标题：Isotope tracing in adult zebrafish reveals alanine cycling between melanoma and liver

期刊：Cell Metabolism

原文链接：https://doi.org/10.1016/jNaNet.2021.04.014

研究亮点

成年斑马鱼非常适合稳态标记和代谢组学研究

黑色素瘤的支链氨基酸分解代谢会导致丙氨酸的分泌

肿瘤分泌的葡萄糖衍生丙氨酸用于肝脏糖异生

药物抑制肿瘤-肝脏丙氨酸循环可降低肿瘤负荷

摘要

肿瘤代谢的细胞内在特性已得到越来越充分的表征。然而，肿瘤对全身代谢的影响受到的关注较少。本研究利用携带BRAFV600E驱动型黑色素瘤的成年斑马鱼，探究癌症对远端组织的影响。通过代谢组学和同位素追踪技术，我们发现黑色素瘤消耗的葡萄糖量约为其他被测组织的15倍。尽管存在这一代谢负担，患病动物体内仍通过肿瘤-肝脏丙氨酸循环维持循环葡萄糖水平。肿瘤排出葡萄糖衍生的丙氨酸为肝脏糖异生提供碳源，并使肿瘤能够从支链氨基酸分解代谢中清除过量氮，我们发现这一过程在斑马鱼和人类黑色素瘤中均被激活。对斑马鱼中肿瘤-肝脏丙氨酸循环的药物抑制降低了肿瘤负荷。本研究强调了肿瘤与远端组织间代谢串扰的重要性，并确立了成年斑马鱼作为研究此类过程的理想模型。

图形摘要

引言

许多研究已探讨了转化对细胞代谢的自主效应（范德海登等人，2009）。如今已有充分证据表明，肿瘤会调整其代谢活动以满足快速增殖的需求（德贝拉迪尼斯与钱德尔，2016；范德海登与德贝拉迪尼斯，2017）。然而，肿瘤对全身代谢产生的影响仍鲜为人知。

尤其值得关注的是，癌细胞会高效摄取从葡萄糖、乳酸到脂质和氨基酸等各类营养物质（Chen 等人，2016；DeBerardinis 等人，2007；Gao 等人，2019；Hui 等人，2017；Jain 等人，2012；Kamphorst 等人，2013；Krall 等人，2016；Yao 等人，2016）。健康机体中的其他组织依赖这些相同底物的稳定供应来维持正常功能。因此，一个问题随之产生：肿瘤的营养负担如何影响宿主的代谢生理。尽管其他健康组织可能会与癌细胞争夺部分相同资源，但器官在代谢方面的作用也可能存在宿主被重新定义以满足肿瘤的需求。本研究旨在从分子水平探究肿瘤诱导的全身代谢变化，这可能有助于我们加深对癌症相关恶病质等全身性病理状态的理解。

为了评估肿瘤与宿主代谢之间的关系，我们采用了斑马鱼黑色素瘤的(BRAF ^{-1 / 600 E})突变体；p53缺陷型遗传模型（Patton等人，2005）。成年斑马鱼拥有人类代谢调控所需的所有器官，非常适合作为研究代谢生理学的体内系统（White等人，2013；Zang等人，2018）。斑马鱼相较于小鼠和其他哺乳动物系统的一个主要优势是进行同位素示踪研究的技术便利性。与细胞培养类似，同位素示踪剂可直接添加到动物的养殖水箱水中，随后通过斑马鱼的鳃、皮肤和口腔被吸收（Dang等人，2016a；Truong等人，2014）。与哺乳动物系统不同，同位素示踪剂可在无需手术泵、注射、麻醉，也无需限制动物活动的情况下，长期持续地递送给动物（Davidson等人，2016；Faubert等人，2017年；许等人，2017年；张等人，2019年）。这最大限度地减少了动物的应激反应，因此能更具代表性地测量代谢情况，同时也大幅降低了研究人员的技术操作难度（费尔南德斯-加西亚等人，2020年）。

结果与讨论

单只成年斑马鱼的同位素示踪

鉴于尚未在成年斑马鱼中开展同位素示踪研究，我们首先建立了实验工作流程（图1A）。斑马鱼体型相对较小，这给单个个体的血清和组织代谢组学分析带来了挑战。为从单只斑马鱼身上获取足够的血清以进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析针对斑马鱼，我们采用了一种已应用于蛋白质组学的方法（Babaei 等人，2013）。简而言之，在尾鳍截肢后，对动物进行低速离心以收集血液（图 S1A）。我们还在该过程中采用了非化学麻醉法，我们发现与常用的三卡因法相比，这种方法能得到更可靠的代谢测量结果（图 S1B）（Eames 等人，2010）。

一旦我们有了一个实验工作流程来对个体斑马鱼进行代谢组学测量，我们接下来就寻求优化实现同位素稳态的条件。虽然同位素稳态不需要进行同位素追踪，但它可以简化数据的解释（Buescher et al.，2015）。野生型（WT）鱼被禁食，然后转移到含有([U-^{13} C])葡萄糖的水箱水中浓度为5–20毫摩尔。24小时内，所有测试浓度均使循环葡萄糖达到同位素稳态（图1B和图S1C）。我们确定10毫摩尔条件为最优条件，因为它能最大化下游代谢物的标记率，同时不会对循环葡萄糖水平造成任何显著扰动（图1C和图S1D）。此外，24小时后，与在标准条件下饲养的对照动物相比，转移至含10毫摩尔葡萄糖的水箱水中的动物未检测到代谢的显著变化（图S1E–S1K）。为确保斑马鱼置于10毫摩尔([U-^{13} C])葡萄糖水中24小时后全身达到同位素稳态，我们还通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）比较了血清和肝脏中关键中心碳代谢物的分数标记率。分数标记率定义为某代谢物的特定同位素异构体丰度，以循环中示踪剂的丰度为基准进行归一化。糖酵解代谢物、三羧酸（TCA）循环代谢物及相关氨基酸的标记率在整个机体均达到同位素稳态（图1D–1K）。

归一化标记，定义为代谢物中 (^{13} C) 原子的百分比除以 (^{13} C) 原子的百分比循环示踪剂已被用于评估同位素稳态下示踪剂在体内对下游代谢物的直接和间接贡献（Hui 等人，2017）。基于标准化标记结果，我们发现斑马鱼中葡萄糖对循环乳酸和谷氨酰胺的贡献（分别约为70%和10%）与小鼠（分别约为65%和10%）相当（图S1L）（Hui 等人，2017）。此外，在大多数斑马鱼组织中，葡萄糖对三羧酸循环的贡献（如肝脏约15%、肌肉约12%、肠道约7%）与相应的小鼠组织（如肝脏约15%、肌肉约20%、肠道约10%）相似（图S1L）（Hui 等人，2017）。这些发现表明，野生型斑马鱼与小鼠在葡萄糖同位素追踪实验中的结果基本一致。

图1.向成年斑马鱼水中添加同位素示踪剂实现同位素稳态标记。（A）基于LC-MS的代谢组学的稳态标记工作流程示意图。（B）在含有10mM([U-^{13} C])葡萄糖的罐水中实现WT斑马鱼血清葡萄糖稳态标记的动力学。值是平均值±SEM；每个时间点(n=3-4)斑马鱼。（C）WT斑马鱼在10mM([U-^{13} C])葡萄糖标记过程中的血清葡萄糖水平。值是平均值+SEM；每个时间点(n=3-4)斑马鱼。（D-G）相对于血清M6葡萄糖，在18-24小时的WT血清和肝脏中糖酵解中间体葡萄糖6-磷酸（D）、丙酮酸（E）、丙氨酸（F）和乳酸（G）的分数标记。数据是平均值+SEM；每个时间点(n=5)斑马鱼。（H-K）相对于血清M6葡萄糖，代谢物a-酮戊二酸（H）、琥珀酸（I）、苹果酸（J）和谷氨酰胺（K）在18和24h.Data之间的WT血清和肝脏中的分数标记平均+SEM；每个时间点(n=5)斑马鱼。n. d.，未检测到；n.s.，根据双尾配对t测试没有统计学意义；G6-P，葡萄糖6-磷酸；Pyr，丙酮酸；Ala，丙氨酸；Lac，乳酸；a-KG，a-酮戊二酸；Suc，琥珀酸；Mal，苹果酸；Gln，谷氨酰胺。完整的标签数据可在数据S1中获得。

应用于斑马鱼黑色素瘤模型

在确定了实验流程后，我们试图利用斑马鱼黑色素瘤模型探究癌症引发的全身代谢变化。在p53缺陷背景下，由黑色素细胞mitfa启动子调控的人类致癌(BRAF ^{V 600 E})突变的转基因表达，会导致斑马鱼自发形成黑色素瘤（Patton等人，2005）。以往研究表明，在(in)体外环境中，(BRAF ^{-1 / 600 E})驱动的黑色素瘤细胞存在谷氨酰胺成瘾现象，其对谷氨酰胺的消耗量是正常黑色素细胞的7倍之多（Scott等人，2011）。在细胞培养研究中，(BRAF ^{V 600 E})驱动的黑色素瘤细胞以谷氨酰胺作为三羧酸循环中间产物及脯氨酸、天冬酰胺等相关代谢物的前体（Ratnikov等人，2015，2017）。因此，我们推测，机体需要利用循环谷氨酰胺的碳源来维持三羧酸循环，这可能是黑色素瘤对机体造成的一种代谢负担。为验证这一假设，我们将BRAF/p53 ((B R A F^{-V 600 E})突变体；(p53)缺陷型斑马鱼置于5 mM ([U-^{13} C])谷氨酰胺溶液中培养24小时，以达到同位素稳态。我们确定，该条件能在不影响循环谷氨酰胺水平的前提下，实现血清谷氨酰胺的稳态标记（图S2A和S2B）。令人意外的是，与以往体外研究结果相反，我们的体内数据显示，谷氨酰胺在黑色素瘤的三羧酸循环中贡献极小（图2A和S2C）。我们指出，该比例黑色素瘤中标记谷氨酰胺的丰度与循环中的一致，这表明低谷氨酰胺摄取并非黑色素瘤中谷氨酰胺对三羧酸循环贡献微小的原因（图2B）。事实上，黑色素瘤中谷氨酰胺对三羧酸循环的贡献与含有高浓度正常黑素细胞的鳍组织相当（图S2C）。另一方面，肝脏和肠道显示出谷氨酰胺碳的掺入范围更广（图S2C）。我们的观察结果与其他研究一致，这些研究表明，对于某些癌症，体内谷氨酰胺的利用率低于体外（Davidson等人，2016；Hensley等人，2016）。基于这些结果，黑色素瘤对谷氨酰胺的利用似乎不太可能显著影响全身代谢。

除了对谷氨酰胺存在依赖性外，已有研究表明，在体外环境中，表达(BRAF ^{-1600 E})的黑色素瘤细胞相较于正常黑素细胞，其葡萄糖消耗速率也会升高（Scott等人，2011年）。基于此，我们通过将BRAF/p53斑马鱼置于10毫摩尔([U-^{13} C])葡萄糖溶液中培养24小时以达到同位素稳态，以此检测体内葡萄糖的利用情况（图2C）。研究发现，在糖酵解、三羧酸循环及相关氨基酸的碳源供应中，葡萄糖贡献的碳量显著高于谷氨酰胺（图2A、图2C与图2D）。此外，除脑组织外，所有其他组织的糖酵解中间产物标记水平均低于肿瘤组织（图S2D）。  为直接探究黑色素瘤中糖酵解的通量，我们通过腹腔注射的方式，向每克斑马鱼体内注入0.5毫克([U-^{13} C])葡萄糖，并检测不同组织中乳酸的标记情况随时间的变化（图2E）。结果显示，黑色素瘤中葡萄糖向乳酸转化的通量显著高于肝脏、肌肉等其他组织。基于这些数据，我们推测肿瘤组织对葡萄糖的消耗多于其他组织。  为评估葡萄糖摄取情况，我们将BRAF/p53斑马鱼置于1毫摩尔2-脱氧葡萄糖（2-DG）环境中。与葡萄糖类似，2-脱氧葡萄糖可通过葡萄糖转运蛋白被细胞摄取，并代谢为6-磷酸-2-脱氧葡萄糖（2-DG6-P）。值得注意的是，2-DG6-P无法在细胞内继续代谢，其积累量与摄取速率呈正相关。我们对各组织中2-DG6-P的相对浓度进行定量分析后发现，肿瘤组织对葡萄糖的摄取量分别是肝脏和肌肉组织的16倍和14倍（图2F）。  然而，尽管肿瘤引发了这种病理性的葡萄糖需求，我们发现BRAF/p53斑马鱼的循环葡萄糖水平与野生型（WT）斑马鱼并无差异（图2G）。此外，肌肉组织的糖酵解通量未发生改变，这表明非恶性组织仍在将葡萄糖作为能量物质利用（图S2E）。

图2葡萄糖是体内黑色素瘤代谢的主要碳源。（A）图解说明谷氨酰胺碳在中枢碳代谢中向关键中间体的转化。（B）肿瘤M5谷氨酰胺中的分数标记，归一化为血清M5谷氨酰胺，来自([U-^{13} C])谷氨酰胺示踪剂。值为平均值+SEM；(n=6)斑马鱼。（C）图解说明葡萄糖碳在中枢碳代谢中向关键中间体的转化。（D）葡萄糖和谷氨酰胺示踪剂对黑色素瘤中枢碳代谢产物的(^{13} C)贡献的比较。正如预期的那样，所示的同位素占标记的大部分。这里显示的数据呈现为倍数变化（即，来自([U-^{13} C])葡萄糖的标记量相对于来自([U- ^{13} C])谷氨酰胺的标记量，归一化为1）。值为平均值+SEM；每个条件(n=6-10)斑马鱼。（e）腹腔注射([U- ^{13} C])葡萄糖后，BRAF/p53斑马鱼组织中乳酸（M3同位素）随时间的绝对富集。数据是平均扫描电镜；斑马鱼每时间点(n=3-4)（F）BRAF/p53斑马鱼组织中葡萄糖的摄取。鱼体内组织中2-脱氧葡萄糖6-磷酸（2-DG6-P）的相对浓度被标准化为其肿瘤中的2-DG6-Ppool。值是平均值+扫描电镜；(n=5-6)斑马鱼每条件（G）WT和BRAF/p53鱼中循环葡萄糖的相对池大小，标准化为WT组。值是平均值+扫描电镜；每个条件(n=4-6)斑马鱼。通过双尾配对t检验评估统计学上的显著差异，并注释如下：(p<0.05)(^{*} p<0.01).(^{++} p<0.001)(^{* * *} p<0.0001)，orn. s.=不显著。乳酸乳酸；丙氨酸；柠檬酸盐；a-KG，a-ketoglutarate；Fum，fuma数据S2中提供了完整的标签数据。

黑色素瘤对全身代谢的影响

我们的研究结果表明，BRAF/p53 模型动物能够维持葡萄糖稳态，即便面对肿瘤带来的代谢负担。数据显示，尽管部分组织可能与黑色素瘤竞争葡萄糖，但其他组织很可能会重编程自身代谢以补充肿瘤的需求。为评估黑色素瘤对全身代谢的影响，我们采用基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的代谢组学方法，对给予同位素标记葡萄糖示踪剂后的 BRAF/p53 斑马鱼组织进行分析。野生型和携带黑色素瘤的斑马鱼被置于 10 毫摩尔/升的 ([U-^{13} C]) 葡萄糖溶液中培养 24 小时，以达到同位素稳态，且(^{13} C) -野生型代谢物的富集度和库大小(^{13} C) -野生型代谢物的富集度和库大小代谢。阐明所有这些代谢变化背后的机制超出了本研究的范畴，但我们在此提供相关数据，旨在全面呈现肿瘤存在时机体整体代谢发生的改变（图3A和图3B；数据S3）。

考虑到荷瘤动物肝脏中观察到的变化幅度以及该器官在维持葡萄糖稳态中的作用，我们在此将研究重点聚焦于肝脏（图3A和图3B）。我们推断，BRAF/p53斑马鱼的肝脏可能会通过增加糖异生来作为代偿机制，以应对黑色素瘤并维持葡萄糖稳态（图2G）。肝脏葡萄糖生成主要通过两种机制实现：从糖原中水解葡萄糖（即糖原分解），以及通过糖异生途径从非碳水化合物前体生成新的葡萄糖分子。糖原占肝脏总质量的比例最高可达15%，其降解是维持全身葡萄糖水平的首个激活机制（Bonjorn等人，2002）。与糖原分解增强的结果一致，我们通过定量检测、高碘酸-希夫染色以及肝脏质量降低的结果证实，与野生型（WT）斑马鱼的肝脏相比，BRAF/p53斑马鱼的肝脏糖原含量显著减少（图3C和图S3A-S3C）。尽管野生型和BRAF/p53斑马鱼肝脏中糖异生相关基因的表达未发生改变，但来自([U- ^{13} C])葡萄糖示踪的数据显示，患病动物体内通过糖异生途径的底物流量有所增加（图3D和3E）。具体而言，我们观察到BRAF/p53斑马鱼的血清和肝脏中M3葡萄糖标记物水平升高，这是糖异生作用的特征性标志（图3E）。此外，黑色素瘤斑马鱼肝脏中M3苹果酸标记物的增加，进一步证实了通过丙酮酸羧化酶的糖异生通量更高（图S3D和S3E）（Buescher等人，2015）。

肿瘤-肝脏丙氨酸循环

我们推测，BRAF/p53 小鼠的肝脏最有可能将三种物质作为糖异生底物来支持葡萄糖生成的增加，分别是乳酸、丙氨酸和丙酮酸。乳酸是源自葡萄糖的丰度最高的循环三碳代谢物，通常会以高浓度由肿瘤排出，并且是健康动物肝脏糖异生的公认底物（Ross 等人，1967；Vander Heiden 等人，2009）。然而，尽管乳酸很容易由肿瘤产生，但其 M3 标记在 BRAF/p53 小鼠的循环系统和肝脏中并未升高（图3F）。因此，乳酸似乎不太可能被用作黑色素瘤鱼体内糖异生增加的底物。相比之下，患病小鼠循环系统和肝脏中的丙氨酸 M3 标记均显著升高（图3G）。此外，BRAF/p53 小鼠肝脏中的丙酮酸 M3 标记有所升高，但血清中未出现该现象（图3H）。这些数据表明，肝脏从循环系统中摄取了更多丙氨酸，并在肝脏内将其转化为丙酮酸，以此作为糖异生的底物（图2C、图3G和图3H）。

按照传统认知，肌肉被认为是丙氨酸生成的主要来源，并参与与肝脏之间的器官间丙氨酸交换（费利格，1973年）。值得注意的是，在荷瘤动物体内，我们的数据揭示了一种不同的代谢物交换模式，即糖异生过程中丙氨酸的主要来源是黑色素瘤而非肌肉。有两项观察结果支持这一结论。首先，肿瘤中丙氨酸的M3标记水平比肌肉中高出2倍以上（图3I）。其次，黑色素瘤与肝脏之间M3丙氨酸的相对标记水平无统计学差异（图3I）。为了验证组织对丙氨酸的摄取以及为探究丙氨酸转运的方向性，我们将BRAF/p53斑马鱼置于含有0.5毫摩尔不可代谢丙氨酸类似物2-氨基异丁酸（2-AIB）的水箱水中。检测组织中2-AIB的水平可作为丙氨酸摄取的替代指标（Akedo和Christensen，1962；Edmondson等人，1979）。我们对比了肝脏、肿瘤和肌肉中2-AIB的浓度，发现肝脏的相对丙氨酸摄取量约为黑色素瘤的3倍。相比之下，黑色素瘤摄取的丙氨酸量与肌肉相近（图3J）。综上，我们的数据表明，黑色素瘤产生的丙氨酸多于肌肉，且摄取的丙氨酸少于肝脏，这支持了黑色素瘤衍生的丙氨酸参与非经典肿瘤-肝脏丙氨酸循环，以补充肿瘤动物体内循环葡萄糖的结论。

图3. 系统级同位素追踪揭示BRAF/p53斑马鱼肝脏糖异生水平升高，其能量来源于黑色素瘤衍生的丙氨酸。(A) ([U-^{13} C]) 葡萄糖处理下多种代谢物标准化标记差异的热图。通过对比 BRAF/p53 斑马鱼某组织与野生型（WT）斑马鱼同一组织的代谢物标准化标记水平计算差异。绿色代表 BRAF/p53 斑马鱼代谢物标记水平升高，红色代表降低。每个数据点代表生物学重复的均值比值。白色框表示未掺入 (^{13} C) 示踪剂的代谢物。n = 每组 5–10 条斑马鱼。图中各代谢物的鉴定结果及完整标记数据见数据 S3。(B) BRAF/p53 斑马鱼组织相对于野生型（WT）斑马鱼组织的代谢物库大小差异热图。绿色代表 BRAF/p53 斑马鱼代谢物库更大，红色代表更小。每个数据点代表生物学重复的均值比值。n = 每组 (n=5-10) 条斑马鱼。图中各代谢物的鉴定结果及库大小数据见数据 S3。(C) 野生型（WT）和 BRAF/p53 斑马鱼肝脏糖原的相对浓度，以野生型（WT）组为基准进行标准化。数值为均值 ± 标准误（SEM）；n = 每组 7 条斑马鱼。(D) BRAF/p53 斑马鱼肝脏糖异生关键酶葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的相对表达量，以野生型（WT）表达量为基准进行标准化。数值为均值 + 标准误（SEM）；n = 每组 (n=4-5) 条斑马鱼。(E–H) 野生型（WT）和 BRAF/p53 斑马鱼血清与肝脏中，葡萄糖（E）、乳酸（F）、丙氨酸（G）和丙酮酸（H）的同位素标记分数（以血清 M6 葡萄糖为参照）。数据以相对于野生型（WT）组的倍数变化表示。数值为均值 + 标准误（SEM）；n = 每组 (n=5-10) 条斑马鱼。完整标记数据见数据 S3。(I) BRAF/p53 斑马鱼各组织中丙氨酸的标记分数（以血清 M6 葡萄糖为参照）。数据以相对于肿瘤中丙氨酸标记水平的倍数变化表示。数值为均值 + 标准误（SEM）；n = 每组 (n=10) 条斑马鱼。(J) BRAF/p53 斑马鱼各组织对丙氨酸的摄取能力。单条斑马鱼各组织中 2-氨基异丁酸（2-AIB）的库大小以其肿瘤中 2-AIB 库为基准进行标准化。数值为均值 + 标准误（SEM）；n = 每组 (n=5) 条斑马鱼。采用双尾配对 t 检验评估统计学显著差异，并标注如下：(p 0.05) 表示极显著差异，(^{*} p<0.01) 表示显著差异，n.s. 表示无显著差异。

丙氨酸循环会清除支链氨基酸分解代谢过程中产生的多余氮

在脊椎动物中，肝脏在维持全身氮稳态方面发挥着主要作用（Ha€ussinger, 1990）。然而，与哺乳动物的尿素排泄不同，斑马鱼清除氮废物的主要方式是排氨作用，即肝脏由氨基酸分解代谢产生的氨通过鳃直接排出体外（Braun et al., 2009; Randall and Wright, 1987）。这种废物清除机制（以及其他类似过程）体现了在代谢研究中使用斑马鱼的另一大优势：可以反复、无创地采集水箱水样，以测量源自代谢过程的排泄分子。基于此，我们探究了与野生型（WT）斑马鱼相比，BRAF/p53 突变鱼中肿瘤-肝脏丙氨酸循环是否与氨排泄异常相关。将 BRAF/p53 突变鱼和野生型鱼单独饲养在淡水中，24 小时后检测氨含量。与病理性丙氨酸循环的结果一致，携带肿瘤的斑马鱼排出的氨量几乎是野生型鱼的两倍（图4A）。

我们接下来的研究重点是确定肿瘤排出氮的来源。我们首先考虑了通过巨胞饮作用摄取循环蛋白，已知这一过程是胰腺肿瘤的重要营养来源（Davidson 等人，2017）。我们推断，蛋白衍生氨基酸碳骨架的氧化会导致细胞内氮过量，需要将其排出。为评估蛋白摄取对氮平衡的潜在贡献，我们用巨胞饮作用抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利（EIPA）处理荷瘤动物，随后检测丙氨酸循环。即使在高浓度下，EIPA 也未影响肿瘤中的丙氨酸标记，也未影响肝脏糖异生（通过肝脏和血清中葡萄糖的M3标记反映）。这些数据表明，在我们的模型中，巨胞饮作用对肿瘤氮平衡无显著贡献（图4B）。

我们接下来的研究重点是确定肿瘤排出氮的来源。我们首先考虑了通过巨胞饮作用摄取循环蛋白，已知这一过程是胰腺肿瘤的重要营养来源（Davidson 等人，2017）。我们推断，蛋白衍生氨基酸碳骨架的氧化会导致细胞内氮过量，需要将其排出。为评估蛋白摄取对氮平衡的潜在贡献，我们用巨胞饮作用抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利（EIPA）处理荷瘤动物，随后检测丙氨酸循环。即使在高浓度下，EIPA 也未影响肿瘤中的丙氨酸标记，也未影响肝脏糖异生（通过肝脏和血清中葡萄糖的M3标记反映）。这些数据表明，在我们的模型中，巨胞饮作用对肿瘤氮平衡无显著贡献（图4B）。谷氨酰胺对肿瘤代谢的影响微乎其微（图2D）。因此，我们将研究重点放在支链氨基酸（BCAAs）上。我们将BRAF/p53斑马鱼置于含有2 mM ([^{15} ~N]) 异亮氨酸、2 mM ([ ^{15} ~N]) 亮氨酸和 2 mM ([^{15} ~N]) 缬氨酸培养24小时。支链氨基酸降解的第一步是通过 将α-氨基转移到α-酮戊二酸上以生成谷氨酸支链氨基酸氨基转移酶（BCAT）的活性。随后，丙氨酸氨基转移酶（ALT）可将氮转移至丙酮酸，生成丙氨酸以便排出。有趣的是，从循环中摄取的游离支链氨基酸为肿瘤内谷氨酸的总氮贡献了近60%，这表明这些氨基酸是从肿瘤中排出的氮的最大供体（图4C）。此外，被([15N])号支链氨基酸标记的谷氨酸含量与肌肉中的并无显著差异（图4C）。已知肌肉是支链氨基酸分解代谢的主要场所，这会导致氮过剩，并以丙氨酸的形式释放到循环中（Brosnan和Brosnan，2006年）。这些数据进一步表明，黑色素瘤的代谢与肌肉相似，既摄取支链氨基酸，又通过丙氨酸排出其氮。作为巨胞饮并非黑色素瘤氮库主要贡献者的进一步证据，我们发现肿瘤内支链氨基酸的标记程度与血清中并无显著差异（图4D）。这一结果与肿瘤摄取的标记支链氨基酸未被完整蛋白质降解产生的未标记支链氨基酸稀释的情况相符。

为验证黑色素瘤发生过程中支链氨基酸降解通路被激活，我们对比了黑色素瘤细胞与正常黑素细胞中支链氨基酸转氨酶1（BCAT1）的表达水平。研究发现斑马鱼黑素细胞中BCAT1的表达量几乎为零，而BRAF/p53突变肿瘤来源的黑色素瘤细胞中BCAT1表达显著上调（图4E）。该结果与其他斑马鱼相关研究的数据一致（Venkatesan等人，2018）。为明确研究发现的转化潜力，我们检测了华盛顿大学医学院收治的18例晚期黑色素瘤患者肿瘤组织中BCAT1的表达情况。与人类正常黑素细胞的结果一致（Haltaufderhyde和Oancea，2014；Reemann等人，2014），BCAT1在人类黑色素瘤组织中同样呈高表达状态（图4F）。上述结果表明，无论是斑马鱼黑色素瘤模型还是人类黑色素瘤组织，其支链氨基酸分解代谢通路均被激活。

图4.循环中的BCAAs为黑色素瘤提供了丙氨酸循环的氮源，丙氨酸循环可被vemurafenib损害。（A）从WT和BRAF/p53鱼排泄到水箱水中的氨浓度。在水刷新后24小时进行测量。每组分别安置。值为平均值+SEM；每种条件下(n=3)斑马鱼。（B）用EIPA或DMSO（Veh）处理的BRAF/p53斑马鱼中M3丙氨酸和M3葡萄糖的相对M6葡萄糖分数标记。值为平均值±SEM；每种条件下(n=9-14)斑马鱼。（C）BRAF/p53鱼肿瘤和肌肉中谷氨酸相对于血清M1 BCAAs的分数标记。血清M1 BCAAs通过异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的M1值平均来确定。数据可在数据S4中获得。值为平均值+SEM；(n=5)斑马鱼。（D）BRAF/p53鱼血清和肿瘤中异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的相对于血清M1 BCAAs的分数标记。数据可在数据S4中获得数值为平均值+SEM；每种条件(n=5)斑马鱼。（E）BCAT1在斑马鱼黑素细胞和BRAF/p53黑色素瘤细胞中的表达。我们的数据在左边，来自Venkatesan等人的数据在右边。中心线，中位数；框限制是第一和第三个四分位数；胡须，范围。

用维莫非尼抑制 (BRAF ^{V 600 E}) 可降低肿瘤-肝脏丙氨酸循环

我们接下来研究了(BRAF ^{V 600 E})的选择性抑制剂维莫非尼是否会影响肿瘤-肝脏丙氨酸循环。维莫非尼是一种经临床批准用于治疗表达(BRAF ^{-1 / 600 E})突变的黑色素瘤的化疗药物，在人类、小鼠和斑马鱼中具有极低的毒性和良好的耐受性（Dang等人，2016b；Kim和Cohen，2016；Yang等人，2010）。基于此前针对斑马鱼和小鼠黑色素瘤模型报道的疗效和毒性数据，我们以以腹腔注射的方式向 BRAF/p53 斑马鱼给药，剂量为每日每千克体重100毫克（Dang 等人，2016b；Yang 等人，2010）。连续给予维莫非尼或二甲基亚砜溶剂处理4天后，将实验动物转移至含有10毫摩尔每升 ([U-^{13} C]) 葡萄糖的新养殖箱中，孵育24小时后，再进行氨排泄量测定和代谢组学分析（图4G）。药物处理4天后，肿瘤体积未出现显著减小，但观察到了强烈的代谢反应（图S4B）。与溶剂处理的 BRAF/p53 斑马鱼相比，接受维莫非尼处理4天的实验动物表现出以下变化：（1）氨排泄量显著减少（图S4C）；（2）肿瘤内中心碳代谢物对 (^{13} C) 标记的掺入量降低，丙氨酸的M3标记水平下降约2倍（图4H、图S4D和图S4E）；（3）5-磷酸核糖（R5-P，一种在增殖细胞中生成上调的核苷酸前体）的库容量及其 (^{13} C) 标记水平均有所降低（图4H和图S4F）（Bruntz 等人，2017；Patra 和 Hay，2014）。此外，肝脏和循环葡萄糖中的M3标记结果显示，接受维莫非尼处理4天的 BRAF/p53 斑马鱼，其糖异生水平与野生型（WT）斑马鱼相当（图4I）。同时，维莫非尼处理4天的 BRAF/p53 斑马鱼与野生型斑马鱼相比，肝脏和循环系统中的M3丙氨酸水平无显著差异（图4I）。综合来看，这些数据表明，抑制 (BRAF ^{vee 600 E}) 会导致肿瘤与肝脏之间的丙氨酸循环消失。

为了更好地理解维莫非尼的作用，我们进行了另外两项实验。首先，我们比较了给予赋形剂的野生型斑马鱼与连续4天每天给予100毫克/千克维莫非尼的野生型斑马鱼。在赋形剂或维莫非尼处理后，将动物转移至含有([U-^{13} C])葡萄糖的养殖水中处理24小时。未在来自<(^{13} C)>标记的代谢物中发现差异循环系统、肝脏或肌肉中（图S5A-S5F）。这些数据表明，在不存在(BRAF ^{V 600 E})的情况下，维莫非尼不会影响丙氨酸循环。其次，我们使用维莫非尼进行了与上述相同的实验，但以100毫克/千克/天的剂量连续给药10天。用维莫非尼处理BRAF/p53斑马鱼10天后，肿瘤体积缩小了95%以上（图S5G和S5H，(>95%)）。然而，维莫非尼处理10天后的氨排泄量与处理4天后的氨排泄量无显著差异（图S4C）。接受维莫非尼治疗4天和10天的动物的同位素示踪数据也具有可比性（图S5I）。这些结果表明，BRAF/p53斑马鱼的丙氨酸循环并未因肿瘤消退而降低，而是由(BRAF ^{V 600 E})信号通路的抑制所导致。

抑制丙氨酸转氨酶可降低支链氨基酸分解代谢、丙氨酸循环及肿瘤体积

我们的观察表明，在黑色素瘤中激活支链氨基酸（BCAA）的降解会产生过量氮，该氮通过丙氨酸从肿瘤中释放，随后被转运至肝脏并以氨的形式排出。因此，我们试图评估抑制黑色素瘤中丙氨酸的生成是否会影响支链氨基酸的分解代谢及后续的肿瘤生长。首先，我们用丙氨酸转氨酶（ALT）抑制剂（β-氯丙氨酸，对应标识 ((B))）处理携带黑色素瘤的斑马鱼，持续10天。随后，将这些动物转移至含有支链氨基酸（对应标识 ([U-^{13} C])）的养殖水中培养24小时。鉴于支链氨基酸脱去α-氨基后会以乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的形式进入三羧酸（TCA）循环，而这一氨基最终会通过丙氨酸转氨酶转移至丙酮酸（图5A），我们评估了支链氨基酸对肿瘤中三羧酸循环的贡献。使用β-氯丙氨酸抑制丙氨酸转氨酶后，支链氨基酸（对应标识 ([U-^{13} C])）对三羧酸循环的贡献显著降低（图5B）。此外，抑制丙氨酸转氨酶会导致血清中支链氨基酸蓄积、肿瘤内支链氨基酸蓄积，同时使循环葡萄糖水平以及肿瘤、血清和肝脏中的丙氨酸水平下降（图5C）。减少黑色素瘤中支链氨基酸的氧化和丙氨酸的生成，还与肿瘤体积缩小50%相关（图5D和图5E）。综上，我们的研究结果表明，支链氨基酸的分解代谢有助于肿瘤生长，且黑色素瘤要高效利用这些底物，必须通过丙氨酸将氮从肿瘤中移除。

图5. 药理学抑制ALT为肿瘤-肝脏丙氨酸循环提供直接支持。（A）示意性说明BCAA碳向中枢碳代谢关键中间体的转化。（B）相对于血清([U- ^{13} C])BCAAs的分数标记，用载体（Veh）或β-氯丙氨酸（ALTi）治疗的肿瘤中的中枢碳中间体2-酮戊二酸、谷氨酸、苹果酸和富马酸。数据归一化到载体治疗组。血清([U- ^{13} C])BCAAs通过平均([U- ^{13} C])异亮氨酸、([U-^{13} C])亮氨酸和([U-^{13} C])缬氨酸来确定。值为平均值±SEM；每种条件下n=6-7条斑马鱼。完整的标记数据可在数据S5中获得。（C）用载体（Veh）或b-氯丙氨酸（ALTi）治疗的BRAF/p53动物的中枢碳代谢物的相对池大小。数据归一化到载体治疗组。值为平均值+SEM；每种条件下(n=6-10)斑马鱼。数据可在数据S5中获得。（D）β-氯丙氨酸（ALT抑制剂）治疗10天后肿瘤体积与基线的相对变化。值为平均值+扫描电镜；每个条件(n=9-10)肿瘤。肿瘤尺寸包括数据S5。（E）b-氯丙氨酸治疗10天后BRAF/p53鱼肿瘤消退的代表性图像。通过双层palired t检验评估统计学上的显著差异，并注释如下：(p 0.05)(^{*} p<0.01)，(^{* *} p<0.001)。(^{* * *} p<0.0001)或n. s.=不显著。

结论

总之，本研究确立了成年斑马鱼作为一种非常适合的模式生物，可通过同位素示踪分析和代谢组学来研究全身生理学。我们介绍的实验方法可轻松应用于研究任何斑马鱼疾病模型（Lieschke 和 Currie, 2007；Salmi 等人, 2019；Seth 等人, 2013）。利用黑色素瘤的BRAF/p53模型，我们发现肿瘤的存在会导致代谢发生系统性改变。具体而言，我们的研究结果表明，肝脏将肿瘤分泌的丙氨酸作为糖异生的底物。这一过程维持循环葡萄糖水平，并有助于满足肿瘤对糖酵解的高需求。尽管肿瘤-肝脏丙氨酸循环此前已被提出（DeBerardinis 和 Cheng, 2010），但据我们所知，这是首次在体内直接证实该循环的存在。在黑色素瘤中，我们证实该循环可帮助清除肿瘤中因支链氨基酸分解代谢增强而产生的过量氮，且使用丙氨酸转氨酶（ALT）抑制剂阻断该循环可能是一种颇具前景的治疗方法。本研究强调了生物体内肿瘤与其他健康组织之间代谢协作的重要性，揭示了肿瘤如何利用宿主的正常生理机制为自身获益。对这类相互作用的研究有望为治疗干预提供新的代谢靶点，这些靶点与远端非恶性组织相关，而非肿瘤本身。

研究的局限性

我们发现，肿瘤的存在会改变肝脏、肠道等多种非癌性组织的代谢，在斑马鱼黑色素瘤模型中对肌肉和大脑的相关研究。本研究重点在于表征与肿瘤-肝脏丙氨酸循环相关的变化。未来还需进一步研究，以明确其他代谢相互作用的本质、它们对黑色素瘤生长的影响机制，以及不同类型肿瘤是否会出现类似的变化。本研究借助斑马鱼黑色素瘤模型，探究了两种独立的治疗方法。第一种是维莫非尼，它是一种成熟的(BRAF ^{vee 600 E})抑制剂。维莫非尼在治疗开始4天后，便在肿瘤体积出现显著缩小之前，降低了黑色素瘤与肝脏之间的丙氨酸循环水平。治疗10天后，当肿瘤体积缩小(>95%)时，丙氨酸循环的降低状态仍持续存在。维莫非尼并非直接靶向肿瘤中的丙氨酸或支链氨基酸代谢，但已有研究在黑色素瘤细胞中发现了由BRAF调控的、控制糖酵解的转录因子网络（Parmenter等人，2014年）。未来还需开展更多研究，将肿瘤中的(BRAF ^{V 600 E})抑制作用与丙氨酸和支链氨基酸代谢的下游变化联系起来。本研究评估的第二种治疗药物为β-氯丙氨酸，选择该药物是因为它能直接抑制参与丙氨酸循环的丙氨酸转氨酶（ALT）。治疗10天后，β-氯丙氨酸使肿瘤体积缩小了50%。研究证实，β-氯丙氨酸通过抑制肿瘤中丙氨酸的生成以及支链氨基酸的氧化发挥作用，进而减少肿瘤-肝脏之间的丙氨酸循环。不过，仍需进一步研究以明确抑制肝脏中的ALT酶在多大程度上能降低丙氨酸循环并减轻肿瘤负荷。

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