题目：Appendage-resident epithelial cells expedite wound healing response in adult zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39019037/

期刊：Current Biology

研究亮点

• 各向异性细胞迁移实现毫米级伤口的快速愈合

• 鳍驻留上皮细胞（FECs）在受伤时具有高度移动性受伤时

• 鳍结构通过充当大量愈合细胞库来促进伤口愈合

• 细胞外基质 lamb1a 通过促进片状伪足形成来调控鳍驻留上皮细胞

摘要

成年斑马鱼能在数小时内愈合大型皮肤伤口，且几乎不留疤痕。这种快速的上皮再覆盖对于预防感染和启动受损组织的后续再生至关重要。尽管在理解这一过程方面已取得重大进展，但目前仍不清楚如何在机体层面协调数量庞大的上皮细胞，以确保毫米级伤口的及时闭合。本文报道了成年斑马鱼附肢（鱼鳍）在上皮再覆盖过程加速中所起的一项意想不到的作用。通过对活体动物单细胞动态的全身体监测，我们发现鱼鳍驻留上皮细胞（FECs）具有高度移动性，会迁移至覆盖附近身体区域的伤口处。受伤后，鱼鳍驻留上皮细胞可迅速发生器官级别的动员，能在不到8小时内覆盖高达 4.78 平方毫米的身体表面。有趣的是，长期命运追踪实验显示，迁移的鱼鳍驻留上皮细胞在伤口处并非短寿命细胞；相反，这些细胞能在身体表面存活超过一年。我们对“无鳍”和“再生鳍”个体的实验表明，鱼鳍结构不仅能促进快速的上皮再覆盖，还是该过程所必需的。我们进一步发现，鱼鳍富集的细胞外基质层粘连蛋白通过促进片状伪足的形成，推动鱼鳍驻留上皮细胞的主动迁移。这些发现使我们得出结论：具有再生能力的脊椎动物的附肢结构（如鱼鳍），可能具备除作为运动器官之外未被发现的功能。这些附肢还可作为愈合细胞的巨大储备库，加速伤口闭合和组织修复。

图形摘要

引言

像硬骨鱼斑马鱼和有尾两栖动物这类再生能力极强的脊椎动物，在修复大型伤口方面效率极高。严重损伤后仅数小时内，这些动物就能重建皮肤屏障功能，以防止机会性感染和过度炎症；这一过程还有助于在复杂组织受损时启动强效的再生程序且器官受到损伤。1,2 与之形成鲜明对比的是，伤口愈合上皮化过程可能需要数周才能完成在再生能力较弱的动物（如人类和小鼠）体内，这一过程尚未完成。3,4因此，探究高再生能力动物能够快速完成上皮再修复过程的机制与原因，有望为皮肤组织工程、修复与再生领域提供新思路，催生出新的治疗策略。

以成年斑马鱼作为模型系统，Richardson 与 Hammerschmidt 等人的开创性研究表明，斑马鱼体表的毫米级皮肤伤口在受伤后12小时内可有效闭合，几乎无疤痕形成。2,5 进一步研究显示，再上皮化过程依赖转化生长因子β（TGF-β）/整合素以及 Rock/JNK 信号通路的活性，该过程还涉及长距离募集以及上皮细胞发生活跃迁移但无细胞增殖。5,6 这些研究成果确立了成年斑马鱼作为一种可靠的脊椎动物模型，可用于解析快速伤口闭合所必需的复杂细胞动态。然而，要在成年动物身体的大面积区域同时监测单个细胞，相关技术难题阻碍了研究人员精准确定促成毫米级伤口快速闭合的上皮细胞的范围和来源。

在此，我们开发了一个宏观活细胞成像平台，可在单个视场中总共捕捉60,000个表层上皮细胞（SECs）44.22 平方毫米）。利用该平台对不同身体部位的整个上皮再形成过程进行全动物监测，我们首先确定了伤口邻近的表层上皮细胞迁移速度存在差异。出乎意料的是，我们随后发现鳍驻留上皮细胞（FECs）具有高度移动性，无论鳍的类型如何，都会迁移至覆盖近端身体伤口。受伤后，多达55%的鳍驻留上皮细胞会在整个器官层面快速移动，其中部分移动的细胞会侵入邻近身体区域。值得注意的是，这些迁移的鳍驻留上皮细胞在伤口愈合后不会被清除；相反，这些细胞可在占据的身体表面存活1年或更久。通过对无鳍斑马鱼和针对鳍再生的个体，我们确定了提供FEC的鳍在决定伤口闭合速度方面发挥关键作用。我们进一步发现，FEC位于具有独特细胞外基质（ECM）特征的基底膜上。特别是，细胞外基质成分lamb1a的活性通过促使这些细胞形成片状伪足来调控FEC的迁移。综上，我们的研究结果揭示了脊椎动物附肢作为伤口愈合关键调控因子的潜在作用，强调了长距离器官间通讯、细胞外基质成分以及隐蔽细胞库作为加速伤口修复和再生的关键机制的重要性。

结果

对伤口反应的全身监测揭示了各向异性的细胞迁移

成年斑马鱼的皮肤是分层结构，这一点与人类和小鼠皮肤相似，不过其细胞并未角质化形成死细胞第7、8层。相反，斑马鱼皮肤的最外层完全被被SEC覆盖（图1A）。为了捕捉所有可能参与毫米级伤口闭合的SEC，我们利用宏观成像平台检测了Tg(krt4:H2A-EGFP)稳定转基因品系，该品系可特异性标记皮肤细胞的表层⁹。这种方法能够在单细胞水平追踪成年个体所有可见体表的全部SEC群体（图1B和1C）。为了创建大小和深度一致的皮肤伤口，我们开发了一种拔鳞法（详见STAR方法），可从目标解剖部位完整去除皮肤表皮（图1D和1E）。这与以往研究2,5表明，我们确定的皮肤伤口10平方毫米 处的伤口在拔毛后8小时（hpp）便已顺利闭合，形成了完整的上皮屏障，且与伤口位置无关（图S1）。这一闭合过程可能涉及细胞的主动迁移。有趣的是，我们注意到沿四个基本方向（D1-D4；图1E-1I）测量时，伤口部位浸润的表皮角质形成细胞（SECs）的覆盖范围存在一致的差异。在1号区域（R1），来自1号方向（D1）和3号方向（D3）的SECs表现出最显著的前移（图1F和1G；n=8 对应的实验鱼）。同时，在2号区域（R2），来自3号方向（D3）的SECs迁移速度超过了其他所有方向的SECs（图1H和1I；n=8 对应的实验鱼）。值得注意的是，两个区域中来自4号方向（D4）的SECs迁移范围有限，这可能与鳞片的定向倾斜有关（如图1D所示），与此前的研究结果一致。综上，这些观察使我们得出结论：各向异性的细胞迁移而非各向同性的细胞迁移，是成年斑马鱼毫米级伤口及时闭合的原因。值得强调的是，能够对活体成年个体中所有迁移细胞进行同步宏观监测，是我们得以发现这些区域特异性细胞迁移动态的关键技术突破。

图1. 各向异性细胞迁移介导成年斑马鱼毫米级皮肤伤口的快速愈合。（A）示意图展示成年斑马鱼的皮肤表皮。(B) 成年 Tg(krt4:H2A-EGFP) 个体的整体落射荧光图像（拼接图）。白色方框标出了(C)中所示的特定身体区域。比例尺为2毫米。(C) (B)中所示身体区域的整体共聚焦图像。比例尺为200微米。(D) 拔鳞前后皮肤表皮的示意图。黑色箭头表示表皮干细胞（SEC）从前或后方向的迁移范围。值得注意的是，拔鳞方法会造成皮肤伤口，该伤口会破坏整个皮肤表皮及鳞片。(E) 示意图展示接受拔鳞处理的成年斑马鱼身体区域。对于1号区域（R1），从臀鳍的前体连接点开始，沿背腹轴拔去四列鳞片。对于2号区域（R2），拔去位于R1后方的四列鳞片。(F) R1区域拔鳞后的整体落射荧光图像。同一尾鱼分别在拔鳞后0、1和4小时（hpp）拍摄图像。白色实线勾勒出伤口区域；白色虚线显示伤口边缘。黄色箭头表示从四个主要方向（D1、D2、D3和D4）测量的迁移距离。比例尺为2毫米。(G) 拔鳞后4小时，R1区域四个主要方向的伤口边缘向伤口中心的相对推进距离（以百分比表示）；共检测n=8)尾鱼；均值±标准差；双尾非配对Student’s t检验：D1 vs. D3、D2 vs. D3；非参数双尾Mann-Whitney U检验：D3 vs. D4。(H) R2区域拔鳞后的整体落射荧光图像。同一尾鱼分别在拔鳞后0、1和4小时拍摄。比例尺为2毫米。(I) 拔鳞后4小时，R2区域四个主要方向的伤口边缘向伤口中心的相对推进距离（以百分比表示）；共检测n=8)尾鱼；均值±标准差；双尾非配对Student’s t检验：D1 vs. D3、D2 vs. D3；非参数双尾Mann-Whitney U检验：D3 vs. D4。另见图S1。

受伤后表皮深层细胞变得高度活跃

在比较R1和R2区域之间SEC的迁移动态时，我们注意到进展最快的SEC似乎起源于鳍状结构所在的方向（图1F-1I）。因此，我们假设FEC可能直接参与上皮再形成过程。为了清晰地观察FEC的动态变化，我们构建了一个双转基因品系Tg(krt4:H2A-EGFP; krt19:H2A-mCherry)可在多种鳍结构中稳定标记鳍上皮细胞（FEC）群体，包括背鳍、尾鳍、胸鳍、腹鳍和臀鳍（图2A和2B）。值得注意的是，Tg(krt19:H2A-mCherry)品系可同时标记体部和鳍部驻留的基底上皮细胞¹⁰，但由于鳍部驻留基底细胞的荧光信号显著更强，仅该类细胞在宏观尺度下可被清晰识别。与我们的假说一致，我们发现鳍上皮细胞在R1和R2区域均快速浸润邻近的体部伤口（图2D-2I）。至伤后8小时，部分鳍上皮细胞已延伸至伤口边缘外2.24毫米处，在R1受伤的个体中，体表面覆盖区域平均达4.78平方毫米，在R2受伤的个体中平均达1.81平方毫米（每个区域各n=6个个体；图2F和2I）。为确定鳍上皮细胞的迁移范围是否可覆盖与鳍结构非直接相邻的体部伤口，我们在3号区域（R3）开展了鳞片拔除实验（图2J和2K）。值得注意的是，我们观察到鳍上皮细胞向外迁移，覆盖了大面积的体表面，平均覆盖面积达4.25平方毫米（共n=5个个体；图2L），并沿鳞片边缘形成独特的“拉链-斑点”分布模式。有趣的是，无论解剖位置、鳍的类型或个体性别如何，鳍上皮细胞均能浸润体部伤口（图S2）。我们证实，无论是非成对鳍（背鳍、臀鳍和尾鳍）来源的鳍上皮细胞，还是成对鳍（胸鳍和腹鳍）来源的鳍上皮细胞，均能从各自的微环境中迁移出来，覆盖受伤体部的大面积区域（图2E-2I和图S2A-S2F）。此外，我们发现无论体部区域如何，雄鱼和雌鱼的鳍上皮细胞迁移能力均无差异（图S2G-S2J）。综上，这些结果使我们得出结论：无论体部伤口是否与鳍结构相邻，鳍上皮细胞均可快速作为体部伤口的“第一反应细胞”发挥作用。与体部驻留上皮细胞协同，这类细胞能够迁移至体表面的远端区域，以恢复上皮屏障功能。

图2. 鳍驻留上皮细胞具有高度移动性以覆盖邻近的身体伤口。(A) 示意图展示成年斑马鱼鳍结构的皮肤表皮。(B) 成年Tg(krt4:H2A-EGFP; krt19:H2A-mCherry) 鱼的整体落射荧光图像（拼接图）。白色框标出(C)中所示的特定身体区域。比例尺为2毫米。(C) (B)中所示身体区域的整体共聚焦荧光图像。橙色虚线标记鱼鳍与身体的边界。比例尺为200微米。(D) 示意图展示拔鳞后0小时（上图）和8小时（下图）的R1区域（拔鳞后小时数，hpp）。(E) 拔鳞后R1区域的整体落射荧光图像。从同一尾鱼在拔鳞后0、4和8小时拍摄图像。白色实线勾勒出伤口区域，白色虚线显示伤口边缘。比例尺为2毫米。(F) 拔鳞后8小时R1区域中表皮细胞（FEC）的最大迁移距离和占据面积。柱状图上方显示平均值（n=6尾鱼；平均值±标准差）。(G) 示意图展示拔鳞后0小时（上图）和8小时（下图）的R2区域。(H) 拔鳞后R2区域的整体落射荧光图像。从同一尾鱼在拔鳞后0、4和8小时拍摄图像。白色实线勾勒出伤口区域，白色虚线显示伤口边缘。比例尺为2毫米。(I) 拔鳞后8小时R2区域中表皮细胞的最大迁移距离和占据面积。柱状图上方显示平均值（n=6尾鱼；平均值±标准差）。(J) 示意图展示拔鳞后0小时（上图）和8小时（下图）的R3区域。(K) 拔鳞后R3区域的整体落射荧光图像。从同一尾鱼在拔鳞后0、4和8小时拍摄图像。白色实线勾勒出伤口区域，白色虚线显示伤口边缘。比例尺为2毫米。(L) 拔鳞后8小时R3区域中表皮细胞的最大迁移距离和占据面积。柱状图上方显示平均值（in=5尾鱼；平均值±标准差）。另见图S2。

受伤时，FECs 会在全器官范围内发生动员

为确定损伤后可募集的成纤维样上皮细胞（FECs）数量，我们监测了整个鳍条间区域（即#4鳍条间区域；图3A和图3B）沿近-远轴分布的基底上皮细胞数量作为替代指标。值得注意的是，Tg(krt19:H2A-mCherry)品系并非标记所有基底上皮细胞，但会标记鳍鳍条间区域的细胞（图3B）。通过对同一只动物在拔鳞前后的同一鳍条间区域进行成像，我们发现成纤维样上皮细胞（FECs）总数显著减少；在完成上皮再形成过程后，#4鳍条间区域的成纤维样上皮细胞（FECs）数量约减少9%（n=3,681 pm 358)；n=5对应的动物中，该区域细胞数为3362±399个；图3A-3E）。随后我们通过三角测量计算量化了鳍条间区域的细胞间距离，结果进一步显示，这种迁移（跨度为1.49毫米）会影响鳍组织中多达55%的成纤维样上皮细胞（FECs）的相对位置（n=5对应的动物；图3D、3F和3G）。综合受影响细胞的数量和范围，我们得出结论：成纤维样上皮细胞（FECs）介导的伤口修复并非局部反应，而是一种全局性事件，可能涉及邻近附属结构中超过一半的上皮细胞。

为了确定鳍组织如何补充因远端伤口愈合而丢失的细胞，我们在拔鳍后48小时/拔鳍后2天（dpp）进行了全 mounts EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）检测，且我们对整个尾鳍结构的细胞增殖事件进行了评估（图S3）。未拔鳞时，我们在尾鳍表皮上几乎未检测到5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）阳性细胞（图S3A-S3C）。与之形成鲜明对比的是，拔鳞会迅速在细胞迁移发生的鳍区域（1区）诱导细胞增殖（图S3D-S3F）。值得注意的是，增殖细胞可能涉及成年斑马鱼表皮的基底上皮细胞和基上上皮细胞。11 有趣的是，尽管整个器官都发生了细胞动员，但我们发现EdU阳性上皮细胞并未广泛分布。相反，在损伤后2天给予1小时5-乙炔基-2'-脱氧尿苷脉冲后，增殖细胞在鳍沿体鳍边缘的近端侧富集程度最高（图S3D-S3F）。综上，这些发现支持了附肢鳍结构具有强大的自我补充能力，可作为应急伤口修复的大量愈合细胞库的观点。

图3. 伤口愈合时FECs在全器官范围内动员。（A）示意图展示成年Tg(krt19:H2A-mCherry)个体在拔鳞前以及R1区域拔鳞后24小时（hpp）的状态。虚线标记受损区域与未受损区域的边界。品红色箭头指示定量分析所用的参考点。对射线间#4的轴线进行成像，以评估FEC的迁移程度。比例尺，1毫米。（B）拔鳞前全鳍的全 mounts共聚焦图像（拼接）。沿近-远轴分布的基底上皮细胞整体群体。（C）24小时hpp之前及此时射线间区域#4的共聚焦放大图像（拼接并裁剪；应用高斯滤波）。全 mounts共聚焦图像均来自同一只个体。左侧标尺显示距鳍体边界的距离。比例尺，100微米。（D）为确定FEC的迁移程度，通过三角测量法分析24小时hpp之前及此时细胞间距离的变化。品红色（E）24小时后（hpp）之前及此时FEC总数的定量分析（n=5)只动物；平均值±标准差；双尾配对Student’s t检验）。选取射线间区域#4作为代表性样本进行检测。组间比较的百分比差异及对应p值标注于水平线上方。（F）24小时hpp时受损区域的长度（n=5只动物；平均值±标准差）。平均值标注于柱状图上方。（G）24小时hpp时整个#4射线间区域的受损比例（%）（in = 5只动物；平均值±标准差）。平均值标注于柱状图上方。另见图S3。

粪肠球菌在被占据的身体表面可存活一年以上

为确定毛囊上皮细胞（FECs）迁移至身体远端表面后，是否在维持上皮屏障功能方面具有持久作用，我们借助了basebow工具¹⁰对迁移的“非天然”皮肤细胞进行长期命运追踪。简而言之，我们首先在胚胎发育后早期（即受精后4天[dpf]）对基底上皮/干细胞进行了多色细胞条形码标记。随后将斑马鱼饲养至成年（即3月龄），筛选出鳍部结构上带有较大多色表皮细胞斑块的成年basebow斑马鱼（图4A-4C；详细方法见STAR方法）。为了动员FECs，我们制作了一个覆盖R1和R2区域的皮肤伤口。正如预期的那样，在受伤后24小时/1天（24 hpp/1 dpp），我们就轻易检测到了数毫米大小的FECs迁移至身体表面的区域（图4D-4F）。值得注意的是，同一只斑马鱼的同一细胞克隆追踪显示，非原生上皮细胞并未被清除，而是能在占据的体表长期留存，至少可达1年（见图4F中黄色箭头所示的代表性克隆；对三名个体的四个克隆进行了为期1年的追踪），这与长期驻留体表的皮肤克隆特征相似（见图4F中品红色箭头所示；在4个个体中检测到了6个克隆。值得注意的是，尽管在伤后1天（1 dpp），重新定位的鳍表皮细胞（FECs）覆盖了高达58%的伤口区域（图4E），但到伤后14天（14 dpp），我们在这些非原生上皮细胞下方检测到了完整的鳞片再生（图4F和4G）。这一发现表明，非原生的鳍来源细胞在新位置并非无活性，可能参与了鳞片的再生过程再生效果与天然体表皮相似¹²。综合来看，这些为期一年的追踪实验不仅明确证明了鳍上皮细胞确实从鱼鳍迁移至鱼体，还证实这些非天然细胞已在新定居的表面永久存活并发挥自身功能。因此，我们得出结论：迁移的鳍上皮细胞并非短暂存在的细胞群，而是远距离伤口部位的长期守护者。

图4. 鳍上皮细胞未被清除，而是在新占据的体表上长期存活。（A）basebow 中皮肤细胞条形码标记和成像的时间线。Tam 指他莫昔芬；dpf 指受精后天数。(B) 示意图展示了 Tam 处理前后的 basebow 斑马鱼。成年阶段，由于标记的基底上皮细胞增殖，动物呈现出大小可观的多色表皮细胞斑块。(C) 成年 basebow 斑马鱼的整体 mounts 落射荧光图像（拼接）。比例尺为 2 毫米。(D) 示意图展示了拔鳞和成像方案。对动物进行了为期 1 年的监测。dpp 指拔鳞后天数。(E) 拔鳞后1天的毛囊上皮细胞（FEC）占据面积和覆盖率。柱状图上方显示平均值（共 n=4 条斑马鱼；平均值±标准差）。(F) 拔鳞后伤口区域的整体 mounts 落射荧光图像（拼接）。白色实线勾勒出伤口区域。黄色箭头指向不同时间点的同一个皮肤细胞克隆，分别在拔鳞后0、1、14、28、90和360天进行监测。品红色箭头突出显示一个天然驻留于体内的皮肤细胞克隆作为对照。在拔鳞后14天的图像中，蓝色框标注了(F)中所示的身体区域。比例尺为 2 毫米。(G) (E)中拔鳞后14天图像所示身体区域的整体 mounts 落射荧光图像。白色虚线标记了新再生鳞片的后缘。比例尺为 1 毫米。

鳍结构促进上皮快速再生

到目前为止，我们的数据表明，鱼鳍来源的细胞对于实现快速伤口愈合至关重要，因此我们推断，如果该结构不存在，伤口愈合反应应该会受到负面影响。为了验证这一预测，我们利用先前描述的方法培育出了永久性无鳍斑马鱼方法13，随后检测了这些动物的上皮再形成效率。简而言之，我们通过手术切除成年斑马鱼的背鳍和臀鳍，随后持续20毫摩尔羟基脲（HU）处理5天，构建了无鳍斑马鱼。与我们之前的研究结果一致13，HU处理会永久阻断鳍的再生，最终形成稳定的无鳍斑马鱼（图5A和5B）。随后，我们在鳍完整的斑马鱼及其无鳍同窝幼鱼的R1区域进行了刮鳞操作。值得注意的是，我们发现无鳍斑马鱼的伤口愈合效率更低（伤后4小时，上皮再形成面积减少13%；动物编号(n=16；图5C和5D）。此外，我们在天然缺乏邻近鳍的身体区域也观察到了类似的伤口愈合延迟现象（图S4A–S4D）。综上，这些发现支持了鳍结构的存在和/或鳍上皮细胞可显著促进成年斑马鱼的上皮再形成过程。

为了确定鳍结构的引入是否会影响伤口愈合反应，我们利用了一种可再生鳍的鱼类。简而言之，我们通过手术切除成年斑马鱼的背鳍和臀鳍，然后在截肢后1天（dpa）于R1区域进行首次拔鳞。

图5E–5H）。值得注意的是，鱼鳍截肢的残端通常会在数小时内自行闭合¹⁴。鉴于成年斑马鱼能在4周内再生出完整的鱼鳍结构和鳞片，我们在损伤后28天对同一批动物重复进行了拔鳞伤口愈合实验，此时这些动物的受损鱼鳍和鳞片均已完成再生（图5I–5L、图S4E和图S4F）。有趣的是，我们发现鱼鳍结构的再生过程与加速re-epithelialization反应的救援相关联。与“鳍截肢”状态（4 hpp时重新上皮化区域减少12%；图5H）相反，处于指法状态的个体在闭合伤口方面与野生型兄弟姐妹一样高效（每组n=8只动物；图5L）。值得注意的是，无鳍动物能够愈合身体伤口8 hpp（图S4G和S4H）。因此，没有鳍结构并不会阻止伤口愈合，但会导致延迟反应。此外，我们确定长鳍鱼中多余的鳍组织不会进一步增强反应（图S4I-S4L）。这一观察大概反映了这样一个事实，即只有55%的鳍细胞在受伤时受到影响/招募（图3G）。总之，这些发现使我们得出结论，完整鳍结构的存在对于促进快速re-epithelialization既必要又充分。因此，鳍结构是最大限度地降低致命机会性感染风险的关键因素，致命机会性感染可能发生在皮肤屏障功能完全恢复之前的任何时刻。

图5. 鳍状结构促进上皮快速再形成。(A) 展示鳍切除、羟基脲（HU）处理和拔鳞方案的时间线。dpa，截鳍后天数。(B) 野生型（WT）及其无鳍子代的明场整体成像（拼接图）。红色星号标记永久性无鳍鱼中鳍结构的缺失。比例尺，2毫米。(C) 拔鳞后4小时（hpp）R1区域的整体落射荧光成像。白色实线勾勒出伤口区域，白色虚线标注伤口边缘。比例尺，2毫米。(D) 拔鳞后4小时R1区域的伤口闭合率（每组(n=16只动物；平均值±标准差；双尾非配对Student’s t检验）。组间比较的百分比差异和p值标注在横线上方。(E) 展示鳍切除和首次拔鳞方案的时间线。(F) 野生型（WT）及其鳍切除子代的明场整体成像（拼接图）。红色星号标记鳍结构的缺失。比例尺，2毫米。(G) 拔鳞后4小时R1区域的整体落射荧光成像。白色实线勾勒出伤口区域，白色虚线标注伤口边缘。比例尺，2毫米。(H) 拔鳞后4小时R1区域的伤口闭合率（每组(n=8)只动物；平均值±标准差；双尾非配对Student’s t检验）。组间比较的百分比差异和ρ值标注在横线上方。(I) 展示鳍切除和第二次拔鳞方案的时间线。(J) 野生型（WT）及其鳍再生子代的明场整体成像（拼接图）。红色虚线勾勒出鳍结构的再生区域。比例尺，2毫米。(K) 拔鳞后4小时R1区域的整体落射荧光成像。白色实线勾勒出伤口区域，白色虚线标注伤口边缘。比例尺，2毫米。(L) 拔鳞后4小时R1区域的伤口闭合率（每组(n=8只动物；平均值±标准差；非参数双尾Mann-Whitney U检验）。组间比较的p值标注在横线上方。值得注意的是，(E)–(H)和(I)–(L)中描述的拔鳞实验使用的是同一批动物。

外皮细胞以恒定的速度迁移，由片足的形成推动

为了监测FEC从re-epithelialization开始到结束的迁移动态，我们从以前的研究中改编了一个实时成像平台。15,16该平台允许我们在整个re-epithelialization过程中连续跟踪成年斑马鱼表面上的单个FEC（详见图S5和STAR方法）。值得注意的是，我们在Tg（krt19：H2A-mCherry）线上进行了实时成像，以确保FEC群体的明确识别。有趣的是，来自背鳍和肛门鳍的FEC很容易以薄片的形式从鳍中迁移出来，在8小时内保持高达每分钟3.90毫米的恒定速度（n=5动物；图S6AS6D；视频S1）。此外，我们使用Tg（krt19：14本实验揭示了外皮细胞，尤其是基底上皮细胞，在穿过受伤的体表时进行主动爬行（图S6E和S6F；视频S2）。主动迁移是在受伤后几分钟内通过强大的片足形成诱导触发的，片足形成不仅限于前排前导细胞（图S6F；视频S2）。因此，我们推测外皮细胞作为一个群体，可能具有外在和/或内在特征，这些特征交换意见，在组织损伤发生时充当第一反应细胞的内在能力。

层粘连蛋白活性通过促进层脂质体形成来调节FEC迁移

为了确定可能解释FECs行为的解剖学特征，我们对鳍和身体表皮组织进行了免疫荧光分析。这些检查显示FECs位于鳍的射线间和射线区域的厚厚的基底膜上。值得注意的是，基底膜和胶原基质富含胶原蛋白，因此在NHSester（或琥珀酰亚胺酯）染色后两者都显示类似的阳性信号。同时，身体/鳞片常驻上皮细胞并不驻留在类似厚的支撑结构上；相反，这些细胞似乎直接位于钙化骨基质之上（图6A）。对解剖的成人鳍和鳞片组织的RT-qPCR分析进一步揭示基底膜的主要成分在背鳍和肛鳍组织中高度表达，但在鳞片组织中没有。富集因子包括各种ECM组分，如lamb1a、lamc1、col17a1a和fras117-19（图6B；上图）。值得注意的是，鳞片组织中col17a1a和fras1的表达水平太低，无法通过RT-qPCR可靠地检测到（图6B；上图）。与ECM组分的差异表达相比，我们没有检测到参与生物发育和再生的基因的表达差异，例如lef1、ddx52、pola2 和 piezo113,20–22（图6B；底部）。因此，我们的数据表明，在损伤发生前，肠上皮细胞（FECs）和体内常驻上皮细胞位于具有不同分子组成的基质上。

虽然细胞外基质（ECM）成分可作为细胞迁移的支持因子，但近期研究也强调了它们在调控细胞和组织迁移方面的关键作用，尤其是在层粘连蛋白的情况。23,24 为了确定层粘连蛋白的活性为直接探究层粘连蛋白对毛囊外根鞘细胞（FEC）迁移的直接影响，我们采用了lamb1asde1温度敏感型等位基因，该基因可在成年活体斑马鱼中实现对层粘连蛋白活性的实时、暂时性失活¹⁸。值得注意的是，鳍组织中lamb1a的表达水平约为鳞片组织的57倍（图6B）。在R1区域进行拔鳞处理后，我们发现，在允许温度下饲养的sde1杂合子（sde1/+）和纯合子（sde1）同窝个体之间，毛囊外根鞘细胞的最大迁移距离、占据面积和迁移速度均无差异（图6C–6F；视频S3）。  相比之下，我们发现损伤后在限制性温度下立即失活lamb1a，会降低毛囊外根鞘细胞的最大迁移距离、占据面积和迁移速度（图6G–6J；视频S4）。鉴于层粘连蛋白失活对毛囊外根鞘细胞迁移的这种即时效应，我们推测层粘连蛋白活性可能影响迁移细胞的爬行能力。为验证这一可能性，我们通过杂交将Tg(krt19:LifeAct-mScarlet)报告基因导入sde1/+和sde1个体中，从而能够在允许或限制性温度下可视化毛囊外根鞘细胞内的肌动蛋白动态变化。  与毛囊外根鞘细胞在损伤后主动迁移的结果一致，我们在允许温度下的sde1/+和sde1个体中均检测到了片状伪足的形成以及细胞形状的相应相对变化（视频S5；每组n=3个个体；图6K–6M；从代表性视频中选取4个细胞进行观察）。有趣的是，尽管sde1/+个体中的毛囊外根鞘细胞在33摄氏度时表现出更强的活性，但在限制性温度下，sde1个体的毛囊外根鞘细胞中片状伪足的形成和细胞形状变化程度均显著降低（视频S6；每组n=3个个体；图6N–6P；从代表性视频中选取4个细胞进行观察）。这些结果凸显了层粘连蛋白活性在影响鳍驻基底上皮细胞主动迁移方面的特异性。  综上，这些发现使我们得出结论：鳍富集的细胞外基质（ECM）成分，尤其是层粘连蛋白，可能通过赋予毛囊外根鞘细胞自主迁移能力，从而助力其作为伤口主要响应细胞发挥作用。

图6. 细胞外基质成分lamb1a通过促进片状伪足的形成调控FEC的迁移。(A) 成年野生型斑马鱼鳍和鳞片组织的横截面图像。NHS 酯染料对富含胶原蛋白的基底膜和胶原蛋白基质均进行染色（绿色）。茜素红S（ARS）标记钙化骨基质（红色）。DAPI 标记所有细胞的细胞核（白色）。橙色箭头指向覆盖鳍条间区域和骨鳍条区域的基底膜。比例尺，2 毫米。(B) 对基底膜相关基因以及参与机体发育和再生的基因进行RT-qPCR分析（eta=4) 个生物学重复；均值±标准误；双尾非配对Student’s t检验）。AF，臀鳍。DF，背鳍。N.D.，未测定。指定组间比较的P值显示在水平线上方。(C) 示意图展示了拔鳞区域和实验动物。通过杂交将(1a)等位基因引入Tg(krt19:H2A-mCherry)品系，获得sde1杂合子（sde1/+）和纯合子（sde1）实验动物。sde1/+和sde1 实验动物均在允许温度（28℃）下饲养。(D) 4小时后（hpp）R1区域的整体落射荧光成像。白色实线勾勒出伤口区域。比例尺，2 毫米。(E) 4小时后（hpp）R1区域的FEC最大迁移距离和占据面积（In = 5) 只实验动物；均值±标准差；双尾非配对Student’s t检验）。组间比较的p值显示在水平线上方。（F）在2 hpp下捕获的R1区域的全贴装荧光图像。彩色实线是最初位于肛门鳍的三个伤口边缘FEC的迁移痕迹。在每个时间点手动跟踪三个前排前导细胞的迁移，并通过计算平均值来确定速度（顶部；n=4动物；平均值±SEM）。计算40-60分钟后拔毛期间的平均速度，用于两组之间的比较（底部；n=4动物；平均值±SEM；双尾不成对学生t测试）。sde1/+和sde1动物在成像期间都保持在允许温度（28C）。P值显示在水平线上方，用于组间比较。标尺条，2毫米。（g）示意图说明鳞片拔除区域和动物。sde1/+和sde1动物都保持在限制性温度（34C）以灭活层粘连蛋白。(H) 4小时后R1区域的整体落射荧光图像。白色实线勾勒出受伤区域。比例尺为2毫米。（I）4小时每像素（hpp）下R1区域中FEC的最大迁移距离及占据面积（n=5 只动物；平均值±标准差；双尾未配对t检验）。组间比较的百分比差异和p值标注在横线上方。(J) 在2小时后捕获的R1区域整体落射荧光图像。彩色实线是最初位于尾鳍的三个伤口边缘成纤维细胞的迁移轨迹。在每个时间点手动追踪三个前排领头细胞的迁移，并通过计算平均值确定其速度（上图；n=4只动物；平均值±标准误均值）。计算拔毛后40-60分钟期间的平均速度以比较两组（下图；n=4只动物；平均值±标准误均值；双尾非配对Student's t检验）。组间比较的差异百分比和p值显示在横线上方。比例尺，2毫米。（K）示意图展示了拔鳞区域和高速成像设置。成像期间，sde1/+ 和 sde1 型动物均在允许温度（28摄氏度）下维持。（L）以30秒为间隔拍摄的FEC中肌动蛋白动态的代表性延时成像图。黄色实线勾勒出单个迁移的FEC轮廓。品红色虚线标记鱼鳍与身体的边界。比例尺为50微米。(M) 5分钟时间窗内细胞形态的相对变化（n=4细胞；平均值±标准差；双尾未配对Student t检验）（N）示意图展示了拔鳞区域和高速成像设置。在成像期间，sde1/+和sde1型动物均置于限制性温度（34摄氏度）下培养，以抑制层粘连蛋白的活性。（O）30秒间隔下FEC中肌动蛋白动态的代表性延时成像图。黄色实线勾勒出单个迁移的FEC。品红色虚线标记鳍与身体的边界。比例尺为50微米。（P）5分钟时间窗内细胞形态的相对变化（n =4 cells；平均值±标准差；双尾非配对Student t检验）。另见图S5、图S6、表S1及视频S1、S2、S3、S4、S5、S6。

讨论

本研究开发了用于成年斑马鱼伤口愈合反应全身单细胞实时成像的工具与平台。研究结果揭示了鳍结构在支持伤口愈合反应中未被预期的作用。通过对活体动物中源自鳍的全部细胞群进行厘米级追踪，我们明确了这些细胞在参与伤口愈合的范围、方式和持续时间方面的作用，以及它们在加速再上皮化过程中的必要性和充分性。此外，我们还确定了一种特定的细胞外基质（ECM）成分，它是损伤后鳍上皮细胞（FEC）主动迁移的关键促成因子。综上，这些研究结果使我们得出结论：成年脊椎动物的附肢可作为重要且自我补充的修复细胞储备库，助力大面积伤口快速上皮再生，以避免潜在的不良后果。

成鱼的鳍结构主要被视为运动器官，此外还在交流、维持身体稳定以及繁殖过程中发挥额外作用。25–27 在不同鱼类物种中，鳍结构的大小、形状、图案呈现出丰富多样的变化，且解剖位置。28,29 尽管在外观上存在这种多样性两个多世纪以来，硬骨鱼的鳍结构一直被公认为是理解复杂组织再生复杂性的可靠模型³⁰⁻³⁴。由于鱼鳍是一个独立的非生命器官，具有出色的再生能力，因此动物在其他区域急需修复细胞的关键时刻，利用鱼鳍驻留细胞这一资源，似乎是一种高效且巧妙的策略。鉴于皮肤屏障完整性和功能的持续维持对水生动物而言至关重要³⁵，值得探讨的是，鱼鳍的大小和附着位置是否可能影响一个物种对皮肤伤口感染的易感性及其整体疾病抵抗力。此外，我们的研究还提出了一个问题：这一特征是否是成年脊椎动物附肢的进化保守特征，尤其是对于再生能力强大的物种而言具备强大的再生能力和快速的伤口愈合能力，例如蝾螈。

我们的研究发现层粘连蛋白是细胞主动迁移的关键调控因子。具体而言，我们证实实时、暂时性抑制lamb1a的活性足以干扰迁移鳍细胞中片状伪足的形成，从而影响上皮再形成的效率。此前的研究表明，层粘连蛋白在多种果蝇中调控片状伪足的动态、稳定性和持续性，以及组织层面的细胞迁移模型。23,24 我们的研究结果支持层粘连蛋白发挥作用的观点这一作用在脊椎动物中具有保守性，同时也揭示了层粘连蛋白在使细胞预先具备按需迁移能力方面的一种此前未被探索的功能。未来的研究需要明确，当细胞群在不同表面移动时，层粘连蛋白如何维持领头细胞和尾随细胞的持续迁移（图S6；视频S2）。此外，Rab家族GTP酶是否在调节层粘连蛋白的水平、活性及沉积模式方面发挥作用，仍有待进一步探究。进而影响细胞迁移表型。24,38 值得注意的是，考虑到层粘连蛋白复合物的交织特性，我们无法断定LAMB1A是损伤后调控细胞迁移和片状伪足动态的唯一因子。相反，我们认为研究结果表明，细胞外基质成分和/或基底膜主动参与了塑造动物体表细胞和组织修复反应的区域特异性。

随着成年FECs迁移并在远端体表定居，我们惊讶地发现这些细胞具有惊人的长寿性，在某些情况下存活时间远超一年。此外，我们发现这些鱼鳍来源的细胞能轻松适应新角色，发挥体内驻留上皮细胞的功能，通过充当伤口部位的表皮，参与骨质鳞片的原位再生。12 成年斑马鱼体内表皮由多种细胞类型组成，39,40 每种细胞具有不同的功能（例如，黏液细胞负责免疫，离子细胞维持离子平衡，默克尔细胞负责机械感知），且其神经和血管分布极为丰富。41 因此，本研究将进一步值得研究的是，鳍表皮迁移细胞是否确实完全转化为体表皮样细胞。未来的研究有必要探究这些细胞的转化程度，例如它们是否可能获得额外的细胞类型和皮肤功能。还需要更多研究来揭示促成其整合的复杂分子和细胞机制，并确定这些细胞在应对后续损伤时是否会回想起其鳍的起源。尽管本研究的重点是鳍驻留基底上皮细胞，但我们并非意在暗示这些细胞是愈合反应的唯一贡献者。还需进一步研究来确定体驻留上皮基底细胞以及鳍驻留表层和基底上层上皮细胞在支持体伤口闭合方面的相对贡献。

总之，我们的宏观活体成像技术使我们得以发现一类具有自我更新和再生能力的修复性细胞潜在储备库。这些研究结果为存在于约50%脊椎动物物种中的附属器结构赋予了此前未被认知的生理功能⁴²。此外，本研究强调了全身范围内的器官间通讯与协调⁴³的重要性，这是一种高效且具有区域特异性的策略，能够动员大量细胞为紧急的组织修复与再生提供支持。

实验模型详情

使用了3-8个月的成年斑马鱼（斑马鱼），饲养温度为26℃，每升水饲养4-6条。由于雄性斑马鱼体型均一，大多数实验均采用雄性斑马鱼，仅在探究性别对伤口愈合的相关影响时除外（图S2）。使用(Tg(krt4:H2A-EGFP) ^{as67 })标记鳍和鳞片组织中的 SECs。使用9Tg(krt19:H2A-mCherry)as54和Tg(krt19:LifeAct-mScarlet)as56分别标记基底上皮细胞的细胞核和肌动蛋白动态变化[9,14]。实验还使用了lamb1asde1温度敏感型突变体（pd110）、长鳍突变体（lof^{2}）、Tg(krt19:Brainbow (1.0L))以及Tg(krt19:ERT2CreERT2)as66品系斑马鱼。如前所述。10,18,44,45 Tg(krt19:Brainbow 1.0L; krt19:ERT2CreERT2)双转基因动物被称为本研究中进行的所有动物实验均获中央研究院动物护理与利用委员会（IACUC）批准。

方法细节

Basebow 中的 Cre 激活

按照前文所述的方法，通过用他莫昔芬（2毫摩尔；Sigma，T5648）处理4天龄的斑马鱼幼鱼2小时，可瞬时诱导Cre活性。随后，将处理后的幼鱼饲养至成年，用于进行拔鳞实验。

拔鳞法

携带荧光报告基因的成年斑马鱼在含有MS-222（0.4毫克/毫升）的养鱼水中麻醉，直至鳃盖运动变慢。随后，将斑马鱼置于荧光显微镜（徕卡M205）下，以便观察鳞片并进行拔取操作。简要来说，使用手术镊从每个身体区域取下16-20片鳞片。从臀鳍的前体连接点开始拔取四列鳞片，该区域记为R1，拔取方向从腹侧向背侧进行。在R1后方的区域再拔取四列鳞片，记为R2。从同时覆盖R1和R2、但不直接与鳍结构相邻的区域拔取六列鳞片，记为R3。

此外，从R1前方的四列鳞片取自被标记为“无鳍区”的区域。为检测FEC从不同鳍类型的迁移，从尾鳍、胸鳍和腹鳍附近的体表也取下了数量相近的鳞片。完成取鳞操作后，将动物放回鱼水中，使其从麻醉状态中恢复。

成像与显微技术

成像前，所有实验动物均在含三卡因（0.4毫克/毫升）的养鱼水中麻醉，直至完全镇静。细胞成像通过配备高灵敏度sCMOS相机（Leica DFC9000T或DFC7000T）的落射荧光显微镜（Leica M205），或配备25×水浸透镜（HCX IRA PO 25×/0.95）的Leica SP8正置共聚焦显微镜进行拍摄。对于组织学实验（图6A）和单射线间追踪实验（图3），使用配备20×透镜（HCPLAPO 20×/0.75）或10×透镜（HCX PL FLUOTAR 10×/0.30）的Leica SP8正置共聚焦显微镜。对于长期活细胞成像，通过落射荧光显微镜每5分钟拍摄一次，持续8小时。为捕捉片状伪足的实时形成过程，使用了配备Andor Zyla sCMOS相机的Andor/Dragonfly 200转盘共聚焦显微镜（Olympus IX83）。采用10×干燥透镜（UPlanSApo 10×/0.4），每30秒拍摄一次，持续1小时，图像体积为1172×1172×3微米或586×586×3微米。成像载台置于温控箱（OKOLAB）内，温度设定为28℃或34℃。

长期活细胞成像系统

图S5详细展示了我们用于成年斑马鱼的长期活体成像系统。简而言之，使用蠕动泵（YOTEC mini SS80）通过硅胶管（YOTEC；内径1.52 mm，外径3.24 mm）将含三卡因的水（0.2 mg/ml）输送至定制的成像室（90 mm×60 mm×16.5 mm；由阳极氧化铝制成）。新鲜制备的含三卡因流入水储存在置于水浴内的2升塑料容器中，以确保温度恒定在28℃。成年斑马鱼在拔鳞后立即放入成像室中。牢固密封顶盖后，启动蠕动泵，使三卡因水以1毫升/分钟的速率持续流入成像室。值得注意的是，由于出水出口位于成像室底部，会产生吸力，有助于稳定麻醉状态的鱼，以进行长时间的成像。对sde1/+和sde1动物进行成像时，流入水的温度保持在34℃。此外，在成像室下方放置了一个加热器，以确保温度恒定为34℃。该活体成像室与落射荧光显微镜（Leica M205）配合使用，拍摄了图6F、6J以及图S6B–S6D中的图像；以及视频S1、S3和S4。

图像处理与分析

对于所有落射荧光图像，信号采集自17至42个连续的z轴层面，每个层面间距为0.191毫米，在6.65毫米×6.65毫米的区域内覆盖的物理距离范围为3至8毫米。随后使用LAS X软件（徕卡公司）的扩展景深（EDOF）功能对堆叠图像进行处理。选取明场通道的图像作为不同通道对齐的参照。整只动物的图像使用Image Composite Editor（微软研究院）进行拼接。伤口和荧光发射细胞（FEC）占据的区域通过FIJI软件手动测量46。使用多边形选择工具勾勒出伤口边缘和迁移区域，通过直线选择工具测量荧光发射细胞从伤口边缘向迁移前缘尖端迁移的最大距离。为量化四个基本方向的迁移距离（图1），以受伤后0小时（0 hpp）伤口区域的中心点作为参照点。使用线性堆叠对齐插件对长期活细胞成像获得的所有图像堆栈进行对齐。运用Trackmate插件47量化整个鳍条间区域的细胞核数量（估计斑点直径：0.01毫米；阈值设为0.5，亚像素定位）。为进行细胞间距离的三角测量分析，借助FIJI46、CLIJ248,49和MorpholibJ50编写了ImageJ宏程序（详见“数据与代码可用性”部分）。为确定受影响区域的百分比，将第4鳍条间区域受影响部分的长度除以该鳍条间区域的总长度。长度测量基于鳍驻基底上皮细胞沿近-远端轴的分布情况。为量化细胞形态的相对变化，在5分钟的时间窗口内每30秒测定单个细胞的纵横比。简言之，通过在SAMJ-IJ Fiji插件中实现的“分割一切模型”（Segment Anything Model）51来识别细胞边界，随后利用FIJI软件47内置的测量功能计算细胞纵横比。以5分钟时间窗口内最大值与最小值的差值作为细胞形态相对变化的评估指标。

运动轨迹图与迁移速度分析

延时图像经裁剪以突出迁移区域。随后，手动调整图像对比度以增强迁移前沿的清晰度。裁剪后的图像经重新切片，并使用 ImageJ 进行最大强度投影以生成运动轨迹图。运动轨迹图的横轴和纵轴分别对应 5 分钟/像素和 3.25 毫米/像素。通过拟合线追踪迁移前沿的进展，以计算FEC的迁移速度（图 S6B–S6D）。另一种方法是，使用 ImageJ 在每个时间点手动追踪前排三个领头细胞的迁移情况，并计算平均值以确定迁移速度（图 6F、6J；视频 S3、S4）。

钙化骨基质、基底膜和胶原基质的组织学与染色

鱼的中部区域（包括背鳍、鳞片和臀鳍）被切除，按照前述方法进行固定和染色¹⁰。茜素红S（Sigma A5533）用于标记钙化骨基质。Alexa Fluor 488 活性酯（Invitrogen, A-20100）用于染色富含胶原蛋白的基底膜和胶原蛋白基质⁵²。简而言之，将1毫克活性酯溶解在62毫升二甲基亚砜（DMSO）中，制备25毫摩尔/升的储备液。将该储备液与等体积的0.1摩尔/升(NaHCO_{3})磷酸盐缓冲液（PBS，pH 9.0）混合，得到染色液。向每片经PBS冲洗的组织切片中加入1毫升染色液，在室温下处理5分钟，随后用PBS洗涤六次，每次5分钟。之后，将样品置于0.01%茜素红S溶液中，于室温避光条件下孵育10分钟，随后用PBS洗涤四次，每次持续5分钟。细胞核用含DAPI的PBS染色5分钟，再用PBS洗涤三次，每次持续5分钟。最后，将样本置于Fluoromount-G中封片用于成像。

RT-qPCR

收集5个个体的尾鳍、背鳍和鳞片，使用组织研磨仪II（凯杰公司）在1毫升Trizol试剂（西格玛公司，货号：T9424-200ML）中进行匀浆处理。采用逆转录-聚合酶链式反应第一链合成系统（英潍捷基公司，货号：18080051），从1至3毫克RNA中合成互补脱氧核糖核酸。按照罗氏LightCycler 480仪器制造商的说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应实验。引物序列见表S1。每个样本均进行四次生物学重复和三次技术重复检测。采用2^(-ΔΔCT)法分析结果，以核糖体蛋白L13a互补脱氧核糖核酸的表达水平作为内参对照。

EdU 检测

为检测增殖细胞的数量，按照文献所述方法进行了EdU检测实验¹⁰。简要来说，向麻醉状态下的斑马鱼体内注射10微升EdU溶液（赛默飞世尔科技；货号：A10044；磷酸盐缓冲液中浓度为10毫摩尔），使其在鱼体内停留1小时后，再对鳍组织进行固定。将完整的臀鳍用4%多聚甲醛固定，随后用PBST洗涤，并用甲醇进行脱水处理。次日，用梯度甲醇溶液对样本进行复水处理，持续15分钟，再用PBST洗涤三次，每次5分钟。接着，将样本置于EdU染色液〔1毫摩尔硫酸铜、50毫摩尔抗坏血酸、100毫摩尔Tris缓冲液（pH 8.0）〕和10毫摩尔Alexa Fluor 488叠氮化物（赛默飞 Invitrogen；货号：A10266）的混合液中，于室温避光条件下孵育30分钟，之后用PBST洗涤三次。最后，将组织样本放置于Fluoromount-G封片剂中，用于共聚焦显微镜观察。

“无鳍鱼”的构建

为了生成永久的“无鳍”鱼，使用剃须刀片截断成年斑马鱼的背鳍和肛门鳍，并让动物恢复1天。然后将截肢的动物置于20mM羟基脲（Sigma-Aldrich，H8627）溶液中连续5天，如所述。13只没有截肢鳍的野生型兄弟姐妹被保持在与对照相同的条件下。治疗5天后，所有动物进行三次5分钟的洗涤。然后两组都返回系统进行7天的恢复，然后进行拔鳞实验。

亚甲基蓝染色

将动物置于含有2%亚甲蓝（Sigma M9140）和0.2毫克/毫升三卡因的5毫升鱼水中，在室温下浸泡3分钟。该方法改编自先前的研究²。随后，让动物恢复，并在鱼水中进行三次冲洗，每次持续3分钟。使用落射荧光显微镜（Leica M205）在背光照明下拍摄染色后的鱼的图像。

定量与统计分析

使用GraphPad Prism 9进行统计分析。除非另有说明，否则所有统计数据均显示为均值和均方差。使用D'Agostino-Pearson检验对具有足够n的组的数据点进行高斯分布检验。如果数据点呈正态分布，则使用双尾配对或非配对学生t检验进行两组比较。如果数据不呈正态分布，则使用非参数双尾Mann-Whitney U检验。统计参数列在图中或相应的图例中。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。