细胞。72小时后，通过活细胞计数检测TMT对胶质干细胞的作用，同时监测跨内皮电阻（TEER）以评估屏障完整性。研究结果表明，胶质干细胞预处理的培养基会降低内皮细胞的完整性，且TMT能够穿透受损的屏障，显著降低胶质母细胞瘤（GBM）胶质干细胞的存活率（下降36%）（图7g）。需要重点说明的是，观察到的屏障完整性降低并非由TMT对脑内皮细胞的毒性作用导致，因为该药物不影响这些细胞的存活率（见补充图S10a、b及补充表S2，如前文所述），而是由预处理培养基中胶质干细胞分泌因子的作用引起，这与先前的研究结果一致。

图6. 氨苯蝶啶的抗肿瘤活性对胶质瘤干细胞的存活率具有选择性影响。a) 来自同一肿瘤（胶质母细胞瘤3、5、19和23号）的胶质瘤干细胞和胶质母细胞瘤分化细胞的浓度-反应曲线。处理48小时后通过MTT法测定细胞活力。数值以未处理细胞为基准进行标准化。曲线显示4株胶质母细胞瘤细胞培养物的平均值±标准差，数据来自n=3次独立的(n=3)次独立实验，每次实验均进行四次平行测定。各株胶质母细胞瘤细胞培养物的单独曲线见补充图S9a。统计显著性指的是分别对GSC和GBM对照组进行区分（单因素方差分析，事后分析采用图基检验）。(**p<0.01)、(***p<0.001)。b) 类干细胞频率（以球体形成能力测定）通过极限稀释分析（ELDA 软件）测得。将 GBM3 胶质瘤干细胞进行梯度稀释后接种至 96 孔板中。箱线图展示了所测频率的中位数及数值范围，相关数据已列于表格中。胶质瘤干细胞的干细胞频率以 1/x 的比值估算，并标注了 95% 置信区间的上下限（其中 1 代表干细胞，x 代表所有细胞）。同时列出了组间比较的卡方分析所得 P 值。c) 对照或 TMT（100 微摩尔，48 小时）处理的 GBM19 胶质瘤干细胞类器官中 Sox2 和 GFAP 表达的代表性图像。细胞核用 DAPI（蓝色）进行复染。单通道图像见补充图 S9b。比例尺 100 微米。d) 3D类器官中类干细胞（Sox2+）和分化细胞（GFAP+）胶质母细胞瘤19细胞的定量分析。数值以(Sox2+)（或GFAP+）细胞与总细胞数（经DAPI染色的细胞核）的比值获得。TMT处理可选择性减少胶质母细胞瘤干细胞类器官的含量，而不影响分化细胞。数据为每组两个独立类器官的6个不同区域的25个Z轴堆叠图像的平均分析结果。(^{*} p<0.05)（非配对t检验）。

氨苯蝶啶390抗肿瘤活性中上皮钠通道抑制或抗叶酸活性的作用

TMT研究最多的分子靶点是上皮钠通道（ENaC）⁶⁰，当该药物作为保钾利尿剂使用时，对其的抑制作用构成了其作用机制。在哺乳动物体内，ENaC由四个同源亚基（α、β、γ和δ）组装而成⁶³。其中，β和δ亚基可调控构成离子传导结构的α和γ-ENaC亚基的通道活性。α-ENaC主要在肾脏、肺和结肠上皮中表达，它与辅助性β和γ亚基结合，参与钠平衡、血容量和血压的调控。δ-ENaC可替代α-ENaC形成功能性通道⁶²，是一种在大脑中广泛分布的变异体⁶³。随后研究发现，δ-ENaC亚基mRNA在某些人类肿瘤细胞（即人黑色素瘤G-361细胞）中也存在过表达现象⁶⁴。

为验证上皮钠通道（ENaC）的调控是否可能参与三甲基锡（TMT）的活性，进而评估氯通道相互作用蛋白1（CLIC1）阻断在三甲基锡抗肿瘤效应中的具体作用，我们首先通过RNA测序检测了本研究所用胶质母细胞瘤干细胞（GSC）培养物中四种上皮钠通道亚基的表达情况。上皮钠通道δ亚基在所有检测的胶质母细胞瘤干细胞培养物中均表现出最高表达，其次为β亚基（尽管其信使核糖核酸（mRNA）含量在不同胶质母细胞瘤中存在差异）（补充图S13A、B为单个肿瘤的数值）。相反，α和γ亚基的表达水平极低。随后，我们用伊西林处理胶质母细胞瘤3型和23型的胶质母细胞瘤干细胞培养物，伊西林是一种可作用于包括δ-上皮钠通道在内的多种离子通道的小分子激动剂⁶⁵。在浓度-反应实验中，我们观察到伊西林在培养48小时后对胶质母细胞瘤干细胞增殖仅有轻微影响（最大反应约为+20%）⁴⁰⁶⁴⁰⁷。

TMT消除了这一效应，且观察到的增殖抑制作用与冰叶菊灵的存在与否无关（补充图S13c、d）。除上皮钠通道（ENaC）外，冰叶菊灵还是其他通道（如瞬时受体电位M8型通道TRPM8）的调节剂；因此，为了确认δ-上皮钠通道（δ-ENaC）在TMT所观察到的抗增殖效应中的微弱作用，我们测试了阿米洛利的活性。阿米洛利是另一种临床应用的上皮钠通道阻滞剂，其特征是亲和力高于TMT（半数抑制浓度处于亚纳摩尔浓度范围内）。66 结果显示，阿米洛利仅在最高测试浓度（100和300微摩尔）下对细胞活力有轻微的降低作用，其效价和效能均显著低于TMT（分别低四倍和两倍，补充图S13e、f）。利用δ-上皮钠通道或氯离子细胞内通道1（CLIC1）下调的胶质瘤干细胞（GSC）进一步验证了这些数据。δ-上皮钠通道表达的降低既不影响胶质瘤干细胞的增殖率，也不影响TMT（100微摩尔）的抗肿瘤疗效，其时间过程曲线（24-72小时）与对照组细胞重合（补充图S14a、b）。另一方面，在来自多形性胶质母细胞瘤3的氯离子细胞内通道1下调的胶质瘤干细胞中评估TMT的疗效时，观察到该药物的效价和效能均显著降低（补充图S14c、d）。具体而言，仅在最高测试浓度（300微摩尔）下才出现显著的增殖抑制，这可能是由于这些细胞中仍存在少量的氯离子细胞内通道1表达（补充图S14c），导致其抗增殖活性无法被完全逆转。

因此，我们提供的证据表明，至少在这些胶质母干细胞培养体系中，δ-上皮钠通道亚基在细胞增殖中发挥的作用极小，这支持了氯细胞离子通道1阻断是三氧化二锑抗胶质母细胞瘤活性关键机制的证据。与这些数据一致，对CGTA数据库的分析（补充图S15）证实，与α亚基相比，δ亚基在正常脑组织和胶质母细胞瘤中的表达水平显著更高，但研究显示，与胶质母细胞瘤相比，δ亚基的最高表达出现在正常组织中（p<0.05），且其表达并未影响胶质母细胞瘤患者的总体生存率。

先前的研究表明，TMT 还可作为抗叶酸剂发挥细胞毒性作用[67,68]。为探究该机制是否也参与 TMT 对人类胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）的活性，我们利用亚叶酸进行了叶酸挽救实验。亚叶酸是叶酸的还原活性形式，无需二氢叶酸还原酶催化即可转化为四氢叶酸，且能绕过对四氢叶酸的抑制作用[69]。我们432的研究结果显示，在亚叶酸（100 微摩尔）存在的情况下，TMT 的细胞毒性仅受到轻微影响，未达到统计学上的显著差异（补充图 S16），这表明至少在 GSCs 中，抗叶酸活性在该药物的抗肿瘤作用中仅起次要作用。

氨苯蝶啶与替莫唑胺协同作用，可损害人类胶质瘤干细胞的存活，并增强替莫唑胺-放疗联合治疗的抗肿瘤效果

为评估替莫唑胺（TMT）作为胶质母细胞瘤（GBM）辅助治疗的潜在价值，我们验证了其作为胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）抗增殖剂的使用是否能与标准药物治疗产生协同作用。因此，我们在GBM 3、19和23样本中分别采用单独使用替莫唑胺（TMT）、单独使用替莫唑胺（TMZ）以及两者联合的方式，构建了浓度-反应曲线在这两种药物中，采用固定比例 TMT:TMZ 3:1（初步测试显示该比例活性最佳）。两种药物均使胶质母细胞瘤干细胞（GSC）培养物的增殖呈剂量依赖性抑制（图8a、表S3），TMT 的半数抑制浓度（IC₅₀）范围为63至78微摩尔，TMZ 则为188至507微摩尔（图8b）。

在所有三种胶质瘤干细胞（GSC）培养体系中，与单独使用两种药物相比，经TMT+替莫唑胺（TMZ）联合处理的细胞相对活性均出现显著下降（图8a、表S3）。通过CompuSyn软件分析的这些数据显示，GBM3和GBM23在抑制率（Fa，即细胞活性抑制比例）达到85%时，联合指数（CI）<1（具有协同作用）；而GBM19在Fa约为40%时，CI<1的协同效应已十分明显（图8c，实际数值见补充图S17）。此外，替莫唑胺的剂量降低指数（DRI）计算值在所有胶质瘤干细胞培养体系中均持续大于1，表明与TMT联用时，替莫唑胺可实现有利的剂量降低（图8d）。TMT的剂量降低指数在GBM3和GBM23的(Fa>85%)条件下大于1，而在GBM19中，(Fa=25%)条件下就已出现该结果（图8e）。因此，TMT与替莫唑胺的联合用药使替莫唑胺的抗肿瘤效力提升了约80倍（以单独使用替莫唑胺与替莫唑胺+TMT联合用药的效力比值(IC 50)计算，图8b），对应的剂量降低指数（DRI）>300（图(DRI >300)，对应图8d）。 在GBM3中，针对TMT与替莫唑胺对球体形成（培养体系中胶质瘤干细胞存在的指标）的协同效应进行评估，也得到了类似结果。在此情况下，其协同作用比增殖实验中更为显著。低浓度的替莫唑胺和TMT（分别为TMT 10微摩尔、替莫唑胺3微摩尔）单独使用时，几乎无法降低胶质瘤干细胞的含量，但二者联合使用则显著减少了胶质瘤干细胞的存在(p>0.001)（p>0.001）。此外，在最高测试浓度（TMT 100微摩尔、替莫唑胺30微摩尔）条件下，培养体系中的胶质瘤干细胞几乎被完全清除（仅剩余1/1500个细胞，图8f）。 重要的是，联合指数的评估结果显示，在所有考察的抑制率（Fa）下均存在协同效应（图8g，实际数值见补充图S17）。这使得替莫唑胺的剂量大幅降低，其剂量降低指数（DRI）达462 (>53)，而TMT的剂量降低指数约为2（图8h）。

相反，TMT 并未使胶质瘤干细胞对辐射敏感，因为在 3-30 微摩尔该药物存在的情况下，未观察到 463 5 或 10 戈瑞辐射引起的细胞死亡出现增强（补充图 S18）。464 另一方面，当我们联合低强度辐射（5 戈瑞）、替莫唑胺（3、10 和 30 微摩尔，单独使用时无细胞毒性，见图 8a）和 TMT（10 和 30 微摩尔）时，辐射诱导的细胞死亡出现了具有统计学意义的显著增加（图 8i）。这些数据进一步明确支持将 TMT 作为胶质母细胞瘤的辅助治疗手段，这一结论也适用于体外模拟“斯图普疗法”的场景，在低剂量辐射和低浓度替莫唑胺治疗条件下，能够显著根除胶质瘤干细胞。

图8 氨苯蝶啶治疗与替莫唑胺诱导的细胞毒性及球体形成抑制具有协同作用，并能增强胶质瘤干细胞辐射依赖性细胞毒性。a) 单药TMT和TMZ处理在胶质瘤干细胞（GBM3、GBM19和GBM23）中以及联合处理（比例3:1）下诱导的细胞毒性浓度-反应曲线。图表X轴显示TMZ和TMT单独处理时的浓度值（微摩尔）（分别为白色和黑色圆圈）。在联合处理中（白色方块），药物浓度指的是[TMT]，其中TMZ以1:3的比例添加到TMT中（实际值为[TMT+TMZ]：3+1；10+3；30+10；100+30 IM）。数值代表(n=3)次独立实验的平均值±标准差。为简洁起见，每个实验点的统计学显著性见补充表S3。b) 图6a所示实验得出的胶质母细胞瘤3、19和23株细胞中TMT、TMX及TMT+TMZ抗增殖活性值。联合使用TMT+TMZ可增强两种药物的效力，与三种胶质母干细胞的联合治疗相比，TMT和TMZ的(IC50)值均显著降低，这一点也证明了这一点。c) 药物组合分析显示，在所分析的三种胶质瘤干细胞中，TMT与TMZ的细胞毒性活性存在协同作用。使用递增浓度的两种药物单独处理细胞，也以3:1的比例进行双药联合处理。采用CompuSyn软件计算组合指数（CI）值，并利用每种胶质瘤干细胞培养中药物组合的固定剂量比联合数据绘制Fa-CI图。红线(Cl=1)和(Cl<1)表示不同效应水平下的协同作用（(Fa=%)为死细胞）。d-e) 药物联合分析显示，在胶质瘤干细胞（GSCs）中联合使用TMT和TMZ时，两种药物的剂量可有利地降低。剂量降低指数（DRI）值通过CompuSyn软件生成，Fa-DRI图则通过固定剂量比联合（3:1）数据生成。(DRI >1) 表明，与单独用药相比，TMT（d）和TMZ（e）与另一种药物联用时，达到特定效应（Fa）所需的剂量出现了有利的倍数降低。红线 (DRI=1)。f) 在 GBM3 培养体系中，通过球体形成实验测定并经 ELDA 定量分析，单药 TMT、单药 TMZ 以及二者联合（比例 3:1，同图 a）诱导胶质瘤干细胞耗竭的浓度-反应曲线。g) 药物联合分析揭示了TMT与TMZ在抑制球体形成能力方面存在协同作用。以3:1的比例对GBM3细胞进行递增浓度的单药及双药联合处理。采用CompuSyn软件计算联合指数（CI）值，并利用每种胶质瘤干细胞（GSC）培养体系中药物联合的固定剂量比联合数据绘制Fa-CI图。红线(Cl=1)、(Cl<1)代表不同效应水平下的协同作用（(Fa=%)为死细胞）。h) 药物联合分析显示，在GBM3培养体系的胶质瘤干细胞耗竭实验中，TMT与TMZ联合使用时可实现有利的剂量降低。采用CompuSyn软件计算剂量降低指数（DRI）值，并利用固定剂量比（3:1）的联合用药数据绘制Fa-DRI曲线图。当与另一种药物联合使用时，DRI＞1 (DRI >1)表明，相较于单独用药，达到特定效应（Fa）所需的TMT（黑点）和TMZ（白点）剂量存在有利的降低倍数。红线 DRI =1)。i) TMT:TMZ 比例为3:1的组合在未处理（对照组）和经5戈瑞照射的培养物（胶质母细胞瘤3型）中的浓度-反应曲线。通过台盼蓝排除法分析细胞数量和活力；数值表示平均值±标准差 (n=2) 平均值±标准差（n=2）。为清晰起见，图中所示的P值均为具有统计学显著性的5Gy照射组细胞与TMT+TMZ处理组细胞在照射后的差异 **p<0.01**，以及(^{* *} p<0.01)和(****p<0.001)。在未照射的细胞中，所有药物组合均显著减少了细胞数量（p<0.001，(p<0.001) 与未处理对照组相比）。对比未照射组和照射组，对照组（p<0.001）、10μM TMT + 3μM TMZ 组（p<0.001）以及 30μM TMT + 10μM TMZ 组（p<0.01）之间存在统计学上的显著差异。而 100μM TMT + 30μM TMZ 处理组在未照射和照射细胞之间的差异未达到统计学显著性（单因素方差分析，Tukey 法和 Dunnett 法事后分析）。

讨论

尽管神经外科和放射治疗取得了重大进展，并且人们对胶质母细胞瘤发生和发展的分子基础有了更深入的了解，但有效的胶质母细胞瘤治疗仍然是一项未被满足的医疗需求。事实上，当前药理学方法的疗效受到其高脑毒性的限制。抗肿瘤药物方面，由于血脑屏障穿透能力低导致靶标积累有限，以及胶质瘤干细胞固有的耐药性。因此，过去几十年里患者的生存期仅得到了极其有限的改善。由此可见，要获得更好的临床疗效，全新的治疗策略势在必行。

在以往的研究中，CLIC1 被确定为从胶质母细胞瘤（GBM）中根除胶质瘤干细胞（GSCs）的潜在创新性分子靶点。25,26,70 这种调控细胞周期进程的通道活性在胶质瘤干细胞中过度活跃，抑制该活性可在体外和体内对胶质母细胞瘤细胞产生抗增殖和抗侵袭的作用。31,71 阻断 CLIC1 是二甲双胍及其他双胍类药物发挥抗肿瘤活性的主要分子机制之一。25,31 然而，鉴于二甲双胍作为抗糖尿病药物的长期使用背景，其药效极低31，且药代动力学和毒理学特性不佳43（例如，它是极性极强的分子，吸收需要主动转运，且在体内大量蓄积时存在乳酸酸中毒的风险）。尽管目前正在研发不同的药理学策略来解决这些问题，但这些特性的结合仍限制了其向临床转化的潜力。因此，本研究的目标是筛选出其他已获批药物，将其重新开发为 CLIC1 抑制剂并应用于胶质母细胞瘤治疗，同时要求这些药物具备更高的药效和更优的药代动力学特性。

基于这一目标，我们采用基于配体的方法，以2,4-二氨基嘧啶的环状骨架为基础，从我们已测试为CLIC1阻滞剂的两种获批含双胍部分药物——二甲双胍和环氯胍的结构出发，对DrugBank数据库进行检索。31 在筛选出的6个命中化合物中，我们选择TMT进行进一步研究，原因在于它是唯一一种在保留环氯胍关键结构元素的同时，具备此前未被探索过的蝶啶骨架的化合物。蝶啶环可被视为延伸的胍基部分，这使得我们能够探索结合位点的全新区域，且有望获得对CLIC1通道具有更高亲和力/效价的新型先导化合物。

TMT于1966年在美国获批作为利尿药物，可抑制肾脏远端小管后期和集合管的肾脏上皮钠通道（ENaC）。因此，TMT能促进轻度钠利尿，同时维持体内钾含量。TMT目前仍被广泛使用，每年处方量超2000万，用于治疗水肿、高血压；且凭借其保钾特性，常与噻嗪类或袢利尿剂联用，以预防低钾血症⁷²。TMT通常耐受性良好，仅报道有轻微副作用（如头晕、疲劳、头痛、口干、高钾血症和脱水）⁷²，因此是一种潜在的优选老药新用制剂，可在胶质母细胞瘤（GBM）治疗中开展试验。此前，仅有两项研究探讨了TMT治疗神经胶质瘤的潜在用途。第一项研究中，TMT的抗增殖活性仅在已建立的细胞系（U251.TR3）等细胞中进行评估，其作用被归因于抗叶酸活性，而该活性仅在DNA错配修复通路缺陷的条件下才有效⁶⁷。第二项研究则对弥漫性内在型胶质瘤基因特征的公开数据库进行了系统性计算分析⁵⁰⁷在对桥脑胶质瘤（弥漫型内生性桥脑胶质瘤，一种侵袭性儿童肿瘤）患者以及经临床可用药物库处理的癌细胞系的研究中，三甲曲沙（TMT）是能够逆转弥漫型内生性桥脑胶质瘤基因特征的候选药物之一73，但它未被选入对其作用进行深入分析的研究。因此，截至目前，尚无关于三甲曲沙在患者来源的胶质瘤干细胞中抗肿瘤作用的相关数据，也缺乏对其涉及的细胞内机制的精准分析，这也支撑了我们开展其作用深入分析的研究决策。

为验证 TMT 可能作为 CLIC1 阻滞剂这一假设，我们在全细胞配置下直接检测了 GSC 中 CLIC1 介导的离子电流。TMT 对该电流的阻断效力显著高于二甲双胍（约 514170 倍）。31 重要的是，我们通过分子对接和分子动力学研究发现，TMT 与二甲双胍在 CLIC1 结构上的结合位点不同：后者的作用依赖于 R29 516 残基，29 而 TMT 除其他相互作用外，还可与一个结合位点结合，该位点与已知的选择性 CLIC1 抑制剂——另一种利尿分子 IAA94 74 在人谷胱甘肽转移酶 P1-1（PDB：6Y1E）中被提出的结合位点重叠，同时也与 NSC602247 的结合位点重合。NSC602247 是一种能稳定 CLIC1 二聚还原形式、从而阻止其膜插入的分子。56 从实验角度来看，计算机模拟分析与电生理实验结果相关，在表达R29A CLIC1突变体的GSC培养物中，TMT能够像IAA94一样阻断通道活性，而二甲双胍则不能。522 有趣的是，我们鉴定出的TMT与CLIC1的潜在相互作用位点或许可以解释TMT的抑制活性。事实上，这些位点位于蛋白质中赋予CLIC1高柔性的区域，而高柔性是CLIC1作为离子通道插入细胞膜的先决条件。523 因此，TMT与1-4号位点结合可通过硬化CLIC1的整体结构，阻止其膜转位和离子通道活性，同时还能稳定CLIC1的二聚体可溶性形式，这与NSC602247的实验观察结果一致。

事实上，荧光强度实验表明，TMT 能以瞬时的方式有效减少 CLIC1 的膜插入。此外，本研究还将计算机模拟分析拓展至氧化型 CLIC1，与还原型相比，氧化型 CLIC1 的 N 端结构域存在显著的构象变化，表现为β-折叠向α-螺旋的转变，同时在 Cys24 与 Cys59 之间形成了分子内二硫键。这种结构重排使得一个较大的疏水表面暴露出来，该区域是 CLIC1 膜插入的潜在对接位点。研究发现，TMT 还能在氧化型 CLIC1 的 N 端与 C 端结构域界面处稳定结合。根据荧光共振能量转移（FRET）研究的结果，CLIC1 在膜插入过程中会发生显著的结构重排，其 N 端会远离 C 端结构域，形成一段延伸的跨膜螺旋。基于此，TMT 可作为 N 端与 C 端结构域之间的“粘合剂”，阻碍 CLIC1 正确的膜折叠。综合来看，计算机模拟与实验数据共同揭示了 TMT 的双重分子作用机制：该药物既能抑制 CLIC1 的膜插入，也能干扰其正确的通道折叠和/或功能，从而在跨膜型 CLIC1（tmCLIC1）上发挥直接的通道阻断作用。为了验证 TMT 是否通过直接干扰 tmCLIC1 通道活性来实现电流抑制，我们开展了单通道实验电生理实验。事实上，我们发现TMT通过缩短单通道开放时间，降低了单通道水平的通道电导（图2L）。开放概率逐渐降低，这可能是由于TMT与tmCLIC1复合物的亲和力较低。另外，也有可能推测TMT与一种未知的膜受体相互作用，产生细胞质第二信使，从而在膜的内侧抑制CLIC1通道。然而，由于以下几个原因，这第二种假设的可能性较低。在Outside-out模式下，电极内液会冲洗膜的细胞质侧，清除细胞质环境。因此，在膜内侧附近存在第二信使的可能性极低。此外，目前没有证据表明第二信使能调控CLIC1电流。最后，通道被抑制后，TMT的洗脱可恢复tmCLIC1的电导。

尽管本研究未就TMT抑制CLIC1活性的精确分子机制提供确凿证据，但研究结果支持两个非互斥的假设，即TMT可同时靶向CLIC1的可溶性形式与膜结合形式。由于缺乏膜结合形式的高分辨率数据，无法开展原子级结构研究；但针对可溶性形式开展的计算机模拟结果，确定了TMT在该蛋白还原态与氧化态上的关键结合位点，其中氧化态对应的α构象转变同样发生于细胞膜上。上述发现结合实验数据表明，TMT可通过降低膜相关CLIC1的表达发挥作用，可能稳定可溶性胞质二聚体形式，并在单通道Outside-out记录中阻断tmCLIC1通道活性，提示其与通道胞外侧存在直接相互作用。综上，这些观察结果支持TMT通过多种机制抑制CLIC1的假设，其作用既发生于胞质内，也存在于细胞表面。

TMT 对 CLIC1 的阻断严重影响了胶质瘤干细胞（GSC）的生物学特性，通过使细胞周期在 G1/S 转换期停滞来降低其增殖能力。这一效应在体外多种药理学特征高度相似的二维胶质瘤干细胞培养体系中均被观察到，证明了该药物对这类肿瘤细胞具有普遍活性；同时在更真实模拟胶质母细胞瘤（GBM）细胞间及细胞与基质间相互作用的三维培养体系中，以及在斑马鱼胚胎原位胶质母细胞瘤模型的体内实验中也得到了验证。在斑马鱼模型中，将 TMT 加入养鱼水中，其在中枢神经系统（CNS）的药物浓度接近其作为胶质瘤干细胞抗肿瘤剂的有效浓度（约 70 微摩尔）。然而，斑马鱼幼鱼阶段的血脑屏障（BBB）尚未发育成熟。因此，为进一步证实 TMT 能在脑部达到药理有效浓度，我们通过实验证明：在 transwell 系统中，当药物施加于上室时，TMT 可诱导显著的胶质瘤干细胞毒性，该系统中含细胞的下室与上室之间由原代脑内皮细胞构成的人工血脑屏障分隔。此外，TMT 处理几乎完全消除了三维胶质瘤干细胞体外侵袭细胞外基质（ECM）的能力，这一效应与增殖抑制无关，因为在不影响细胞增殖的短时间处理（15 小时）中即可观察到该现象。相反，来自胶质母细胞瘤 39 株（一种自发缺失 CLIC1 表达的肿瘤）的三维胶质瘤干细胞培养物，尽管增殖速率与表达 CLIC1 的肿瘤相似，但其侵袭性却有所降低。

活性方面，正如预期的那样，TMT 既未影响细胞增殖也未影响细胞侵袭。这一观察结果与近期研究一致，这些研究认为 CLIC1 在胶质母细胞瘤细胞迁移和上皮-间质转化中发挥相关作用75。与电生理结果一致，所有这些效应的发生浓度均比我们此前报道的二甲双胍浓度低100倍以上，这证明了 TMT 抗胶质母细胞瘤活性的高效能。另一方面，仅在高得多的浓度下才观察到 TMT 对正常脑细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞和脑源性内皮细胞）产生体外毒性作用，其选择性为(index <100)，从而证实了该药物用于胶质母细胞瘤治疗的潜在安全性。TMT 的另一个重要特征是其根除胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）的强大能力，通过极限稀释分析（ELDA）评估，胶质母细胞瘤干细胞在培养物中呈剂量依赖性减少。如今，胶质母细胞瘤干细胞根除被认为是胶质母细胞瘤药物干预的关键结果，旨在预防复发，而复发确实主要由胶质母细胞瘤干细胞的化疗和放疗耐药性引起9,76。重要的是，我们在三维（3D）培养中观察到的选择性反应有力地支持了 CLIC1 是 TMT 抗肿瘤活性的分子靶点，因为 CLIC1 在类干细胞胶质母细胞瘤细胞群中具有组成型活性，而在分化细胞群中则无此活性29。此外，TMT 作为 CLIC1 阻滞剂在体内和体外的抗肿瘤活性均优于二甲双胍，进一步支持了该药物有望被重新定位为抗肿瘤药物的潜力。

因此，我们提出**TMT**可能是治疗**胶质母细胞瘤（GBM）**的一种相关辅助手段。在这一视角下，我们观察到**TMT**与**替莫唑胺（TMZ）**具有协同作用，而替莫唑胺是目前胶质母细胞瘤患者手术联合放疗时所用的药物。研究表明，两种药物联合使用（我们发现**TMT:TMZ**比例为3:1时效果最佳）不仅能增强替莫唑胺的抗肿瘤疗效，还能在**TMT**存在的情况下，通过将替莫唑胺剂量降低200倍以上来阻止**胶质母细胞瘤干细胞（GSC）**的增殖。我们推测，**TMT**对胶质母细胞瘤干细胞的选择性损伤作用，可与替莫唑胺对其他胶质母细胞瘤细胞亚群的活性形成互补，从而产生更全面的抗肿瘤效果。因此，这种药物组合不仅能使患者对药物治疗产生更好的临床反应，还能通过降低替莫唑胺的所需剂量来提升药物安全性，减少**化疗脑**的发生风险。77 当将放疗与替莫唑胺化疗联合使用以复现胶质母细胞瘤的当前标准体外治疗方案时，这一效应也同样显著。在这些实验中我们发现，即使采用两种治疗手段的低剂量联合方案，当在亚最大浓度**TMT**存在的情况下进行治疗时，细胞毒性也会大幅增强。

鉴于TMT在胶质母细胞瘤（GBM）治疗中潜在的重新用途，我们考虑了除阻断CLIC1之外的其他机制可能对其抗肿瘤活性有贡献的可能性。TMT作为利尿药物的主要靶点是肾脏中的α-上皮钠通道（α-ENaC）。然而，我们通过转录组分析证实，编码该通道的基因（SCNN1A）在多种胶质瘤干细胞（GSC）培养物中呈低水平表达，而中枢神经系统特异性的δ-上皮钠通道（δ-ENaC）是这些细胞中的主要亚型。尽管目前尚无关于TMT对δ-ENaC作用的数据，但该通道可被另一种临床使用的保钾利尿剂阿米洛利阻断，且由于TMT与阿米洛利以相同机制与610号α-ENaC相互作用⁶⁰，因此其对该通道在中枢神经系统高丰度表达的亚型也可能产生作用。为此，我们同时采用药理学和分子生物学手段，探究δ-ENaC⁶¹¹在TMT抗胶质母细胞瘤（GBM）活性中的作用。首先，使用δ-ENaC药理学激活剂伊立克林处理后，我们未观察到胶质瘤干细胞（GSC）增殖出现显著增加，且无论是否添加该药物，TMT的作用效果均无明显差异。此外，尽管阿米洛利与ENaC的结合亲和力高于TMT⁶⁶，但其对GSC增殖仅产生轻微影响，抑制增殖的程度弱于TMT，且仅在测试的最高浓度下才表现出抑制作用。最后，敲低GSC中的δ-ENaC并未影响TMT对细胞增殖的抑制作用，而下调CLIC1的表达则显著降低了TMT的抗肿瘤效力与效能。因此，尽管我们无法完全排除抑制GSC的δ-ENaC在TMT作用中发挥有限作用的可能性，但我们的数据支持这一结论：δ-ENaC并非TMT在GBM细胞中的主要作用靶点。CGTA数据库分析也证实了我们的实验结果，因为δ-ENaC的表达水平并不会改变GBM患者的总生存期。有研究报道TMT还具有抗叶酸活性⁶⁷,⁶⁸，本研究表明该机制仅轻微参与TMT对GSC的抗肿瘤作用。值得注意的是，通过计算机模拟研究发现TMT是c-Met和VEGFR-2的潜在双重抑制剂，可能与这两种蛋白均存在结合作用⁷⁹。鉴于c-Met和VEGFR-2均参与GBM的发生发展，若该作用在生物学研究中得到证实，可能成为TMT发挥抗GBM作用的额外机制。总体而言，本研究有力支持了最初的假设：TMT主要通过抑制GSC的增殖与侵袭性，以CLIC1阻滞剂的身份发挥抗肿瘤作用。具体而言，本研究从生物信息学分析和计算机模拟研究出发，通过电生理学和细胞生物学实验，验证了TMT用于治疗GBM的潜在重定位价值。尽管如此，其他机制也可能至少部分参与了该药物对GSC的整体作用。

综上所述，我们确定TMT是一种具有潜力的重新定位药物，能够干扰胶质瘤干细胞（GSC）的生物学特性。TMT与替莫唑胺（TMZ）的抗肿瘤活性具有协同作用，加之其已知且安全性良好的药理特性，使我们建议将其作为胶质母细胞瘤（GBM）的潜在辅助治疗药物。此外，对TMT阻断氯离子细胞内通道1（CLIC1）致瘤活性能力的表征，也可能为开发具有更高抗胶质母细胞瘤疗效和效力的其他衍生物铺平道路。

材料与方法

药物

氨苯蝶啶（TMT）、替莫唑胺（TMZ）、冰叶灵和阿米洛利购自西格玛奥德里奇公司（意大利米兰 638 号），储备液分别以二甲基亚砜（DMSO）配制为 10 mM、100 mM 和 30 mM 的浓度。向对照组样品中加入相应量的稀释二甲基亚砜。亚叶酸购自德国达姆施塔特默克公司（Merck），并以 200 mM 的储备液浓度溶解于 (dH_{2} O) 中。tmCLIC1omab® 抗体是我们研发的定制化专利抗体，针对的是其 C 端最后 20 个氨基酸。在蛋白质的N端（国际公开号WO 2022/112486 A1）。27 通过与该区域相互作用，tmCLIC1omab®识别tmCLIC1的氨基端，该氨基端位于tmCLIC1的胞外部分。

胶质母细胞瘤患者的特征

在获得患者知情同意以及机构伦理委员会批准（意大利利古里亚大区伦理委员会，登记号360/2019）后，从意大利热那亚市大都会综合医院神经外科获取胶质母细胞瘤（GBM）标本。除GBM24为原发肿瘤复发样本外，其余所有患者均为首次接受手术，且未接受过化疗或放疗。根据世界卫生组织（WHO）标准，这些患者的肿瘤均被归类为4级胶质瘤（样本编号：(n=7)；其中女性2例、男性5例，年龄范围40至78岁，平均年龄58岁），患者与肿瘤的临床特征详见补充表S1。

胶质干细胞的分离与培养

2D 胶质瘤干细胞（GSC）培养：患者来源的胶质母细胞瘤（GBM）原代细胞培养物按此前详细描述的方法进行分离和鉴定，并在无血清培养基中体外培养维持，该培养基为1:1比例的DMEM-F12/Neurobasal™ 混合培养基（意大利米兰的EuroClone/意大利蒙扎的Gibco-ThermoFisher Scientific）、B27™ 添加剂（Gibco-ThermoFisher Scientific）、2 mM L-谷氨酰胺（EuroClone）、1% 青霉素-链霉素（EuroClone）、2 μg/ml 肝素（Sigma-Aldrich）、重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，10 ng/ml；意大利博洛尼亚的Miltenyi Biotec）以及表皮生长因子（EGF，20 ng/ml；Miltenyi Biotec）。在上述条件下，细胞在2周内形成悬浮的肿瘤球；为开展可行且可靠的实验，将细胞接种于涂有1:200比例生长因子减少型Matrigel™（Corning，ThermoFisher Scientific）的培养瓶中以单层形式培养，此举可确保细胞维持干细胞标志物表达、成球能力、分化潜能及致瘤性。此前的研究通过将10000个细胞原位接种到6-8周龄非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内构建异种移植模型，证实了这些细胞的肿瘤起始活性（补充表S1）。所有培养物均在第代内使用。

GSC 分化：将细胞置于添加了 10% 胎牛血清（FBS）、2 毫摩尔 L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素（均购自 EuroClone 公司）的 DMEM-F12 培养基中转移培养 2 周，具体操作如先前报道所述⁴¹。

3D 胶质瘤干细胞（GSC）培养：3D 胶质瘤干细胞类器官的制备方法参考已发表的研究。83 简要步骤如下：将 2500 个细胞重悬于冰浴的基质胶（Matrigel™）中，接种到 parafilm 膜模具的 15 微升液滴中，于 37 摄氏度下孵育 30 分钟。将液滴从模具中取出，转移至含完全培养基的 24 孔板中，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳环境中培养。持续监测类器官形态，直至形成致密聚集体（约 7-10 天）。将类器官置于室温下，用 1% 多聚甲醛固定 15 分钟，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。在经 0.1%  Triton X-100 室温孵育 20 分钟透化、再用 10% 正常山羊血清室温封闭 2 小时的样本中，通过与兔抗 Sox2 抗体（Cell Signalling 货号 #23064S，批号 1）或鼠抗抗GFAP抗体（Cell Signalling #3670S，批号9）。随后，类器官在PBS中洗涤4次，每次1.5小时，并与二抗AlexaFluor-568（赛默飞世尔科技 # A-11011，批号677 1558746）和AlexaFluor-647（赛默飞世尔科技 # A-21235，批号2119153）于676℃孵育过夜。为清晰起见，在678幅图中，AlexaFluor-647荧光被转换为伪彩色。在PBS中进一步洗涤4次（每次679分钟90分钟）后，使用ECLIPSE Ti2-E倒置共聚焦显微镜（尼康）拍摄荧光图像。

使用THUNDER Imager 3D Assay（徕卡）和ImageJ软件对每种蛋白以及经DAPI染色的细胞核的阳性细胞数进行计数。

(Clic1 1^{-1}) 及 δ ENaC 突变体的构建：通过 CRISPR-Cas9 技术构建了 (Clic1 1^{-1-}) 突变体。简要来说，将靶向 Clic1 编码序列的 transEDIT 慢病毒 gRNA 与 Cas9 慢病毒表达载体（pCLIP-102 All-hCMV-ZsGreen V66，Transomic）共转染患者来源的神经胶质瘤干细胞（GSCs）(TGAGTGCCCCTATACCTGGG)，以及一个靶向绿色荧光蛋白（GFP）基因的阴性对照。δ-上皮钠通道（δ-ENaC）的沉默采用市售的短发夹RNA（shRNA）质粒库（圣塔克鲁兹生物技术公司，sc-42421-sh），并设置非靶向对照。细胞在约70%汇合度时使用TurboFect转染试剂688（赛默飞世尔科技公司），按照制造商的说明进行转染。转染后24-48小时启动嘌呤霉素筛选，建立稳定的细胞689群体。shRNA序列可从制造商处获取。通过蛋白质印迹法检测氯细胞通道1（CLIC1）的表达（使用抗CLIC1抗体356.1，圣塔克鲁兹生物技术公司），并通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测δ-ENaC的表达（使用shRNA质粒附带的引物，圣塔克鲁兹生物技术公司），以此评估基因的下调情况。

在(Clic1 1^{-1 /-})突变细胞中进行R29A敲入：如前文所述，将CLIC1R29A-pIRES2-EGFP质粒转染至Clic1-/-突变细胞中，以挽救(Clic ^{-1-})细胞。27

儿童低级胶质瘤细胞培养

Res186：细胞从一名3岁女性儿童患有的毛细胞型星形细胞瘤（WHO 1级）中分离获得。697 Res259：细胞从一名4岁女性儿童患有的星形细胞瘤（WHO 2级）中分离获得。84 698

两种细胞系均由意大利帕维亚大学的 S. Comincini 教授惠赠，并按照上述描述进行培养。

非肿瘤细胞培养

从意大利热那亚国际福音医院妇产科剖宫产术后立即收集足月产妇的人脐带（uc，702 n=2），此前已获得703名受试者的知情同意并经机构伦理委员会批准（登记号2/2010）。按照已有报道85的方法分离脐带间充质704干细胞（ucMSCs），将其置于间充质干细胞专用培养基RS™（Gibco-ThermoFisher 705 Scientific）中培养，并依据国际细胞治疗协会标准86，通过流式细胞术（MSC 表型分析试剂盒，Miltenyi Biotec）对细胞进行鉴定。ucMSCs在第10代707内使用，对应编号(10th)。

MO3.13 人少突胶质细胞系是通过将 708 人横纹肌肉瘤 RD 细胞的 6-硫鸟嘌呤抗性突变株与成人少突胶质细胞融合构建而成，获得了一株永生化的人-人杂交细胞系，该细胞系保留原代少突胶质细胞的表型特征。87 MO3.13 细胞购自加拿大安大略省伯灵顿市的 Cedarlanelabs 公司，在添加了 10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素（均购自 EuroClone 公司）的 DMEM 培养基中培养。实验前，将培养基更换为低胎牛血清浓度（0.1%）的培养基，并加入 100 纳摩尔佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯。细胞在第 (15th) 代内使用。

SVG-A 人星形胶质细胞是从人类胎儿715号脑组织中分离的星形胶质细胞系SVG的星形胶质亚克隆细胞，通过SV40大T抗原表达实现永生化。88 SVG-A细胞购自英国伦敦的Ximbio公司，在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺以及1%青霉素-链霉素（均购自EuroClone公司）的DMEM培养基中培养。这些细胞在(15th)代内使用。

HBEC-5i细胞是从人类大脑皮层中分离得到的脑微血管内皮细胞系，通过SV40转化实现永生化。该细胞购自美国弗吉尼亚州马纳萨斯市的ATTC公司。细胞在添加40微克/毫升内皮细胞生长补充剂（ECGS，康宁公司）和10%胎牛血清（FBS）的DMEM:F12培养基中培养，且在指定传代范围内使用。

电生理学

全细胞记录：膜片钳电极（带灯丝的GB150F-8P，德国霍夫海姆科学产品公司，邮编724）通过硼硅酸盐硬质玻璃在布朗-弗莱明P-87拉制仪（美国加利福尼亚州诺瓦托市萨特仪器公司，邮编725）上拉制而成，并经火抛光处理，尖端直径达1–1.5微米，电阻为5–7兆欧。膜片钳电生理实验采用穿孔膜片全细胞配置，如已有报道31所述。在全细胞膜片钳实验中，电压方案为每10秒施加一次从-40毫伏到+60毫伏的800毫秒脉冲；在时间进程实验中，每5秒施加一次持续800毫秒的60毫伏去极化电压阶跃。膜电流稳定5分钟后，向细胞灌流测试化合物。在两种实验条件下，电流振幅均测量为700至750毫秒区间的迹线平均值。

膜片钳溶液：– 浴液（毫摩尔/升）：140 氯化钠、5 氯化钾、10 羟乙基哌嗪乙磺酸、1 氯化镁、2 氯化钙、5 D-葡萄糖，pH 7.33–7.4；– 电极内液（毫摩尔/升）：135 氯化钾、10 羟乙基哌嗪乙磺酸、10 氯化钠、1 氯化镁、2 氯化钙、5 D-葡萄糖，pH 7.4。

单通道记录：采用膜片钳技术在735外侧向外构型（Axopatch 200B，美国加利福尼亚州分子设备公司）记录tmCLIC1的单通道事件。在该构型下，膜的外侧持续暴露于外部溶液（含或不含100微摩尔TMT），通过快速溶液递送系统（法国Biologique公司）进行灌流。外部溶液（毫摩尔/升）：145氯化钠、4氯化钾、1.8氯化钙、0.5氯化镁、10羟乙基哌嗪乙磺酸、10葡萄糖，pH值7.4。电极溶液（毫摩尔/升）：120天冬氨酸钾、20氯化钾、2氯化镁、1乙二醇双四乙酸、0.1氯化钙，pH值6.9。740

计算方法

为在 DrugBank 数据库中进行检索，研究人员设定分子量截止值为300、相似度阈值为0.7作为筛选标准，将检索范围限定于已获批药物，以确保这些结果能最大程度应用于临床。配体的初始几何结构通过UCSF Chimera软件90构建，随后在AM1半经验水平上进行初始能量最小化（EM）。接着，利用GAMESS软件91在Hartree-Fock水平结合STO-3G基组对分子进行全优化，并通过HF/6-31G*/STO-3G单点计算，采用RESP方法92推导原子部分电荷。分子对接研究基于已发表的方案94，使用AUTODOCK 4.2软件93开展。可溶性形式CLIC1的晶体结构（PDB编号：1K0M、1K0N、7FBQ和1RK4）与配体通过AutoDock Tools（ADT）1.5.6rc (1.5.6rc1 ^{93})工具包处理，合并非极性氢原子并计算Gasteiger电荷。对接评估中使用间距为(0.375 AA)的0.375埃多个网格：1）针对1K0M结构，采用盲对接策略，以结合位点NSC602247为中心设置1个60×60×60点的网格，并均匀分布4个120×90×90点的网格以覆盖整个蛋白表面；2）针对1K0N结构，以谷胱甘肽结合位点为中心设置100×100×60点的网格；3）针对7FBQ结构，以二聚化界面为中心设置80×80×90点的网格；4）针对1RK4结构，分别为单体氧化型和二聚体氧化型设置80×100×100点和90×90×90点的网格，均以二聚化界面为中心。每次对接运行后，根据结合能最优值和聚类群体选取代表性对接构象。代表性复合物补加所有氢原子后进行能量最小化，再利用Amber20软件包95的pmemd.cuda模块进行分子动力学（MD）模拟，蛋白采用ff14SB力场，配体采用gaff2参数。对于1K0N结构对接复合物的能量最小化和分子动力学模拟，采用已报道的谷胱甘肽与蛋白共价结合的参数96。为在溶剂中进行分子动力学模拟，将蛋白置于TIP3P水周期性盒子中，溶质原子与盒子表面的最小距离为(10 AA)，使用AmberTools20软件包的tleap模块构建体系。随后添加反离子中和体系，并按照已发表的方案94进行能量最小化和分子动力学模拟。生产性分子动力学模拟在恒温（300开尔文）、恒压（1标准大气压）条件下进行，时长1至2.5微秒，时间步长为2飞秒。利用Amber20软件包的Cpptraj模块完成分子动力学轨迹分析，同时使用UCSF Chimera软件绘制相关图表。

荧光强度测定 770

771 细胞悬液（1 ×10^{6} cells/well）在冰上于磷酸盐缓冲液/2.5%牛血清白蛋白（BSA）中孵育30分钟。向样品中加入与Alexa Fluor 555偶联的抗CLIC1抗体，在冰上孵育2小时。772 样品洗涤三次后分配至黑色96孔板中。使用773Ensight 多模式读板仪（珀金埃尔默）。27 经 774 tmCLIC1omab®（3.5 微克/毫升）孵育的样品，其荧光强度值与 tmCLIC1 成正比，并以各自的空白对照进行归一化处理。775 776

细胞增殖与放射毒性测定

MTT 检测法：采用 MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，西格玛-奥尔德里奇公司）四唑还原法检测细胞活力。将胶质瘤干细胞以每孔2500个细胞的浓度接种于96孔板中。用待测化合物处理48小时后，向细胞中加入MTT底物（2.5毫克/毫升，磷酸盐缓冲液中），孵育2小时。形成的甲臜晶体数量在溶于二甲基亚砜（西格玛-奥尔德里奇公司）后，通过使用伯腾ELx800微孔板读数仪在570纳米波长下记录吸光度进行测定。

活细胞计数：采用台盼蓝排除法评估对照组和处理组胶质瘤干细胞（GSCs）的增殖速率及活细胞百分比。将胶质瘤干细胞（100,000 个细胞/孔）接种于6孔板中，24小时后加入TMT处理，继续培养48-72小时。使用TC-20™自动细胞计数器（美国伯乐实验室，意大利米兰分部），在0.4% w/v台盼蓝（美国伯乐实验室，意大利米兰分部）存在的条件下对活细胞进行计数，结果以活细胞数占总计数细胞数的百分比表示。

通过活细胞延时成像进行细胞生长测定：采用Incucyte®活细胞分析系统，基于无重叠的789相衬对比度图像进行细胞汇合度测量，以此分析TMT的作用效果。将细胞接种于790 96孔微孔板中，于37℃条件下培养过夜，随后用系列稀释的TMT进行处理。在长达5792793天的时间进程实验中，使用Incucyte® SX5（Essen BioScience）获取并分析活细胞图像。细胞增殖以处理组培养物的汇合度百分比表示，以对照组为基准进行归一化。通过Incucyte 2023A专用分析软件拟合剂量反应曲线，计算出IC50值。剂量反应曲线基于每张图像的细胞计数比率生成，并以时间0点的计数为基准进行归一化。每孔每6小时采集4张图像，每个条件至少设置3次技术重复。

基于DNA合成的细胞增殖检测（5-EdU掺入法）：5-EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）是一种荧光探针，可掺入增殖细胞的DNA中，随后按照制造商的方案，使用Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒（Invitrogen）即可对其进行检测。使用 Zoe™ 细胞成像仪（伯乐实验室）在二维培养物中进行检测，使用 ECLIPSE Ti2E 倒置共聚焦显微镜（尼康）以及 THUNDER 三维成像分析仪在三维培养物中进行检测，并使用 ImageJ 软件测定荧光强度。30

细胞周期分析：按照制造商的方案，使用 Cell-Clock™ 细胞周期检测试剂盒（BioColor 有限公司）检测活细胞中处于不同细胞周期时相的细胞比例。氧化还原染料被 805 细胞摄取后，会呈现出与细胞周期不同时相细胞相关的鲜明颜色：G0-G1 期为浅黄色，S 期为绿色，806以及G2-M期（深蓝色）。通过ImageJ软件对显微照片进行分析，计算出不同时期细胞所占的百分比。

辐射诱导的细胞毒性：将GBM3胶质瘤干细胞在15毫升离心管中以悬浮状态，使用型号为(^{137} Cs)的IBL437C辐射仪（法国CIS Bio International公司）在室温下进行5戈瑞的辐照处理。随后将对照组和辐照组细胞接种于6孔板中（每孔(2x10)个细胞），并分别以10+3、30+10和100+30微摩尔的浓度组合使用TMT和替莫唑胺进行处理。48小时后，通过台盼蓝排除法检测对照组和辐照组样本中的活细胞数量。

极限稀释分析法（ELDA）

ELDA 检测神经胶质瘤干细胞（GSCs）的自我更新能力，以此估算培养体系中干细胞样细胞的频率。将815个神经胶质瘤干细胞以不同细胞浓度（每孔1至250个细胞，至少设置8个重复孔）接种于96孔板中。当神经胶质瘤干细胞在接种10天后形成球体并表现出自我更新活性时，判定该孔为阳性。研究结果使用免费软件 http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/ 进行分析和绘图。

3D 侵袭实验

将胶质干细胞在不含基质胶的完全培养基中培养7天，以生成球体。将球体包埋在80%基质胶和20%培养基中，接种于60毫米培养皿底部。基质胶聚合后，加入培养基（记为T0时间点），将球体培养15小时（T15时间点）。由于此时间段内细胞增殖极少，我们排除了不同胶质干细胞培养体系中药物诱导的增殖率变化可能对侵袭行为产生干扰的情况。使用安装在透射光显微镜DM IL（徕卡，意大利米兰）上的ICC50 HD数码相机（徕卡，意大利米兰）拍摄T0和T15时间点的照片。通过ImageJ软件计算细胞离开球体的侵袭总面积，对侵袭能力进行定量分析。计算各实验条件下T15与T0时间点平均面积的差值，并以载体处理组对照组的百分比表示。

体外血脑屏障（BBB）穿透实验

鼠脑内皮细胞分离：体外血脑屏障模型采用原代鼠内皮831细胞构建。根据当地实验动物伦理委员会/兽医建议对小鼠实施安乐死。立即取出大脑并转移至解剖缓冲液中：含100单位/升青霉素/链霉素（青/链霉素）、2%胎牛血清（FBS）及10毫摩尔/升羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。为去除脑膜和毛细血管碎片，将半侧大脑在预先喷洒乙醇（EtOH）并置于紫外线下的3M滤纸上滚动。解剖过程中，用无菌剪刀剪碎大脑半球。将悬液在室温（RT）下以1200转/分钟离心5分钟。沉淀重悬于5毫升添加了V型胶原酶/分散酶（1:100）和脱氧核糖核酸酶（1:200）的解剖缓冲液中（消化缓冲液）。将悬液置于加热模块中，在37℃下温和振荡孵育30分钟。两次。随后将悬液反复通过19G蝶形针数次，再于室温下以839倍相对离心力离心5分钟。弃去上清液，向沉淀中加入5毫升22%（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA），840再次于4℃下以3000转/分钟离心15分钟以去除髓鞘。将沉淀重悬于841内皮细胞生长培养基（EGM）中，该培养基由内皮细胞基础培养基-2（EBM-2，Lonza Clonetics公司）、842内皮细胞生长因子™-2单克隆培养基试剂盒（Lonza Clonetics公司）、胎牛血清（Euroclone公司）和100单位/升青链霉素（Pen/Strep，赛默飞世尔科技公司）组成，并添加了嘌呤霉素（5微克/毫升）。重复离心三次以确保收集到所有残留的内皮细胞。每次均将沉淀重悬于EGM中。含嘌呤霉素的EGM每24小时更换一次，持续72小时。

跨内皮电阻（TEER）测定：在体外模型中使用鼠脑内皮细胞评估血脑屏障（BBB）的完整性。将细胞接种于Transwell小室（ThinCert细胞培养插入式培养皿，葛兰素史克生物-one公司）的上室，该小室预先用纤连蛋白（储备液1毫克/毫升，在磷酸盐缓冲液[PBS]中100倍稀释，浓度为1微克/平方厘米）包被，培养于仅含内皮细胞生长培养基（EGM）的培养基或含100微摩尔TMT的培养基中。每24小时测定一次TEER值，以评估内皮细胞层的完整性。TEER测定使用“上皮伏欧计手动”设备（德国弗里德贝格世界精密仪器公司）进行。

TMT 对血脑屏障的穿透实验：将 100 微摩尔的 TMT 加入含脑内皮细胞的 transwell 板的上室，72 小时后通过活细胞计数评估其对接种在下室的胶质瘤干细胞的影响。

补充图S19展示了整个实验方案的示意图。

斑马鱼异种移植

鱼类养殖与胚胎制备：斑马鱼（Danio rerio）成鱼由德国卡尔斯鲁厄理工学院欧洲斑马鱼资源中心（EZRC-KIT）提供，依据意大利第26/2014号法令（国家层面）以及欧盟2010/63号和86/609号指令（欧洲层面）的动物福利法规，按照标准方法进行养殖和维持。使用成熟斑马鱼的繁殖种群进行产卵：将雄性和雌性斑马鱼以2:1的比例饲养在水箱中，环境条件为26±1摄氏度、14小时光照/10小时黑暗周期。光照诱导后30分钟内完成产卵与受精。受精后4-5小时（hpf），收集胚胎并用培养基冲洗以去除卵表面残留物，选取健康胚胎用于后续实验。在胚胎检测的时间节点120小时受精后（hpf），依据意大利法律（意大利第26/2014号法令），该实验不被视为动物实验。

患者来源的神经胶质瘤干细胞原位异种移植：24小时受精后，将野生型斑马鱼胚胎浸泡在含0.2毫摩尔1-苯基-2-硫脲的胚胎培养基中，于28.5摄氏度下继续培养24小时。48小时受精后，对870枚胚胎进行去卵膜处理，并在注射前用0.0003%的三卡因进行麻醉。将麻醉后的871枚胚胎放置在1%的湿琼脂糖垫上。向每枚胚胎的后脑注射872使用 Eppendorf 873 FemtoJet 显微注射器，将约 150–200 个预先用荧光探针 ZsGreen 标记的细胞注射到胚胎中，操作过程在体视显微镜（徕卡 MZ APO）下观察。移植后，将胚胎 874 置于 32 °C 培养 4 小时，并通过检测正确位置的荧光细胞进行筛选。随后的几天，将胚胎在新鲜培养基中于 32 °C 培养。处理实验时，将筛选出的 876 个胚胎转移至 48 孔板中，于 32 °C 培养，孔板中含有溶解在养鱼水中的测试化合物。受精后第五天（即异种移植后第 3 天），拍摄肿瘤图像，使用 ImageJ 软件计算相对积分密度（即荧光强度与肿瘤体积面积的乘积），以最终与初始肿瘤积分密度的比值作为结果。30

斑马鱼头部氨苯蝶啶浓度的测定

组织制备：TMT处理组（在鱼水中以100微摩尔浓度处理2天）和对照组均包含40条斑马鱼幼鱼头，经离心后，在50微升去离子水中匀浆2分钟。为制备校准曲线的基质，共取600条6天龄的斑马鱼幼鱼，在1.5毫升去离子水中匀浆（40条幼鱼置于100微升水中）。

样品校准：在甲醇中配制2 mM TMT储备液，于水中进行梯度稀释，将其加入斑马鱼幼虫匀浆中，制备浓度范围为12.5-100 μM的校准标准品（CS）。取20 μL校准标准品与匀浆样品，加入50 μL乙腈，剧烈涡旋混合1分钟，随后以10000倍重力加速度离心10分钟。取上清液注入高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）系统。

色谱条件：色谱分离按照经过验证的方法进行，100 并进行了小幅修改。简要来说，取 10 微升等分试样注入高效液相色谱系统（赛默飞世尔科技 Ultimate 3000 高效液相色谱系统，美国），由 0.03 摩尔/升磷酸（pH 2.3）缓冲液与乙腈组成的流动相（体积比 85:15）等度洗脱。使用 CPS 894 分析型 C18 色谱柱（150×4.6 毫米，5 微米）实现目标色谱峰的分离，在 220 纳米波长下测定吸光度。895

RNA测序 896

按照Qiagen RNeasy迷你试剂盒制造商的建议，从(10^{6})胶质瘤干细胞（GSCs）中提取RNA。通过安捷伦 Tape Station 检测的RNA质量，其RNA完整性数值（RIN）介于8.6至9.9之间。采用Truseq链特异性mRNA建库试剂盒（Illumina）完成文库制备，并在Illumina平台上以150个循环的双端测序流程对899个细胞进行测序。每个样本最多获得8000万条读长序列。使用STAR 2.7.5c软件将读长序列与以GRCh38.p13为参考基因组的(1.3.2 2^{102})进行比对，并通过RSEM软件进行计数。RNA测序数据已提交至美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基因表达综合数据库（GEO），数据集编号为GSE179356。

统计分析 903

使用 GraphPad Prism 软件 10.0.0（美国加利福尼亚州拉霍亚市 GraphPad 软件公司）进行统计分析。除非另有说明，数据以三次重复实验的平均值±标准差（SD）表示。两组比较采用非配对Student t检验。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），并结合Tukey或Dunnett事后检验。样本数量及具体采用的统计检验方法在图注中注明。当P＜0.05时，认为均值差异具有统计学意义。(P<0.05)

选择性指数（SI）通过TMT对胶质瘤干细胞（GSCs，评估值为(IC 50）的细胞毒性活性与对非癌细胞的细胞毒性活性的比值计算得出。SI比值越高，理论上对癌细胞的选择性越理想，其中SI＞10被视为高选择性化合物⁵⁸。为测定“联合指数”（CI）和“减药指数”（DRI）值，通过中效效应方程分析MTT实验结果¹⁰³，利用CompuSyn软件（www.combosyn.com），分别计算单独使用TMT和替莫唑胺（TMZ）以及联合使用（TMT:TMZ比例为3:1）时每种药物的量效曲线和量效参数（效价和效能），并得到效应分数（Fa）-CI和效应分数（Fa）-DRI表格。Fa指受治疗影响的细胞活力比例。

Cl描述了药物相互作用的性质，这些相互作用在不同药物浓度下可表现为相加（Cl=1）、拮抗（Cl>1）或协同（Cl<1)：中等协同作用(Cl=0.7-0.9)、协同作用(Cl=0.3-0.7)、强协同作用(Cl=0.1-0.3)、极强协同作用(Cl<0.1）。DRl表示在协同联合用药中，与单独使用每种药物相比，在特定效应水平下允许的剂量降低倍数（例如，(ED50)、(ED_{70})、(ED 90)、(ED _{95}等）。DRI大于1表示有利的剂量降低倍数。