题目：Extracellular Vesicles: Catching the Light in Zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31400828/

期刊：Trends in Cell Biology

细胞外囊泡（EVs）在所有生物的体液中循环，参与细胞间的跨器官通讯。由于成像技术分辨率低以及缺乏合适的动物模型，追踪和理解这些纳米级物体一直受到阻碍。斑马鱼胚胎的使用使得利用光学和电子显微镜以前所未有的时空分辨率观察细胞外囊泡成为可能。这使得能够并行研究内源性生理性细胞外囊泡和病理性细胞外囊泡，并进一步揭示其生物发生、生物分布以及在整个生物体中的靶细胞的机制。这些进展将有助于更好地理解细胞外囊泡的体内（病理）生理学。

引言

细胞外囊泡（EVs；见术语表）由大多数细胞类型释放，能够引发分泌细胞自身（自分泌）以及邻近或远处接收细胞的表型反应。在过去的二十年里，细胞外囊泡已成为细胞间通讯的多功能介质，与许多重要的生理和病理过程相关，尤其是发育和癌症进展。细胞外囊泡的研究最初是通过生物化学方法进行表征和研究，现在则受益于高分辨率光学显微镜和体内模型（特别是透明的斑马鱼胚胎）的最新进展，这使得能够在体内单囊泡水平上分析细胞外囊泡。这一层面的描述性观察很可能为研究开辟新途径，并在该领域产生新的假说。我们回顾了利用斑马鱼作为模型生物在细胞外囊泡生物学方面取得的最新进展，并讨论了该模型可以解决的几个悬而未决的问题。

生物发生与分泌

细胞外囊泡是一组异质性的膜性囊泡，富集了特定的蛋白质、遗传物质和脂质亚群，反映了细胞类型和来源细胞的生理状态。它们要么起源于晚期内体——通常称为外泌体（直径50-150纳米）——要么直接从质膜（PM）出芽，这种情况下称为微囊泡（100-1000纳米）。除了细胞外囊泡家族的这两个主要成员外，还描述了其他细胞外结构，如凋亡小体、外泌体（可能不是囊泡实体）和迁移体，它们参与斑马鱼胚胎发育，并已在人类血清中检测到。本综述将主要关注外泌体和微囊泡。

细胞外囊泡领域在深入表征各种细胞外囊泡亚群方面最近取得的进展，促使建立了一个通用命名法，以根据其大小（大和小细胞外囊泡）或起源（外泌体 vs 微囊泡）来区分细胞外囊泡亚群。然而，细胞外囊泡亚群之间的大小、密度和组成通常有重叠。因此，质膜来源的小（s）EVs 与内体来源的 EVs 在组成或功能上的差异程度仍有待完全确定。外泌体和微囊泡对体内总细胞外囊泡库的各自贡献同样是一个未解决的问题（见悬而未决的问题）。它们在体液中丰度高，且半衰期较短，这表明体内存在持续分泌。尽管如此，各种报告表明，细胞外囊泡可能以组成型和诱导型方式释放，并且可能依赖于细胞类型。对细胞外囊泡生物发生、摄取和功能的理解，很大程度上受益于体外和体内（主要是在小鼠，但也有果蝇和秀丽隐杆线虫）的研究。然而，细胞外囊泡分泌的实时可视化长期以来一直无法实现，这阻碍了对细胞外囊泡生理性释放和在不同细胞类型及组织中的摄取速率的仔细评估。因此，对细胞外囊泡体内半衰期的详细分析，以及对不同细胞外囊泡生物发生和释放机制相对贡献的审慎评估，一直滞后。

最近开发的方法现在允许在体外和体内对单细胞释放细胞外囊泡进行可视化，尽管在体内可视化释放过程本身在技术上仍然具有挑战性（框1）。具体而言，组织特异性表达外泌体报告蛋白 CD63–pHluorin 揭示了发育中的斑马鱼胚胎以依赖 syntenin-a 的方式分泌大量外泌体。在这种背景下，斑马鱼模型补充了极少数先前在体外描述的细胞外囊泡生物发生途径的体内研究。这些外泌体（直径大多在80至120纳米之间）从卵黄合胞体层（YSL）分泌到血流中，这一结论得到了对该层进行的原位电子显微镜（EM）分析的支持。通过利用斑马鱼中组织特异性启动子，类似的方法可用于确定体内每个组织的外泌体和微囊泡的生理分泌速率和局部扩散情况（图1A，关键图）。诸如 CD63–pHluorin 等标记物的嵌合表达将进一步允许在分泌后直接密切观察细胞外囊泡的行为，并将有助于研究三维体内组织结构对局部细胞外囊泡滞留或扩散的影响。有趣的是，循环细胞外囊泡的水平会随着生理状态的变化或各种病理的发展而增加。细胞外囊泡分泌水平可能因此在内稳态被破坏和/或细胞外囊泡清除受到干扰时升高。这些假设现在可以使用已建立的斑马鱼病理模型来探讨，其中细胞外囊泡已知在这些病理中发挥核心作用（癌症生物学、心脏病、神经病变、宿主-病原体相互作用等）。总的来说，细胞外囊泡释放的体内成像将有助于在生理和病理条件下确认并进一步探索分泌细胞外囊泡的组织（框2）。

在途：在体液中的传播和行为

高时空分辨率的体内成像可以揭示细胞外囊泡如何在分泌细胞周围扩散，如何穿越生物屏障，并最终如何在全身循环之前到达循环系统（图1B,C）。例如，利用表达 syntenin 2-GFP 的黑色素瘤细胞，可以在体内追踪斑马鱼黑色素瘤细胞外囊泡在转移各个阶段的扩散情况。在体内，大多数细胞并不直接与血液接触，而是与组织间液接触，组织间液约占总体细胞外体液体积的75%。有趣的是，在斑马鱼胚胎的组织间液中发现了大量的内源性 YSL 外泌体。因此，这个区室可能是一个被忽视的细胞外囊泡储库，并在体内稳态或病理过程中发挥重要作用。它可能作为细胞外囊泡向血管或淋巴管运输的通道，最近的研究表明淋巴管中含有大量的细胞外囊泡。或者，细胞外囊泡可以通过其他机制到达远离血管的细胞，例如转胞吞作用或血管渗漏（图1B）。事实上，多项体内研究表明细胞外囊泡可以穿越细胞屏障，但所涉及的具体机制在很大程度上仍有待确定。这在癌症中尤其相关，因为已知癌症中的血管异常通透。

关键图 斑马鱼：解锁细胞外囊泡（EVs）体内奥秘的新模型

图1. 利用斑马鱼胚胎可解答细胞外囊泡（EV）生物学领域的多个关键问题。(A) 受精后48小时（hpf）斑马鱼胚胎的示意图，标注了正在形成的器官。(B) 可在斑马鱼胚胎中分析细胞外囊泡的分泌与扩散过程。（上图）电子显微镜照片（经许可转载自文献[14]）展示了细胞外囊泡（黑色箭头所示）从卵黄合胞体层（YSL）释放进入血液循环的过程（示意图中(1)和虚线框处）。（下图）该示意图展示了可通过单细胞外囊泡分辨率追踪标记的外源性细胞外囊泡（蓝色）和内源性细胞外囊泡（外泌体为绿色；微囊泡为红色）来研究的过程，包括分泌与局部扩散。(C) 斑马鱼胚胎可用于研究标记细胞外囊泡的远距离摄取与命运。（上图）该照片来自表达红色内皮细胞和绿色巨噬细胞的转基因胚胎，向其注射青色荧光细胞外囊泡后，对尾静脉丛（CVP）进行活细胞共聚焦显微镜观察（胚胎示意图中(2)和虚线框处）（V. Hyenne 未发表数据）。（下图）该示意图展示了可在体内分析的相关事件。缩写：ECM，细胞外基质；MVB，多囊体。

在这种背景下，斑马鱼胚胎提供了复杂且模式化的血管网络，适用于精细解析细胞外囊泡在循环中的行为和长距离分散。对血流中细胞外囊泡的快速成像显示，与大血细胞不同，细胞外囊泡横跨血管的整个宽度（图1）。值得注意的是，它们也紧邻血管壁流动，根据哈根-泊肃叶方程，其速度在此处降低，并且可以发现它们在血管内皮表面滚动。这种特殊的分布可能影响细胞外囊泡的停滞和内化，而这一过程进一步由其表面的粘附分子介导。此外，我们发现循环中的细胞外囊泡在静脉区域的停滞比在动脉中更有效，这表明流动力直接影响它们靶向特定血管区域的能力。

摄取：器官趋向性、细胞身份和机制

在小鼠中——其检测灵敏度有限——注射到血液循环中的细胞外囊泡会积聚在少数特定器官中（主要是脾、肝和肺）。此外，据报道，特定的器官靶向（以及这些器官内的细胞类型特异性靶向）取决于肿瘤细胞外囊泡表面存在的整合素库。需要进一步的工作来描述细胞外囊泡负载的整合素如何在机制上决定这种特异性。这可能归因于血管特定区域中粘附分子（如整合素配体）的器官依赖性富集。或者——或此外——这种器官趋向性可以通过以下因素解释：（i）细胞外囊泡注射部位，（ii）血流特征，（iii）细胞外囊泡逃脱非特异性清除的能力，和/或（iv）靶组织的渗透性。斑马鱼胚胎的大小和透明度，其中大多数器官仍在形成（图1A），使得能够进行整体筛选，从而可能更好地实时理解细胞外囊泡的生物分布。此外，高分辨率显微镜可以识别接收细胞并解析摄取机制。

有趣的是，体内内源性释放的细胞外囊泡以及注射到斑马鱼胚胎中的预标记肿瘤细胞外囊泡的很大一部分被尾静脉丛（CVP）摄取。尾静脉丛富含清道夫内皮细胞（SECs），类似于哺乳动物肝脏中的肝窦内皮细胞（LSECs）（图1C）。此外，该血管区域血流动力学较慢，从而促进了细胞外囊泡的停滞。利用斑马鱼模型系统的高时空分辨率，通过使用体内施用的发动蛋白抑制剂和清道夫受体的竞争性抑制剂，进一步证明了这些内皮细胞对细胞外囊泡的摄取可能由清道夫受体以发动蛋白依赖性方式介导。值得注意的是，靶细胞上参与的受体与细胞外囊泡表面特定蛋白之间的相互作用可能导致信号通路的直接激活，并可能严重影响这些细胞外囊泡的命运。实际上，细胞外囊泡亚群可能通过将信号传递给靶细胞质膜上的受体来发挥其主要功能。

这些研究同样表明，存在于尾静脉丛血管腔内的巡逻巨噬细胞能有效摄取细胞外囊泡。这种摄取可能通过丝状伪足“冲浪”和巨胞饮作用（一种动态非依赖性过程，先前在体外已有描述）发生（图1C）。通过遗传干扰受体表达或在体内调节其运输，可以更深入地了解这些过程。最后，由于病理性细胞外囊泡的持续分泌水平导致清除机制的中断或饱和，可能会扩大靶细胞的范围，从而“改变”这些细胞外囊泡的病理作用。在这方面，接近体内生理或病理水平的细胞外囊泡分泌水平可能对于真正理解其意义至关重要。因此，在斑马鱼中进行的高分辨率实时成像有助于进一步揭示细胞类型特异性靶向细胞外囊泡随时间的变化，以及它们在质膜上的停留时间和所涉及的受体的细节。此外，它还允许在体内亚细胞水平上详细分析它们的摄取和运输。

命运：降解、逆融合和信息传递

内化后，细胞外囊泡遵循三种可能的命运：（i）运输至溶酶体——导致其内容物降解/再循环；（ii）细胞外囊泡与晚期内体的限制膜发生逆融合——导致细胞外囊泡货物递送至细胞质和/或将外泌体跨膜蛋白整合到宿主细胞膜中；以及（iii）细胞外囊泡的再分泌（转胞吞作用）（图1C）。或者，细胞外囊泡可以与接收细胞的质膜融合以递送货物，但大多数报告表明在货物递送之前先发生摄取。由于细胞外囊泡在靶细胞中的命运将直接影响其功能，因此实时成像与电子显微镜相结合可以成为进一步解读细胞外囊泡生理学这一方面的有力工具。体内成像可用于通过使用pH敏感和非pH敏感标记物组合标记的细胞外囊泡标记物（例如，pHluorin-CD63-mScarlet ）结合pH敏感性染料（如Lysotracker™ ），或通过先前通过实时显微镜鉴定的接收细胞类型/组织进行免疫电子显微镜，来证明其向晚期内体区室的运输。体内功能性货物递送也可以使用Cre-stoplight系统或通过用其他报告基因调节因子装载细胞外囊泡来进行可视化。

有趣的是，最近一项使用¹³C 标记的同位素标记研究表明，被溶酶体（部分）降解的细胞外囊泡货物可以被细胞重新利用。实际上，正如溶酶体抑制剂巴弗洛霉素-A处理后内皮细胞中YSL外泌体的积累所表明的那样，原位电子显微镜分析显示细胞外囊泡存在于降解区室中。在斑马鱼胚胎发育的背景下，尾静脉丛的内皮细胞对YSL衍生的内源性细胞外囊泡的摄取和溶酶体降解被证明可提供营养支持。即便如此，运输至溶酶体区室可能不仅仅与通过细胞外囊泡降解提供营养支持有关。使用相关光学和电子显微镜（CLEM）证明了内化的细胞外囊泡在巡逻巨噬细胞的晚期内体/溶酶体中积累。这种方法可以在斑马鱼中有效执行，从而揭示与功能性货物转移到接收细胞相关的一些剩余秘密。尽管它们被分选到溶酶体区室，肿瘤细胞外囊泡确实可以诱导巨噬细胞活化，这表明细胞外囊泡信息/内容的转移可能在过程中的某个步骤发生。这种表型转换与肿瘤细胞外囊泡诱导的转移性生长增加相关。同样，在不久的将来，细胞外囊泡的功能影响（扩展到其他生物学问题）可以通过追踪细胞外囊泡摄取和调节后接收细胞的表型变化在斑马鱼中直接评估。

结论

尽管最近取得了重大进展，但外泌体和其他细胞外囊泡在体内的确切相关性仍然不清楚。此外，尽管病理学，尤其是癌症，被广泛研究，但细胞外囊泡在正常生理学中的确切功能仍然难以捉摸（见悬而未决的问题）。解决这些问题需要能够进行细胞外囊泡释放、运输和摄取的高分辨率动态观察的模型系统，以及调节细胞外囊泡释放和靶向的工具。啮齿动物模型尚未适应此类任务，而无脊椎动物模型尽管有其他优势，但大多缺乏类似于人类的循环系统。相比之下，斑马鱼胚胎提供了许多优势，包括发育迅速、成本低、易于遗传修饰、天然透明性——允许非侵入性成像——以及血管网络。通过将高速体内显微镜与电子显微镜分析相结合，它们成功地允许在高的时空分辨率下探测单个细胞外囊泡。我们认为，与高时空分辨率成像兼容的体内方法（目前在斑马鱼胚胎中可行，希望将来在成鱼中也可行）将有助于揭示细胞外囊泡旅程和功能的基本方面。

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