标题：Linking Virus Discovery to Immune Responses Visualized during Zebrafish Infections

期刊：Current Biology 

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.04.031

研究亮点

转基因isg15:GFP斑马鱼可实现抗病毒免疫活性的可视化

该报告的自发激活促成了一种小核糖核酸病毒的发现

斑马鱼小核糖核酸病毒广泛存在于RNA测序数据中，并能引发免疫反应

该感染可通过水平传播，且适用于实验操作

摘要

目前新病毒的发现速度超过了我们对感染生物学进行实验研究的能力。为了更好地将病毒发现与免疫学相结合，我们对斑马鱼进行了基因改造，以可视化方式报告病毒感染情况。我们构建了一株在干扰素刺激基因启动子下表达绿色荧光蛋白（GFP）的品系后，反复观察到转基因幼鱼在孵化数天后会自发表达GFP。对同笼饲养的GFP阳性和GFP阴性斑马鱼进行的RNA测序分析发现了一种天然存在的小核糖核酸病毒，该病毒能诱导典型的干扰素介导反应以及数百种抗病毒防御基因，而这些基因在免疫刺激处理或其他病毒的实验感染中均未被观察到。在小核糖核酸病毒诱导的众多基因中，有一大类编码免疫相关蛋白鸟苷三磷酸酶（GTPase）（GIMAPs）的基因。GIMAP基因家族在鱼类基因组中发生了大规模扩增，且可能在包括人类在内的哺乳动物的抗病毒反应中也发挥关键作用。我们随后在多个研究机构看似无症状斑马鱼的公开测序数据中检测到了斑马鱼小核糖核酸病毒，并发现在以往一项斑马鱼发育研究中，该病毒改变了基因表达。实验揭示了该病毒的水平传播方式，这为研究小核糖核酸病毒在个体内部及个体间的传播提供了一个新系统。本研究发现了一种能在斑马鱼中引发强烈抗病毒反应的天然小核糖核酸病毒，并为同时发现病毒及其对脊椎动物宿主的影响提供了新策略。

图文摘要

引言

据估计，在大多数环境中，病毒的数量超过其细胞宿主，这表明动物会定期接触并与病毒发生相互作用。通过对动物粪便和组织进行宏基因组测序实现的病毒发现成果广泛且成效显著，这也证明了病毒的普遍存在。尽管对动物病毒流行率的调查能够揭示二者之间的密切关联，但大多数宏基因组病毒发现研究并未明确病毒与动物之间的相互作用方式，甚至无法确定二者是否存在相互作用。对患有不明疾病的动物开展宏基因组研究，发现了多种新病毒，从而证实了病毒与宿主之间极有可能存在关联。然而，在无症状宿主中也频繁检测到病毒，这一现象表明，仅有少数病毒与宿主的相互作用会引发严重的疾病表型。

病毒与动物之间大多数具有重要意义的相互作用都涉及宿主的免疫反应。因此，一种用于发现具有明确宿主相互作用的未知病毒的灵敏策略，是筛选抗病毒免疫反应的激活情况而非显性疾病。适用于越来越多实验可研究生物的遗传工具。此外，在研究生物中开展病毒发现有望开发出研究宿主-病毒相互作用的新易处理系统，这一点已通过在蠕虫、果蝇和小鼠中应用宏基因组学方法得到证实。

脊椎动物中的病毒发现工作主要集中在哺乳动物身上，但近期大范围的宏基因组学研究表明，鱼类感染着一组种类繁多、高度重叠的病毒科。因此，在鱼类中发现的病毒，能够揭示病毒与宿主生物学中在更广泛的进化历史阶段共有的特征，这一进化历史跨度远超传统认知。此外，增加对鱼类相关病毒的认知，是完善海水和淡水养殖体系的重要目标，而养殖体系正日益成为应对新兴粮食供应挑战的核心环节。

斑马鱼是用途广泛的研究模式生物，可用于实验感染来自异源鱼类和哺乳动物的病毒。斑马鱼幼体大多透明，能够在活体转基因动物中直观观察抗病毒免疫反应。研究人员已从患病的成年斑马鱼体内检测到两种天然存在的病毒设施以及宠物贸易中，且近期又从一名无症状成年个体中发现了第三种病毒。这些发现表明，即便在研究设施等精心维护的环境中，斑马鱼也可能与病毒频繁接触，而这种接触可能会诱导宿主产生抗病毒信号通路。

为推动将免疫反应可视化作为病毒发现的工具，我们培育了可报告抗病毒干扰素信号通路的转基因斑马鱼。在研究设施的常规饲养过程中，我们观察到斑马鱼幼鱼中出现了看似自发的报告基因诱导现象。通过RNA测序，我们在表现出抗病毒免疫反应的斑马鱼体内发现了一种小核糖核酸病毒，该病毒与发现时已知的所有其他小核糖核酸病毒亲缘关系均较远。在研究设施之外，我们在全球多家研究机构饲养的斑马鱼的RNA测序数据集中也发现了该病毒的序列读数。其中最值得注意的是，在近期采集的野生斑马鱼数据集里检测到了该病毒匹配序列，而在一个克隆实验室品系（CG2）中检测到了高丰度的小核糖核酸病毒，这表明该病毒可感染自然宿主和免疫缺陷宿主。最后，我们将病毒载量分析与此前未被发现的显著宿主基因表达变化关联起来，这些变化在看似无症状的宿主中以抗病毒免疫反应相关基因的富集为特征。

结果

斑马鱼幼鱼中干扰素反应的自发诱导

我们构建了可报告干扰素信号的转基因斑马鱼，以在活体动物中可视化抗病毒免疫反应。干扰素是一类信号蛋白，可诱导数百种基因的表达，这些基因统称为干扰素刺激基因，其编码产物是脊椎动物主要的抗病毒免疫防御力量。我们从斑马鱼干扰素刺激基因15（isg15）中克隆出3.4千碱基对的启动子，将其置于绿色荧光蛋白（GFP）编码序列的上游；该构建体还能驱动心脏中GFP的组成型表达，并通过Tol2转座子介导的转基因技术整合到斑马鱼基因组中（图1A）。与其他脊椎动物一样，斑马鱼isg15启动子中含有被称为干扰素刺激反应元件的调控性转录因子结合基序[24]。为检测isg15:GFP转基因动物对干扰素的反应性，我们将I型干扰素（ifnf1）的编码序列克隆至表达质粒中（图1B），并将该构建体注射到转基因动物体内。大多数未处理的动物仅在心脏中检测到GFP表达，这证实其携带转基因插入片段（图1C）。相比之下，超过80%注射了干扰素质粒的动物广泛表达GFP（图1D；视频S1），表明isg15:GFP转基因动物可直观反映抗病毒免疫信号的激活情况。

我们惊讶地发现，一些未注射的 isg15:GFP 转基因鱼在多个组织中自发表达绿色荧光蛋白受精后8天（8 dpf）时，这种情况在共享环境中不同批次的动物中通常以低频率出现（图1E）。多个独立批次间的自发表达分布偏向低频率，但差异显著（图1F）。isg15:GFP 转基因鱼的绿色荧光蛋白（GFP）自发表达在暴露于环境的组织中最为明显，尤其是肠道和其他上皮表面（图1G）。

图1. 报告干扰素信号的转基因斑马鱼中诱导型与自发型绿色荧光蛋白表达。（A）利用携带isg15启动子的Tol2转座子构建体生成了转基因动物，该启动子与GFP编码序列融合，且反方向带有心脏特异性（cmlc2）转基因标记。（B）用于在斑马鱼中驱动I型干扰素表达的构建体示意图，其中干扰素f1（IFNf1）由CMV启动子驱动。（C）8天胚胎期（dpf）未处理的isg15:GFP斑马鱼。（D）8天胚胎期（dpf）经IFNf1处理的isg15:GFP斑马鱼。（E）未处理的isg15:GFP斑马鱼幼虫培养皿示意图，其中观察到自发的GFP表达。（F）独立批次的isg15:GFP斑马鱼中观察到自发GFP表达的频率。每个点代表一个批次中自发表达GFP的幼虫百分比。（G）8天胚胎期（dpf）自发表达GFP的未处理isg15:GFP斑马鱼。所有显微镜图像均为共聚焦Z-stack的最大强度投影。比例尺为500微米；dpf指受精后天数。另参见视频S1和表S4。

isg15:GFP 动物将病毒发现与广泛的宿主抗病毒反应关联起来

我们推测，在isg15:GFP转基因斑马鱼中观察到的绿色荧光蛋白（GFP）自发表达现象反映了病毒感染的情况。为鉴定潜在病毒，我们从GFP阳性、GFP阴性的isg15:GFP转基因斑马鱼以及野生型（WT）斑马鱼中分离RNA，进行了RNA测序（RNA-seq），共获得约1.75亿条测序读段。我们将未比对到斑马鱼基因组的读段组装成约75万个更长的重叠群，并通过核苷酸或氨基酸序列相似性搜索的最佳匹配结果，为每个重叠群分配了初步的物种分类。这些重叠群中大部分（92%）与斑马鱼序列的相似性最高（图S1），显然是在比对过程中作为单个读段未能成功比对到斑马鱼基因组所致。与细菌序列相似的重叠群大多来自已知为斑马鱼微生物组组成成分的菌属。5%的重叠群长度较短（150个碱基对）且高度重复，与任何已知序列均无显著同源性。有一个长度为1182个碱基对的重叠群，与轮状病毒2的解旋酶具有33%的氨基酸同源性（E值(5 ×10^{-40})），轮状病毒2是一种小核糖核酸病毒。从人类体内分离得到。没有其他重叠群与已知的外源性病毒存在显著相似性。

我们利用与轮状病毒2型相似的重叠群序列，设计了cDNA末端快速扩增（RACE）实验，以自发绿色荧光蛋白（GFP）阳性的isg15:GFP动物的cDNA模板开展实验。我们利用获得的序列组装出一个约8千碱基对（kbp）的非分节段正链RNA基因组（GenBank登录号：MN524064），该基因组编码的多聚蛋白具有小核糖核酸病毒的特征（图2A）。5'非翻译区（5' UTR）的序列显示存在强烈的局部二级RNA结构的证据。在5'非翻译区中预测到一个内部核糖体进入位点（IRES），但未观察到该区域与其他小核糖核酸病毒内部核糖体进入位点元件存在序列相似性。该病毒的结构基因和部分非结构基因与其他小核糖核酸病毒存在序列相似性，但其基因组的部分区域与任何已知序列均无显著的核苷酸或氨基酸序列相似性，且缺乏可识别的蛋白质结构域。这些观察结果表明，我们从isg15:GFP动物体内分离出的病毒与已知的小核糖核酸病毒亲缘关系较远。

在完成上述序列分析后，另一项研究发表了一种小核糖核酸病毒的序列，该序列是通过对无症状成年斑马鱼肠道中富集的病毒衣蛋白保护核酸进行宏基因组测序获得的[22]。该研究的作者将此病毒株命名为斑马鱼小核糖核酸病毒（ZfPV），其核苷酸序列与我们从isg15:GFP幼虫中组装的病毒序列同源性达97%。为保持一致性，本研究中将该小核糖核酸病毒也称为ZfPV。

为评估ZfPV与小核糖核酸病毒科其他成员的进化关系，我们开展了系统发育分析，纳入了所有已批准的小核糖核酸病毒属至少一个物种，以及所有已从鱼类中分离得到的小核糖核酸病毒的可用序列（图S2）。贝叶斯法和最大似然法构建的系统发育树结果基本一致（图S3A、S3B）。我们发现了一个似乎为鱼类特有的大型病毒分支，该分支不包含ZfPV。ZfPV则属于一个感染其他多种脊椎动物类群的病毒分支。系统发育树中病毒与宿主类群之间存在的不一致实例，与病毒宿主转换的模式相符，此前研究已估计到这种转换在小核糖核酸病毒进化中频繁发生。在本系统发育分析中，温岭三棘蜥鱼小核糖核酸病毒是ZfPV的姐妹种，但二者在3CD（成熟3C蛋白酶和3D聚合酶的前体）的成对序列比对中仅共享36%的氨基酸同一性，因此二者亲缘关系仅为远缘（图S4）。总体而言，这些观察结果表明ZfPV与目前已知的其他小核糖核酸病毒存在高度的序列分化。

我们生成的RNA测序数据集，是从同笼饲养的isg15:GFP转基因幼鱼以及非转基因同窝幼鱼中制备的；这些幼鱼在样本采集时分为绿色荧光蛋白（GFP）阴性（包含转基因和非转基因两种幼鱼）和GFP阳性（仅为转基因幼鱼）两类。为评估本实验中isg15:GFP报告基因的特异性，我们对两组样本中的病毒测序读段数量进行了定量分析。仅GFP阳性的数据集中检测到了斑马鱼PV（ZfPV）测序读段（图2B），这表明isg15:GFP报告基因的诱导表达与病毒测序读段的存在呈正相关。这种清晰的分组特征为我们提供了独特的研究契机，即利用发现ZfPV的同一批RNA测序数据集，同时探究宿主对感染斑马鱼的天然病毒所产生的潜在应答反应。我们鉴定出超过500个宿主基因（经校正后，校正值为(p<0.05)）与ZfPV阴性的动物相比，ZfPV阳性的isg15:GFP动物中该基因的表达水平至少被诱导了2倍（图2C；表S1）。在ZfPV阳性动物中被诱导的基因里，富集最显著的功能类别与干扰素信号传导及抗病毒防御反应相关（图S4）。这些结果表明，除了isg15:GFP与病毒信号的相关性外，与ZfPV阴性幼虫相比，ZfPV阳性幼虫还表达了一套广泛的抗病毒基因。

接下来，我们研究了与自然存在的斑马鱼乳头瘤病毒（ZfPV）序列相关的宿主反应，与实验性给予干扰素或病毒诱导的转录变化进行了对比。此前的一项RNA测序研究发现，斑马鱼幼体在注射干扰素蛋白或人类病原体基孔肯雅病毒后，会表达许多基因。我们发现，ZfPV感染会诱导130个基因的重叠表达集，但同时也会诱导数百个未被这两种实验处理中的任何一种所诱导的基因（图2D；表S2）。这些对比揭示了斑马鱼中一套共有的抗病毒反应基因，并表明自然存在的病毒与一种特定的基因表达特征相关，而这种特征此前未被异源病毒的实验感染或干扰素处理所捕捉到。

图2. 从斑马鱼幼虫中测序得到的一种天然存在的小核糖核酸病毒诱导广泛的抗病毒免疫反应。(A) 斑马鱼小核糖核酸病毒 (ZfPV) 的基因组组织。基因组的非翻译区域用线条表示。上面的示意图表示 UTR 中的二级结构，具有基于最小自由能预测的高碱基配对概率。预计 5' UTR 包含内部核糖体进入位点 (IRES)。编码区域被描绘为方框。虚线表示多蛋白内的大致切割位置。灰色区域缺乏可识别的蛋白质结构域结构，并且与任何其他生物体不具有序列相似性。其他颜色表示与其他小核糖核酸病毒具有同源性的区域。框中的名称是基于与其他小核糖核酸病毒蛋白的相似性，或者是基于小核糖核酸病毒基因组结构的保守性质推断。方框下方的数字指的是核苷酸位置。(B) 用于识别 ZfPV 的 8 dpf RNA-seq 样本中的标准化病毒计数。样品是根据 isg15:GFP 报告基因的自发表达来定义的。只有 GFP 阳性动物才含有病毒读数。 (C) 与 GFP 阴性动物相比，自发表达 GFP 的相同 isg15:GFP 动物中的差异基因表达。差异表达超过 2 倍且调整后 p < 0.05 的基因以红色绘制。诱导基因的子集被标记。 (D) 与自然发生的 ZfPV 感染相比，实验施用的干扰素或基孔肯雅病毒 [27] 响应的基因表达。 971 个基因在至少一种条件下被显着诱导，调整后的 p < 0.05。

ZfPV诱导的GIMAP在鱼类中扩增并在人体中受干扰素调控

我们在ZfPV诱导的基因中观察到干扰素信号通路和抗病毒免疫相关的基因显著富集（图S4），因此我们通过评估InterPro蛋白结构域的占比来探究这些基因的功能潜力。我们发现免疫相关的NACHT结构域和富含亮氨酸重复序列（NLR）蛋白大家族成员的富集程度最高（表S3）。斑马鱼中存在300多个NLR基因，此前被推测在病原体识别和炎症小体活性中发挥作用。

有趣的是，我们观察到在ZfPV诱导的基因中，GTP结合的avrRpt2诱导基因1（AIG1）结构域（InterPro：IPR006703）显著富集，并且在我们对ZfPV感染斑马鱼的分析中发现，斑马鱼基因组（Ensembl版本98）中包含该结构域的100多个基因里有15个被显著上调（表S1）。AIG1结构域存在于免疫相关蛋白的鸟苷三磷酸酶（GTPase）（GIMAPs）中，该蛋白由人类基因组中的8个基因编码。我们调查了Ensembl数据库中所有脊椎动物基因组里含AIG1结构域的基因组成，发现与其他脊椎动物类群相比，鱼类中的GIMAP基因发生了显著扩张（图3A）。这些模式表明，斑马鱼中GIMAP的大规模扩张是一种进化创新，可能对鱼类及其他物种的抗病毒反应至关重要。

已知 GIMAP 可调控哺乳动物淋巴细胞的发育和存活，但其在抗病毒免疫中的其他作用此前尚未被探究。病毒感染诱导斑马鱼幼体中 GIMAP 的表达，这表明 GIMAP 基因可能是干扰素可诱导 GTPase 效应基因超家族的一个独特分支，该超家族在细胞自主免疫中发挥作用。对该超家族中斑马鱼和小鼠蛋白的 GTP 结合结构域进行系统发育分析，不仅揭示了各亚家族之间的清晰分离，还发现斑马鱼黏液瘤病毒抗性（Mx）和超大诱导型 GTP 酶（VLIG）干扰素可诱导亚家族发生显著扩张（图3B）。此外，我们在 Interferome 数据库[35]中查询了人类 GIMAP 的表达情况，发现多种细胞类型对干扰素处理均有显著应答反应（图3C）。这些研究结果表明，GIMAP 基因的大规模扩张是鱼类特有的，但这些基因可能编码抗病毒效应分子，在人类中也同样执行细胞自主免疫功能。

图 3 由 ZfPV 诱导、受干扰素调控的免疫 GTP 酶超家族 —— 庞大的 GIMAP 基因家族是宿主抗病毒应答的核心组分。(A) Ensembl 中代表的所有脊椎动物基因组中 GIMAP 基因的数量。蓝色分支表示不包含任何具有 AIG1 结构域的基因的谱系。所有其他谱系都至少包含一个 GIMAP 基因，其数量按红色强度缩放。每个脊椎动物组内所有物种中鉴定出的 GIMAP 基因的中位数显示在组名称旁边。(B) GIMAP 蛋白的 GTP 结合域以及斑马鱼（紫色分支）和小鼠（绿色分支）的干扰素诱导型 GTP 酶超家族蛋白的最大似然系统发育。包括免疫相关蛋白 GTP 酶 (GIMAP)、超大诱导型 GTP 酶 (VLIG)、免疫相关 GTP 酶 (IRG)、粘液瘤抗性 (MX) 和鸟苷酸结合蛋白 (GBP) 亚家族所有成员的结构域。 RAS GTPase 家族（橙色）作为外群包含在内，不受病毒感染或干扰素表达的调节。 Bootstrap 支持值显示在通向每个子族的分支上。规模是每个站点的估计替代量。(C) 与未处理的对照相比，经干扰素处理的细胞中人类 GIMAP 基因的表达，由 Interferome 数据库编译[31]。中位倍数变化是根据治疗后的所有组合时间点绘制的，其中可以获得多个时间点的数据。

ZfPV 广泛存在且会改变序列读 archive 中的基因表达

我们在数月时间内，对多批独立的isg15:GFP转基因斑马鱼幼鱼进行观察，发现其绿色荧光蛋白（GFP）会自发表达（图1F），这表明斑马鱼痘病毒（ZfPV）是我们研究机构的地方性病毒。我们通过在序列读 archive（SRA）数据库的726个斑马鱼RNA测序数据集中检索ZfPV序列，调查了ZfPV在其他研究机构的流行情况，发现有92个数据集包含ZfPV序列（表S5）。我们在通过polyA+富集、核糖体RNA（rRNA）去除或随机引物扩增构建的测序文库中均检测到了病毒序列。检索结果显示，ZfPV在全球各地的研究机构中广泛存在（图4A）。在来自不同饲养地点的多种斑马鱼品系的RNA测序数据集中，我们均检测到了ZfPV序列。我们特别关注到，在一个名为阿萨姆（Assam）斑马鱼品系的数据集（SRR891512）中检测到了ZfPV序列；该品系似乎是近期从印度东北部的自然栖息地捕获，或由野生个体直接繁育而来[36,37]。在该数据集中检测到ZfPV序列，支持了ZfPV也会在自然栖息地感染斑马鱼的可能性。

我们在来自斑马鱼多种不同组织的RNA测序数据集中鉴定出了ZfPV，这使我们能够评估该病毒的组织嗜性。肠道中的病毒读数数量最多（图4B），这与互补原位杂交分析结果一致，表明斑马鱼乳头状瘤病毒（ZfPV）可能主要是一种肠道病毒。然而，我们还在其他几种组织的数据集中检测到了斑马鱼乳头状瘤病毒（ZfPV）读数，包括鳃、皮肤等环境暴露组织，以及大脑等内部组织。相比之下，在卵或睾丸的数据集未检测到病毒读数。

斑马鱼数据集里ZfPV的广泛存在表明斑马鱼普遍受到感染。为了评估ZfPV在斑马鱼之外的潜在宿主范围，我们在序列读 archive（SRA）中所有鱼类肠道组织的可用数据集里搜索了ZfPV，这些数据集包含来自100多种鱼类的775个RNA测序数据集，且未在这些宿主中发现ZfPV存在的证据（图S5），这说明在序列读 archive（SRA）目前收录的所有鱼类中，ZfPV仅存在于斑马鱼的测序数据集中。

我们在多种既往发表的RNA测序数据集中鉴定出斑马鱼病毒（ZfPV）序列后，不禁提出疑问：在这些研究中，病毒的存在是否会改变斑马鱼的基因表达。为了将我们对isg15:GFP转基因斑马鱼中ZfPV诱导基因的分析拓展至既往未发现病毒存在的鱼类相关RNA测序数据集，我们筛选了那些生物学重复中ZfPV存在情况存在差异的数据集。我们找到了一项发育时间进程研究的数据集（生物项目编号PRJEB12982），该数据集包含多个5天胚胎期（dpf）的重复样本，这些样本的ZfPV存在情况各不相同；并鉴定出一小部分基因，在ZfPV阳性重复样本中的表达水平显著高于ZfPV阴性重复样本（图4C）。在5天胚胎期幼鱼中被ZfPV显著诱导的13个基因中，有12个也在ZfPV阳性的8天胚胎期isg15:GFP转基因幼鱼中被诱导（图4D）。此外，这些基因在感染致病菌海分枝杆菌的5天胚胎期幼鱼中均未出现显著诱导表达的情况（图4D；生物项目编号PRJNA398644），因此它们构成了斑马鱼对病毒感染的特异性反应。这些发现揭示了RNA测序数据中ZfPV感染的特征，并凸显了这种广泛存在的病毒如何影响斑马鱼基因表达研究的一个虽不显著但具有特异性的实例。

图4. ZfPV 在公开可用的RNA测序数据集中广泛存在并改变斑马鱼基因表达。表达差异大于2倍的基因（A）向序列读取档案库（SRA）提交斑马鱼RNA测序项目的机构位置，这些项目包含来自斑马鱼弹状病毒（ZfPV）的读取序列。红点表示在SRA中检测到ZfPV读取序列的位置。蓝点表示本研究的位置，即ZfPV首次被发现的地方。紫点表示近期一项同样发现ZfPV的研究的位置[22]。圆点旁的名称为测序所用斑马鱼品系。（B）从SRA中成年组织样本里检测到的ZfPV读取序列数（经文库大小标准化）。每个圆点代表一个单独的测序样本。图下方标注了包含ZfPV读取序列的SRA样本百分比，以及各组织的总检索样本数。（C）对比生物项目PRJEB12982中含ZfPV读取序列的5天龄（dpf）重复样本与不含ZfPV读取序列的重复样本的基因差异表达情况。经校正后表达倍数大于2倍的基因以红色标注。（D）对比8天龄幼虫（白色圆圈，本研究）、5天龄幼虫（蓝色圆圈，[38]）中ZfPV诱导的基因集与感染情况，以及5天龄幼虫（灰色圆圈，[39]的SRA读取序列）中由海分枝杆菌诱导的基因集。另见图S5和表S5。若基因在感染条件下的表达倍数经校正后大于2倍，则将其定义为诱导表达基因。

CG2 斑马鱼品系的 ZfPV 水平高于蒂宾根动物

在我们对斑马鱼痘病毒（ZfPV）的调查中，来自生物项目PRJNA280983的两个序列读 archive（SRA）数据集表现突出，因为它们包含的病毒读数量异常之多（图5A）。这些数据集源自斑马鱼克隆CG2株，未在图4B中绘制，因为它们是从成年组织混合物中获得的。CG2株与图宾根（Tu¨b）株及其他野生型（WT）品系在遗传上存在差异，具体表现为CG2个体携带一种不同的主要组织相容性复合体（MHC）单倍型，此前有研究预测该单倍型会导致其免疫相关表型存在差异。当我们将这两个CG2来源数据集的读序列与斑马鱼痘病毒基因组进行比对时，我们获得了覆盖度接近1653倍的完整基因组序列（图4A；GenBank：BK011179）。

与CG2数据集相比，我们在SRA中查询的大多数RNA-seq数据集，其ZfPV读数相对于总数要么极少，要么没有（图4B）。这一观察结果是考虑到所有这些数据集的生成都是为了研究宿主基因表达，而且在用于宏基因组测序的脊椎动物总RNA中，病毒RNA通常只占极小的比例，这或许并不令人意外。为了说明即便是在……中病毒读数的相对稀缺性在ZfPV信号最高的组织中，我们合并了所有12个来自Tübingen（Tu¨b）斑马鱼的肠道数据集，这些数据集均包含ZfPV读取序列，并将它们与ZfPV基因组进行比对。与两个CG2数据集不同，将所有12个ZfPV阳性的Tu¨b斑马鱼肠道数据集进行比对后，ZfPV基因组的覆盖度较低，部分区域甚至完全没有覆盖（图5A）。

我们观察到，CG2 数据集的测序读长在 ZfPV 覆盖度上高于 Tu¨ b 数据集，基于这一结果，我们提出假设：CG2 品系可能携带的病毒水平高于 Tu¨ b 个体。为验证这一假设，我们从成年 CG2 和 Tu¨ b 个体中分离出肠道、鳃和脑组织，提取 RNA 并合成 cDNA，通过实时定量 PCR 检测病毒水平。本实验中所有分析的 CG2 个体均饲养于麻省总医院的实验设施，而 Tu¨ b 个体虽与 CG2 个体年龄匹配，却饲养于犹他大学的两处不同实验设施。尽管样本来源存在差异，我们仍在所有纳入研究的个体的肠道和鳃组织中检测到了 ZfPV。在这些实验中（图5B）。为验证我们的假设，我们在检测的三种组织中均观察到CG2品系的ZfPV病毒载量更高，其中包括大脑组织——仅在CG2品系动物的大脑中检测到了该病毒。尽管我们无法排除环境或病毒差异可能对这些比较结果产生影响，但这些数据与我们在一只CG2品系动物（饲养于北卡罗来纳州立大学的设施中）的RNA测序数据集里发现的大量ZfPV测序读段结果一致。综上，这些观察结果反映出该克隆且可能免疫缺陷的品系存在相关趋势，并揭示了影响病毒载量的候选宿主遗传变异。

图 5 与Tüb斑马鱼相比，CG2 品系的病毒水平更高。(A) 与来自单个 CG2 动物的 SRA 中的读数相比，来自所有 12 个 Tüb 肠道 SRA 数据集（具有图 3 中的病毒读数）的读数对 ZfPV 基因组的覆盖范围。 ZfPV 的核苷酸位置和基因组特征显示在覆盖图下方。规模是指覆盖每个位置的读数数量。 (B) 对从成年 Tüb 和 CG2 动物解剖的组织中 ZfPV 水平进行定量实时 PCR 定量。每个点代表一个人体内病毒的相对数量。通过对具有最低非零 ZfPV 量的样本进行归一化来缩放病毒水平。 p 值是根据假设方差相等的不配对 t 检验报告的。

ZfPV 感染与传播的实验操作

我们检测的每一只成年动物均含有 ZfPV 转录本（图5B），这与在8天龄（dpf）转基因幼鱼中观察到的绿色荧光蛋白（GFP）自发表达频率不稳定形成了对比（图1F）。这些差异促使我们开展了三项平行实验，以研究 ZfPV 如何建立和传播感染（实验框架见图6A）。首先，为了验证斑马鱼是否仅在孵化后才发生自然感染，我们在24小时龄（hpf）时对鱼卵进行了漂白处理——这是养殖过程中清除病原微生物的常用策略——并发现，与常规养殖的同窝幼鱼相比，8天龄幼鱼的绿色荧光蛋白（GFP）表达量显著降低（图S6）。绿色荧光蛋白（GFP）表达频率低且水平微弱在漂白处理的动物中观察到的荧光仅局限于肠道的一小区域（GFP低表达；图S6），且我们未能从任何漂白处理的GFP阴性或GFP低表达动物中扩增出斑马鱼乳头状瘤病毒（ZfPV）序列（图6B），这表明这些信号并非病毒有效感染的标志。相比之下，同一批未进行漂白处理的同窝幼鱼则表现出高表达的绿色荧光蛋白（GFP阳性；图S6），且其体内干扰素刺激基因15（isg15）和斑马鱼乳头状瘤病毒（ZfPV）转录本水平也较高（图6B）。这些结果表明，标准的漂白处理方案能够预防斑马鱼乳头状瘤病毒的自然感染，同时提示该病毒存在水平传播方式。

接下来，我们将经漂白处理的斑马鱼暴露于ZfPV感染动物的滤液中，以测试感染的实验性给药方式。由于ZfPV存在于所有采样的成年斑马鱼肠道组织中（图5B），我们对三条成年斑马鱼的肠道进行匀浆，将该匀浆的0.45毫米滤液滴加到24小时龄经漂白处理的5天龄转基因幼鱼培养皿中。与对照组形成鲜明对比的是，暴露于滤液的漂白幼鱼大多呈现绿色荧光蛋白（GFP）阳性，并高表达isg15和ZfPV转录本（图6B和图S6）。这些结果表明，含ZfPV病毒颗粒的滤液可从感染的成年斑马鱼体内提取，并用于感染斑马鱼幼鱼以建立感染模型。

为了在自然条件下检测 ZfPV 的传播，我们接下来将表达绿色荧光蛋白（GFP）的幼虫与经漂白处理的 GFP 阴性幼虫共同饲养，7 天后在供体和受体动物体内均检测到了高水平的 GFP 表达和 ZfPV 转录本（图 6B 和补充图 S6）。相比之下，当将等量的两批单独经漂白处理的 GFP 阴性动物与实验动物共同饲养在培养板中 7 天后，未检测到任何 GFP 表达或 ZfPV 转录本（图 6B 和补充图 S6）。我们还观察到，部分共同饲养的 GFP 阳性鱼在实验结束时丢失了 GFP 信号（补充图 S6）。这一结果表明，部分动物可能清除了感染，或是机体对 ZfPV 产生了免疫应答在某些情况下，可能会随着感染的进展而被抑制。这些结果表明，表达绿色荧光蛋白的阳性幼虫可将斑马鱼疱疹病毒传播给周围未感染的动物，这为在易研究的脊椎动物研究模型中探究病毒感染与传播的自然方式提供了一种新的实验手段。

图6. ZfPV 可水平传播且能通过实验手段进行防控。（A）研究斑马鱼幼鱼中ZfPV感染与传播的三种策略。将一窝转基因isg15:GFP胚胎的一半进行漂白处理，并在受精后8天（8 dpf）与常规饲养的同窝幼鱼对比绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况（蓝色框）。另一种方法是，在受精后5天（5 dpf）对漂白胚胎用成年斑马鱼肠道组织的0.45微米滤滤液处理，并在受精后8天（8 dpf）进行分析（粉色框）。为评估ZfPV在幼鱼间的传播情况，将出现自发性GFP表达的常规饲养幼鱼与漂白幼鱼在受精后8天（8 dpf）混养。此外，还设置了两组独立的漂白幼鱼混养作为对照（未展示）。在受精后15天（15 dpf）观察供体和受体幼鱼的GFP表达情况（灰色框）。（B）上述实验中斑马鱼幼鱼体内isg15和ZfPV含量的实时荧光定量PCR定量结果。每个点代表25只幼鱼混合样本中isg15基因表达量或病毒量的相对值。少数漂白幼鱼在样本收集时偶尔会出现低水平的GFP诱导表达（参见图S6），这类样本单独标注。isg15的含量通过归一化至漂白样本的平均定量值来换算。病毒含量通过归一化至ZfPV含量最低且非零的样本进行换算。另见图S6和表S4。

讨论

本研究通过将病毒发现与宿主免疫基因激活的可视化相结合，揭示了自然诱导的抗病毒反应。尽管斑马鱼对实验性给药病毒的转录反应已有报道，但在任何脊椎动物系统中，鲜有研究追踪自然存在的病毒感染过程中宿主基因的表达情况。对斑马鱼多瘤病毒（ZfPV）诱导的基因集进行全面评估后，明确了其与干扰素及病毒反应相关功能的特征，但令人意外的是，这些自然感染诱导的约500个基因中，有300多个并未通过干扰素或异源病毒的实验处理而上调。这些特异性诱导的基因中有许多是在斑马鱼中高度扩增的免疫基因家族成员，例如此前已被鉴定的NLR家族和三基序（TRIM）家族，同时还包括GIMAP基因家族。我们发现该基因家族在多种鱼类中均发生了扩增，且可能在脊椎动物中发挥抗病毒作用。目前对于这些家族中单个基因的功能知之甚少，因此由斑马鱼多瘤病毒（ZfPV）诱导的基因集为优先研究多样且未被表征的免疫功能开辟了新途径。

斑马鱼与人类在4亿多年前就从具有干扰素信号通路的共同祖先分化而来，因此对斑马鱼的研究为发现脊椎动物抗病毒免疫中重叠和独特的基因编码功能提供了途径。在本研究中，我们对该基因家族的大规模扩张进行了系统梳理鱼类中的GIMAP基因家族，并重点指出ZfPV感染诱导的基因中GIMAP基因显著富集。GIMAP对哺乳动物淋巴细胞的凋亡和成熟至关重要，但其抗病毒作用尚未得到广泛研究。GIMAP可能通过与干扰素诱导的Mx类发动蛋白相似的机制发挥作用，二者似乎拥有共同的GTP酶祖先且都具有低聚化倾向。本研究将GIMAP归为干扰素诱导GTP酶超家族成员，并提示GIMAP作为效应分子参与脊椎动物-病毒相互作用的机制尚未被探索。

编码先天免疫功能的基因家族的大规模扩张是缺乏经典适应性免疫系统的谱系的特征，包括紫海胆等无脊椎动物。斑马鱼在孵化数周后才发育出适应性免疫系统，我们发现它们在这一时间点前就会自然感染病毒。我们推测，GIMAP、NLR、TRIM以及其他斑马鱼免疫基因家族的扩张，可能反映了斑马鱼在完全依赖先天免疫的漫长发育阶段中，病原体所施加的选择压力。我们所报道的ZfPV诱导基因集的优势之一在于，它能从庞大的免疫基因家族中筛选出单个成员，将其作为未来自然感染过程中功能研究的特定靶点。我们开发的用于操控ZfPV感染的方法，也为未来研究中评估特定宿主免疫反应的功能提供了新的机会。

通过在一种广泛应用的研究生物中开展病毒发现研究，我们还得以将在斑马鱼幼体中发现ZfPV的成果，从本研究机构推广至全球各地。我们对公开数据集的使用，与近期利用PCR技术从多家研究机构获取的成年斑马鱼样本中检测出ZfPV的研究工作形成互补[22]。此外，我们在一只来自印度的斑马鱼样本中检测到病毒读数的发现，进一步证实ZfPV在野生环境中存在传播的可能性。这为研究病毒与斑马鱼的自然相互作用提供了契机，也为此前基于其他生物体分离出的多种病毒对斑马鱼开展的体内感染研究奠定了基础。尽管要最终确定ZfPV是一种能感染野生斑马鱼的病毒，还需对自然栖息地中的斑马鱼进行直接采样，但仅从ZfPV在各类研究机构中广泛存在的情况来看，我们便有机会在多种可控环境下研究宿主与病毒的进化关系。

本研究的一项显著发现是，斑马鱼CG2品系的数据集里存在异常大量的病毒读长（图4A）。这一发现促使我们对从多只CG2品系和图宾品系成年个体中提取的组织开展斑马鱼PV（ZfPV）载量检测，结果显示CG2品系中的ZfPV载量高于图宾品系（图4B）。图宾品系和CG2品系在至少一个关键方面存在遗传差异：图宾品系携带不同MHC核心单倍型的异质组合，而CG2品系为单一核心MHC单倍型的纯合子]。经典MHC分子对向T细胞呈递抗原至关重要，也是驱动感染适应性免疫反应的关键。已知MHC基因座的变异会改变哺乳动物、鸟类和鱼类对传染病的易感，且斑马鱼基因组包含丰富的MHC基因多样性]。因此，我们观察到CG2品系的ZfPV载量往往高于图宾品系，这使我们推测宿主存在遗传变异。易受感染性，并指出了可在对照实验中检测的特定因素

ZfPV 似乎主要作为斑马鱼的肠道病原体进行感染，但其组织嗜性的完整范围较为复杂（图3B）。这对于小核糖核酸病毒来说较为常见，脊髓灰质炎病毒就是典型例子——该病毒被认为主要在人体内引发胃肠道感染，随后可扩散至血液，偶尔还会感染中枢神经系统等其他组织，这一过程受宿主免疫系统及其他因素影响。我们对ZfPV的观察结果与这一模式相符：我们在肠道中检测到的病毒载量最高，同时也在包括大脑在内的其他多种组织中检测到了病毒（图3B）。近期发表的研究通过原位杂交分析，为成年斑马鱼肠道组织中存在ZfPV感染提供了佐证，但并未报道该病毒感染其他组织的情况。值得注意的是，我们在从CG2品系斑马鱼采集的脑组织中检测到了ZfPV，却未在Tüb品系斑马鱼的脑组织中检测到（图4C）。我们将这种更广泛的组织嗜性解读为，CG2品系斑马鱼的易感性与由病毒和宿主因素共同决定的动态感染过程相关。因此，CG2品系斑马鱼的ZfPV感染模型，有望成为研究人类小核糖核酸病毒流行中常见神经嗜性机制的新型实用模型。

自然存在的病毒未被识别的感染可能导致斑马鱼实验中出现无法解释的变异，这一问题长期以来一直备受关注]。我们在先前发表的RNA测序数据中观察到实验重复样本内存在基因表达差异，该差异很可能由斑马鱼多瘤病毒（ZfPV）的存在引起（图3C）；尽管在某些情况下受影响的基因数量可能有限，但这些发现支持了“未被识别的病毒感染可能是斑马鱼研究中实验变异的诱因”这一观点。由于序列读 archive（SRA）中大多数RNA测序实验并未包含足够数量的有病毒读段和无病毒读段的重复样本来量化显著差异，因此斑马鱼多瘤病毒在斑马鱼基因表达研究中所产生的全部影响目前尚不明确。我们预测，斑马鱼多瘤病毒可能会对单细胞RNA测序数据产生尤为显著的影响，因为特定细胞类型的表达模式对感染等环境变量可能极为敏感。如今，在斑马鱼基因表达研究中监测斑马鱼多瘤病毒的存在，以考量宿主对隐性感染的反应，应该是简单且具有重要信息价值的做法。

我们确定ZfPV在自然感染和实验感染中均为水平传播。有多条证据支持感染最初发生于孵化后接触环境这一观点。首先，我们直到受精后约8天（8 dpf）才观察到isg15:GFP报告基因的显著诱导表达。其次，我们在序列读取存档（SRA）数据中检测到ZfPV序列的最早样本来自受精后5天（5 dpf）的幼鱼。第三，对卵壳进行表面灭菌足以阻止isg15:GFP的诱导表达和ZfPV的感染。斑马鱼幼鱼通常在受精后2至3天（2-3 dpf）从卵壳中孵化，肠道的天然细菌定殖则始于受精后4天（4 dpf）。我们推断ZfPV的感染及后续宿主反应正是发生在这一时期。这些结果揭示了宿主对ZfPV感染的早期反应特征，并提出了一种从斑马鱼胚胎和幼鱼体内清除病毒的策略，该策略也可用于制备无菌斑马鱼，这一方法应具有实际应用价值。研究人员对斑马鱼常见相关的微生物成分进行了分析。

ZfPV很可能是斑马鱼种群中传播的众多病毒之一，而isg15:GFP斑马鱼可作为有效的监测生物，用于从多种环境中发现更多感染斑马鱼的病毒。对这一策略进行改进，可进一步提升病毒发现过程的灵敏度和通用性，例如通过组合使用可报告感染不同特征的启动子，或在免疫缺陷宿主背景下构建报告基因。更广泛而言，本研究提出了一种可适配的策略，该策略可应用于多种生物，以揭示病毒与宿主之间普遍存在但通常难以察觉的相互作用。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。