题目：A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35108531/

期刊：Cell Reports

摘要

肠道微生物产物调控动物宿主的生长、分化与发育。然而，我们对微生物组引发的细胞特异性反应仍缺乏系统性的全局认知。我们对有微生物组和无微生物组环境下饲养的斑马鱼幼虫的肠道及相关组织进行了细胞转录组分析。研究发现，常规饲养的斑马鱼肠道上皮细胞存在广泛的异质性，其中包括此前未被发现、但与哺乳动物同源细胞类型存在对应关系的细胞类型。通过对比常规饲养与无菌饲养的转录组特征，我们明确了微生物对各细胞群体转录活性的影响。研究揭示了宿主对微生物组反应中复杂的细胞特异性程度，这类特异性既包括对细胞模式建成的调控作用，也涉及对代谢及免疫活性的调控。例如，我们证实微生物的缺失会阻碍发育中脉管系统的促血管生成信号传递，进而导致肠道血管形成受损。本研究构建了发育阶段斑马鱼肠道细胞组成的高分辨率图谱，并详细阐明了微生物组对各类细胞类型的影响。

引言

针对多种模式生物开展的研究充分揭示了肠道微生物对宿主健康的重要性。在无菌环境中饲养的动物通常会表现出生长、免疫和代谢方面的缺陷（Bates 等人, 2006; Hooper 等人, 2001; Rawls 等人, 2004; Reikvam 等人, 2011）。同样重要的是，肠道微生物群落组成或分布的变化与多种严重甚至致命疾病相关，包括胃肠道癌症和炎症性肠病（Belkaid & Hand, 2014; Zitvogel 等人, 2015）。因此，全面阐明微生物群如何影响宿主的发育、生长和细胞功能至关重要。

斑马鱼幼鱼已成为鉴定宿主-微生物相互作用关键调控因子的宝贵工具（Brugman, 2016; Flores et al., 2020; Lo´ pez Nadal et al., 2020）。斑马鱼胚胎在具有保护作用的卵膜内发育，该卵膜可在受精后48小时内保护其免受环境微生物的侵袭。幼鱼一旦破膜而出，水生微生物便会在肠道内腔定植（Bates et al., 2006; Stephens et al., 2016; Wallace et al., 2005），并在此处影响宿主的发育过程（Bates et al., 2006; Cheesman et al., 2011; Kanther et al., 2011; Koch et al., 2018）。从技术角度来看，斑马鱼在精准分析微生物群对发育的影响方面具备多项优势。幼鱼可接受复杂的操作，包括从单细胞阶段进行基因编辑（Grunwald and Eisen, 2002）。此外，研究人员可通过简便的实验方案获得大量无菌幼鱼，或获得与特定微生物群相关的幼鱼。明确的微生物群落（梅兰森等人，2017；范等人，2008），且其半透明的表皮非常适合观察固定或活体样本的内部结构。因此，斑马鱼为研究微生物对脊椎动物生理的调控作用提供了便捷的观察模型。

重要的是，斑马鱼与哺乳动物肠道功能的基因调控机制高度相似。在这两种生物系统中，包括由Notch、骨形态发生蛋白（BMP）和Wnt通路驱动的同源信号，指导肠道上皮中循环祖细胞发育成吸收细胞系和分泌细胞系（Cheesman等人，2011；Crosnier等人，2005；Davison等人，2017；Flasse等人，2013；Haramis等人，2006；Muncan等人，2007；Roach等人，2013；Yang等人，2009）。斑马鱼肠道虽拥有产黏蛋白的杯状细胞和调节性肠内分泌细胞（Crosnier等人，2005；Ng等人，2005；Wallace等人，2005），但目前尚无关于免疫调节性潘氏细胞或簇细胞的报道。我们对吸收细胞系的了解尚不够全面。与哺乳动物类似，鱼类肠道上皮也包含区域特化的肠上皮细胞，这些细胞从肠腔中摄取营养物质（Lickwar等人，2017；Ng等人，2005；Park等人，2019；Wallace等人，2005；Wang等人，2010b）。然而，肠上皮细胞群体内功能异质性的程度尚不明确，我们也不清楚肠道上皮中是否存在抗原捕获M细胞或近期发现的Best4/Otop2细胞等特化吸收细胞（Parikh等人，2019；Smillie等人，2019）。同样，尽管有实验证据表明斑马鱼肠道中存在循环祖细胞（Crosnier等人，2005；Li等人，2020；Peron等人，2020；Rawls等人，2004；Wallace等人，2005），我们缺乏能够识别和操控这种关键细胞类型的表达标记。综合来看，这些不足限制了我们充分发挥斑马鱼作为肠道生物学和宿主-微生物相互作用模型的潜力。

从微生物学的角度来看，鱼类与哺乳动物之间的相似性也十分显著。与哺乳动物一样，鱼类依赖生殖系编码的先天防御系统以及基于淋巴细胞的适应性防御所构成的复杂网络，来阻止肠道常驻微生物侵入间质组织（Flores 等人，2020；Herna´ndez 等人，2018）。转录组学研究表明，同源基因介导了微生物对上皮增殖、营养代谢、异生物质代谢以及先天免疫的调控（Davison 等人，2017；Heppert 等人，2021；Hooper 等人，2001；Koch 等人，2018；Rawls 等人，2004；Reikvam 等人，2011）。体内研究证实，微生物群在上皮更新、分泌细胞分化和肠道蠕动等发育过程中发挥着共同的作用（Cheesman 等人，2011；Troll 等人，2018；Wiles 等人，2016）。微生物还会对鱼类和哺乳动物的免疫系统进行“教育”，通过依赖 Myd88 的 Toll 样受体信号通路诱导黏膜炎症和髓样细胞募集（Galindo-Villegas 等人，2012；Koch 等人，2018；Takeda 和 Akira，2005）。与哺乳动物类似，鱼类通过上皮细胞产生活性氧和抗菌肽来中和致病菌（Flores 等人，2010；Katzenback，2015）。此外，对鱼类的实验研究发现，上皮碱性磷酸酶可对脂多糖进行解毒，这一发现随后在小鼠模型中得到了证实（Bates 等人，2007；Goldberg 等人，2008）。这些研究表明，斑马鱼与其他模式生物一样，能够帮助我们理解微生物对宿主发育和疾病的影响。

尽管近期研究为微生物相关的宿主过程提供了重要见解，但大部分此类研究聚焦于微生物如何影响整个生物体、整个肠道或肠道区域。因此，我们对于依赖微生物信号的细胞类型特异性过程的认知仍存在知识空白。已有少数研究通过对肠道上皮亚群进行荧光激活细胞分选来解决这一差异问题（Arora 等人，2018）；但该方法需要预先了解并获取细胞类型特异性抗体或报告基因，且每次实验的检测仅局限于一种细胞类型。

为实现对微生物依赖过程的无偏细胞类型特异性分析，并推进鱼类肠道的细胞特征解析，我们构建了常规环境饲养或无菌饲养的受精后6天斑马鱼幼虫肠道的单细胞转录组图谱。我们在肠道中鉴定出35种不同的转录状态，其中数种此前尚未被报道，并绘制了高分辨率的肠道细胞对微生物的响应图谱，揭示了微生物对宿主生长、模式形成和免疫的细胞特异性影响。为便于科研界广泛挖掘本研究结果，我们将两组数据均公开上传至博德研究所单细胞门户，供用户便捷可视化分析

结果

斑马鱼幼鱼肠道的单细胞图谱

为追踪共生微生物对肠道生理的影响，我们制备了在常规（CV）或无菌（GF）条件下饲养的6天post-fertilization（dpf）斑马鱼幼虫消化道的单细胞转录组图谱（图1A及图S1）。实验进行了重复，每个条件共收集80个肠道样本，以控制技术和生物学变异性。我们的研究结果涵盖了与肠道紧密关联的组织，如胰腺和肝脏。在过滤掉死细胞和双细胞后，我们获得了18345个单个细胞的基因表达谱（常规条件8036个；无菌条件10309个；图1B及图S2）。为了进一步深入理解肠道内的细胞异质性，我们采用基于图的聚类方法对整合数据中的细胞类型进行鉴定（图1B及图S2）。我们共鉴定出35个不同的细胞簇（图S2；表S1），并根据已知标志物的表达情况将其划分为18种细胞类型（图1B）。

我们的数据集以肠道上皮细胞（IECs）的表达谱为主。例如，我们鉴定出了分泌肽激素产生的肠内分泌细胞，以及由杯状细胞分化因子前梯度蛋白2（agr2）和生长抑素受体5（sstr5）表达标记的杯状细胞（图1C），后者是一种能刺激小鼠结肠中黏蛋白2生成的基因产物（Song等人，2020）。我们还发现了一个上调胰十二指肠同源盒因子1（pdx1）的类杯状细胞簇（图1C），该细胞簇在前肠和胰腺的分泌细胞中富集（Lavergne等人，2020）。除内分泌和杯状细胞谱系外，我们还鉴定出一个与哺乳动物肠道簇状细胞具有显著转录相似性的未预期细胞簇，其表达簇状细胞标记基因Gng13、Trpm5、Avil以及簇状细胞特化主调控因子Pou2f3（Haber等人，2017）（图1C和图S3A-S3C）。对成年斑马鱼肠道上皮的透射电子显微镜观察发现了一种罕见的圆形细胞类型，其具有肠道簇状细胞的典型形态特征（Hoover等人，2017），即微绒毛顶端簇下方存在管状细胞骨架网络（图S3D）。因此，我们的数据表明，与哺乳动物类似，斑马鱼可能也含有罕见的感知性肠道簇状细胞。

大多数肠道上皮细胞为吸收性细胞，包含典型的肠上皮细胞谱系，这些谱系表达营养获取和代谢所需的基因，同时也包括近期发现的富含溶酶体的肠上皮细胞（LREs）（图1C；表S1），这类细胞被认为介导蛋白质的降解（Park等人，2019）。此外，我们发现了一群Best4/Otop2阳性细胞（图1B和1C；表S1），这是一种近期在人类中被鉴定的吸收性细胞谱系（Parikh等人，2019；Smillie等人，2019），但在斑马鱼中尚未被表征。与人类的Best4/Otop2阳性细胞类似，斑马鱼中的同类细胞以notch2以及Notch响应的hes相关家族成员的高表达为特征（图1C和图S4；表S1）。此外，斑马鱼的Best4/Otop2阳性细胞表达氯离子/碳酸氢盐转运体cftr（图1C；表S1），这表明其与人类十二指肠BCHE细胞可能存在功能相似性（Busslinger等人，2021）。

除了吸收和分泌谱系外，我们的初始聚类还发现了两个群体，它们表现出与肠道祖细胞相关的特征，包括Notch通路组分dld、dla以及HES5同源物的表达her15和her2（类祖细胞1）以及notch3（类祖细胞2）（图1C；表S1）。更详细的分析将假定的祖细胞群解析为四个具有不同转录特征的亚群（图1D和1E）。在这四个亚群中，我们认为亚群1来源于肝脏，因为其以肝脏相关基因apoa2和fabp10a的表达为特征（图1E）。相比之下，亚群0、2和3的细胞具有肠道祖细胞常见的特征。亚群0其特征为除了表达sox9b（图1E）外，还表达肠道相关基因onecut1（Matthews等人，2004年）和notch3（Crosnier等人，2005年）；sox9b是青鳉鱼的肠道干细胞标志物（Aghaallaei等人，2016年），也是成年斑马鱼基底柱状肠上皮细胞的标志物（Peron等人，2020年）。

此外，0号簇细胞高表达epcam（图1E），这是一种与脊椎动物肠上皮细胞增殖相关的基因（Ouchi等人，2021年）。2号簇细胞表达肠上皮细胞标记物cldn15la（Alvers等人，2014年）和vil1（Abrams等人，2012年；Thakur等人，2014年），以及肠道祖细胞分裂和分化的调控因子，如cdx1b（Flores等人，2008年）和atoh1b（图1E）。此外，对Tg(tnfrsf11a:GFP)鱼的肠道进行荧光成像分析，该鱼在第二簇标记物tnfrsf11a的启动子控制下表达GFP，结果显示，与肠道祖细胞类似（Li等人，2020年；Ng等人，2005年），第二簇细胞似乎位于肠道褶皱底部（图1F）。有趣的是，tnfrsf11a与其他祖细胞标记物一样，在一部分Best4/Otop2细胞中表达，这表明需要进一步深入研究候选祖细胞与Best4/Otop2细胞之间的发育关系。最后，我们将第三簇鉴定为一个增殖细胞群，该细胞群主动表达哺乳动物转运扩增细胞的增殖标记物（Haber等人，2017年），如mki67、cdk1和top2a（图1E）。因此，我们的转录组学和体内实验数据鉴定出了一个此前未被发现的具有肠道祖细胞特征的肠上皮细胞群，不过这一结论仍需通过谱系示踪研究进一步验证。总而言之，我们鉴定出了一组表达标记物，可区分斑马鱼消化道的主要细胞谱系，包括此前未被报道的簇状样细胞、Best4/Otop2细胞，以及可能的肠道祖细胞标记物。

图1. 斑马鱼肠道中转录特征不同的细胞群。(A) 斑马鱼肠道单细胞转录组图谱的实验设计。(B) 按细胞类型上色的已检测细胞二维 t-SNE 投影图。左图为整合 CV 和 GF 数据集的 t-SNE 分析，CV 和 GF 条件分别在右上角和右下角独立展示。(C) 按基因相对表达水平上色的肠上皮细胞簇标志物热图。左侧和顶部的彩色条标注细胞类型，热图右侧轴展示每个簇的几个核心标志物。(D) 基于原始图论分析（左图）和进一步重聚类（右图）的祖细胞样簇 1 与 2 的 t-SNE 图，按细胞类型上色。(E) 推定祖细胞样簇的细胞标志物热图，按基因相对表达水平上色。左侧和顶部的彩色条标注细胞类型，热图右侧轴展示每个簇的几个核心标志物。(F) 6 天胚胎期 Tg(tnfrsf11a:GFP) 斑马鱼全肠道光学切片，经鬼笔环肽染色显示丝状肌动蛋白（品红色）、Hoechst 染色显示细胞核（蓝色）。右图为左图中 GFP 阳性细胞的放大图像。比例尺为 10 微米。参见图 S1–S4 及表 S1。

肠道微生物对宿主基因表达的细胞类型特异性影响

尽管微生物因子在调控宿主生理过程中发挥关键作用，但我们在绘制细胞类型特异性对微生物组的反应图谱方面进展零散。与其他研究机构（Roeselers 等人，2011）的研究结果一致，我们的实验鱼主要宿主为γ-变形菌纲和α-变形菌纲细菌（表S2和表S3）。因此，我们认为对比我们的无菌（GF）和常规无菌（CV）数据，或许能揭示细胞对微生物组的特异性相关反应。

我们首先证实，我们的数据重现了无菌（GF）生长对宿主基因表达的已知效应。在无菌鱼相较于常规（CV）对照组的全球差异表达基因中，我们发现了已知的微生物依赖性对一系列宿主基因表达的影响（Rawls 等人，2004），包括谷胱甘肽过氧化物酶1b（gpx1b）、细胞因子信号抑制因子3a（socs3a）和酪氨酸转氨酶（tat）（图2A）。此外，我们使用NanoString定量分析，独立验证了微生物组对我们单细胞数据中观察到的宿主基因表达的影响。与单细胞分析结果一致，在无菌生长条件下，胎盘8.1（plac8.1）、跨膜蛋白176L同源物2（tmem176l.2）、黏蛋白13b（muc13b）和胸腺基质淋巴细胞生成素a（tcnba）显著下调，而胰蛋白酶原59.1（prss59.1）和弹性蛋白酶2（ela2）的表达则适度升高（图2B）。最后，在Rawls等人（2004）鉴定的175个微生物响应基因中，我们观察到125个（71%）基因在至少一种细胞亚群中存在显著的微生物依赖性表达变化（表S4）。总体而言，这些观察结果表明，我们的基因表达数据准确反映了微生物组对肠道功能的影响。

在某些情况下，例如tat实验中，微生物组的消除改变了整个肠道的基因表达（表S4）。然而，我们也观察到无菌生长对特定细胞类型基因表达产生影响的情况。例如，去除微生物组仅在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、祖细胞和白细胞中减弱埃兹蛋白a（msna）的表达（表S4）。为了更深入地探究细胞类型特异性的微生物组反应，我们对在常规（CV）和无菌（GF）条件下培养的类祖细胞的转录程序进行了表征。我们选择祖细胞进行研究，是因为微生物是增殖和分化过程中已明确的调控因子，包括Notch通路相关成分（克罗斯尼耶等人，2005；弗拉斯塞等人，2013；罗奇等人，2013；杨等人，2009）。我们观察到推定的祖细胞簇对无菌生长的反应具有显著的细胞特异性（图S5）。例如，在无微生物组培养的条件下，类祖细胞簇二的细胞会下调 Notch 响应性转录因子 atoh1b 与 her15.1，以及肠道 Notch 配体 delta D（dld）（图 S5B–S5D）。有趣的是，我们还观察到类祖细胞簇二中干扰素相关发育调节因子 1（ifrd1）的表达水平下降（图 S5D），该基因是一种调控肠道上皮细胞增殖的免疫反应基因（Yu 等人，2010）。因此，我们的数据表明，特定亚群的候选祖细胞对微生物因子对 Notch 活性的影响尤为敏感。

为验证我们的数据在有无微生物情况下用于信号通路活性细胞特异性定位的效用，我们可视化了无菌（GF）和常规饲养（CV）斑马鱼中微生物传感器、NF-κB通路组分、细胞因子和趋化因子的相对表达水平。在CV幼体中，我们检测到关键免疫传感器和效应分子的细胞限制性表达（图S6）。例如，白细胞表达cxcl8a、il1b和tnfa等免疫调节细胞因子，而脉管系统则以微生物传感器tlr4ba、细胞因子tgfb1b和炎症调节因子ahr2的富集表达为特征。与哺乳动物类似，CV肝细胞表达抗菌肽hamp，而间充质细胞则以cxcl8b亚型、cxcl12以及tgfb1a、tgfb1b和tgfb3细胞因子的富集表达为特征。在肠上皮内，大多数肠上皮细胞亚型产生alpi.2（一种细菌脂多糖解毒所需的磷酸酶，Bates等人，2007），而肠内分泌细胞表达il22（一种激活上皮先天防御的细胞因子，Dudakov等人，2015）。与先前报道一致（Kanther等人，2011），血清淀粉样蛋白A（saa）在中肠LREs和杯状细胞中表达。有趣的是，我们还观察到CV簇状样细胞中nod1、nod2和myd88的表达增强，这与Nod1和Nod2在簇状细胞2型免疫中的拟议作用相符（Magalhaes等人，2011）。微生物组的去除显著影响了发育中幼体免疫通路的组织。具体而言，我们发现内分泌细胞和白细胞中il22的表达大幅降低；祖细胞、间充质和脉管系统中nod1的表达大幅降低；肠上皮细胞中ifit14和ifit15（IFIT1同源物）的表达大幅降低；肠上皮细胞（IECs）中stat2的表达大幅降低；以及间充质细胞、脉管系统和白细胞中tgf亚型的表达大幅降低。综合来看，我们的数据揭示了CV细胞类型间免疫基因表达模式的复杂分区，其中许多模式表明斑马鱼和哺乳动物共享微生物响应通路。重要的是，我们认为我们的基因表达数据的用途不仅限于细胞特异性免疫活性的鉴定。为便于全社区挖掘我们所有感兴趣通路或基因的研究结果，我们已将两组数据公开，以便用户在博德研究所单细胞门户上便捷可视化。

图2. 微生物对宿主基因表达的调控。（A）GF 细胞相对于 CV 细胞的差异表达基因火山图，为整体处理结果。显著性（校正后 p 值）通过 Seurat 软件采用非参数 Wilcoxon 秩和检验结合 Bonferroni 校正确定。（B）显微解剖完整肠道的 NanoString 基因表达分析箱线图。每个条件分析四个重复样本（每个重复样本含 ((n=15) 个肠道）。异常值以红色圆点标注。显著性通过 Student's t 检验确定。另见图 S5、图 S6 及表 S2、表 S3、表 S4。

微生物调控幼鱼分泌谱系功能

斑马鱼的分泌谱系主要由产激素的肠内分泌细胞和分泌黏液的杯状细胞组成。为了探究分泌细胞如何与常规微生物组相互作用，我们构建了常规养殖（CV）和无菌（GF）斑马鱼分泌细胞的转录组图谱。在肠内分泌细胞群中，我们发现了六种不同的转录细胞状态，每种状态均以独特的肽类激素表达模式（图3A和3B）和特定的空间分布特征为标志（图S7A）。例如，肠内分泌5号簇细胞表达前肠标志物，其特征是产生肠道动力、饱腹感以及脂质和蛋白质消化的调节因子CCKA和CCKB（Le等人，2019；Rehfeld，2017）。相比之下，肠内分泌3号簇细胞的分布在头尾部方向上更弥散，且是动力调节因子VIPB和多功能肽GALN的主要来源。我们观察到GF生长对大多数肽激素的表达影响轻微，这表明肠内分泌谱系的特化在整体上对微生物暴露不敏感。然而，我们发现微生物的存在会影响特定肠内分泌谱系的激素表达谱。具体而言，我们观察到4号簇肠内分泌细胞中GIP和GCGB的表达适度降低，这支持了微生物在调节GIP和胰高血糖素水平方面的作用——这两种肠促胰素激素可调节葡萄糖代谢和胰岛素分泌（Gribble和Reimann，2016）。

通过对杯状细胞的分析，我们鉴定出两个细胞簇（图3C），这两个簇具有高度相似的基因表达谱（表S1）；其中簇1富含agr2基因（图S7B），且两个簇均主要表达中肠标志物（图S7A），这与斑马鱼肠道中杯状细胞的分布特征一致（Ng等人，2005；Wallace等人，2005）。此外，我们还发现了一个富含agr2的杯状样细胞簇，该簇表达黏蛋白5.3（图S7C）；已知黏蛋白5.3在食管中高度富集（Jevtov等人，2014），这表明该细胞簇可能代表产黏液的前肠细胞。

我们对GF杯状细胞相较于CV杯状细胞的免疫相关显著变化产生了浓厚兴趣（图S6），因此我们更细致地检测了杯状细胞的免疫基因表达情况。微生物组的去除对多种免疫调节因子产生了簇特异性影响。例如，消除微生物组后，杯状细胞簇1和簇2中假定的脂多糖结合分子及抗菌肽ly97.2的表达显著降低（Liu等人，2017；Wang等人，2016），杯状细胞簇1中炎症介质irg1l（Hall等人，2014；van Soest等人，2011）和lect2l（Gonçalves等人，2012）的表达也随之降低。相比之下，GF培养条件下所有杯状细胞中α干扰素诱导蛋白27（IFI27）同源物的表达均下降，而微生物组的缺失仅导致簇1细胞中CCL19同源物的表达减弱（图3D）。我们通过全组织NanoString基因表达分析，验证了IFI27同源物、irg1l和ccl19b等多个基因的表达变化依赖于微生物组（图3E），这进一步证实了杯状细胞介导的干扰素和炎症信号通路在共生微生物应答中发挥的作用。简而言之，我们的研究揭示了杯状细胞和肠内分泌肠上皮细胞存在复杂的排布模式，它们具有不重叠的吻尾分布特征，且对常规微生物组的应答具有亚群特异性。

图3. 无菌生长改变肠内分泌细胞中肽激素的表达以及杯状细胞中的免疫信号传导。（A）重新聚类后肠内分泌细胞的t-SNE图，按细胞类型进行颜色编码。（B）斑马鱼肽激素在肠内分泌细胞簇0-5中表达的小提琴图。（C）杯状细胞和类杯状细胞簇的t-SNE图，按细胞类型进行颜色编码。（D）无菌（GF）相对于常规无菌（CV）细胞群体中差异表达的免疫相关基因热图，按Log (log _{2}(FC))进行颜色编码。经Bonferroni校正的非参数Wilcoxon秩和检验确定，所有非零值的表达变化均具有显著性（校正后(p value <0.05)）。（E）解剖的完整肠道的NanoString基因表达分析箱线图。每个条件分析四个重复样本（每个重复(= 15)个肠道）。异常值用红点表示。采用Student t检验确定显著性。另见图S7。

斑马鱼肠道上皮包含功能多样的吸收细胞系

与大多数动物一样，斑马鱼的肠上皮主要包含从肠腔获取物质的吸收细胞。在鱼类中，代谢物的获取依赖于特化的肠上皮细胞和负责摄取蛋白质的 LRE 细胞谱系（Lickwar 等人，2017；Ng 等人，2005；Park 等人，2019；Wallace 等人，2005；Wang 等人，2010b）。为了表征每个谱系中微生物的响应性和功能特化，我们分析了整合的CV和GF数据集吸收性簇中的基因表达。我们鉴定出五个肠上皮细胞簇（图4A），其中簇1至4在前肠中富集（图4D），并以脂质、碳水化合物、几丁质和小分子代谢所需基因的表达为特征（图4B和4C；表S1）。簇5的细胞是一个独特的亚群，专门负责异生物质代谢（图4C），以及通过转钴胺素βa（tcnba）转运维生素B12（图4B；表S1）。

除肠上皮细胞外，我们捕获了三个独立吸收谱系的表达谱，其中两个的表达谱与LREs一致（Park等人，2019）。LRE1细胞相对罕见，表达前肾标志物，如lrp2a、zgc:64022和tspan35（图4B；表S1），表明LRE1细胞为肾源性细胞。相比之下，LRE2细胞表现出中肠特征（图4D），其肽分解代谢相关基因的表达呈富集状态，这与中肠LREs在蛋白质消化中发挥的作用相符（Park等人，2019）。最后，我们鉴定出一个此前未知的吸收谱系，该谱系与近期已鉴定的人结肠BEST4/OTOP2细胞类似（Parikh等人，2019；Smillie等人，2019年）。与人类的同类细胞类似，斑马鱼的 Best4/Otop2 细胞是一种后部细胞类型（图4D），这类细胞表达离子转运所需的基因（cftr、ca2、best4）。

由于吸收性细胞与腔道微生物频繁直接接触，我们预期在无微生物发育的情况下会出现显著的转录变化。为验证这一假设，我们评估了微生物组暴露对吸收性群体内免疫反应的影响。1型至5型肠上皮细胞簇对GF（无菌）生长的转录反应相似，包括plac8.1和组织蛋白酶La（ctsla）的下调；而2型至4型肠上皮细胞簇还表现出干扰素通路元件socs3a和elf3的下调（图4E）。相比之下，LRE1细胞在无菌鱼体内未出现显著变化，这与其肾脏定位的特点相符。然而，中肠LRE2细胞在微生物被清除后表现出剧烈的基因表达变化，包括prdx1、lect2l、saa以及大量干扰素刺激基因的显著下调（图4E）。值得注意的是，无菌状态下的LRE2细胞与1类杯状细胞的无菌应答表现出高度相似性，这表明中肠LRE2细胞与1类杯状细胞群在应对微生物刺激时存在重叠的免疫应答。综合来看，我们的研究数据表明，成熟斑马鱼肠上皮细胞包含一套复杂的吸收细胞谱系组织，这些谱系参与了肠道微生物区域特异性免疫应答的形成。

图4.斑马鱼肠道具有区域特异性的吸收细胞，且这些细胞存在依赖微生物的不同免疫反应。(A)吸收细胞的t-SNE图，按细胞状态进行颜色编码。(B) 吸收细胞的聚类标记基因热图，按基因相对表达水平着色。左侧和顶部的彩色条标注了细胞类型。热图右侧轴展示了每个聚类相较于其他吸收细胞群的几个顶级标记基因。(C)基于常规单细胞RNA测序数据集的遗传标记基因，对吸收细胞进行基因本体（GO）富集分析。每个细胞状态均展示了前5个非冗余GO条目。富集分数由条形长度表示，p值以白色圆圈标注。(D) 展示各吸收细胞类型中已确立的区域标记基因相对表达水平的热图。(E)展示无菌（GF）相较于常规（CV）吸收细胞中差异表达的免疫相关基因的热图，按Log2(倍数变化)进行颜色编码。经Bonferroni校正的非参数Wilcoxon秩和检验分析显示，所有表达变化非零的基因均具有显著性（校正后p值<0.05）。LRE 1未显示显著的免疫基因差异表达，因此未被纳入。BO指Best4/Otop2细胞。

微生物暴露对白细胞和基质活性的细胞特异性影响

由于我们的数据包含非上皮谱系，我们扩展了研究，以绘制微生物组定植与白细胞和基质细胞中基因活性之间的关系图谱，白细胞和基质细胞是宿主-微生物相互作用的关键调节因子。我们发现了两个高度不同的幼体白细胞簇（图5A；表S1）。第一个簇是混合吞噬细胞群，表达巨噬细胞和中性粒细胞标志物，如spi1b、mpeg1.1和mpx（图5B和5C）。相比之下，第二个簇的细胞表达发育中T细胞的经典标志物（Ma等人，2013），如ikaros（ikzf1）、runx3和ccr9a，以及T细胞受体α/δ可变区14.0基因片段（tradv14.0）（图5B-5D）。考虑到T细胞和先天淋巴样细胞（ILCs）之间存在转录重叠，第二个白细胞簇的细胞也可能代表先天淋巴样细胞群（Robinette等人，2015）。未来需要进一步研究来确定T细胞或先天淋巴样细胞是否已在第6天定植于幼体肠道，或者这些细胞是否源自与解剖肠道相连的胸腺或肾组织。微生物组主要影响吞噬细胞内的基因表达，与CV对照组相比，GF生长导致干扰素和细胞骨架成分的表达显著降低（图5G），并减弱了关键免疫调节因子的产生，如stat1a和stat2，以及促炎细胞因子il1b、tnfa和tnfb（图5I）。

间充质细胞可分为四个不同的簇（图5E），其中簇1代表成纤维细胞群，该细胞群表达细胞外基质成分（如col1a1a和col1a2）以及成纤维细胞标志物波形蛋白（vim）（图5F）。间充质簇2的身份尚不明确；不过，该细胞簇以氨转运体rhag和aqp1a.1的表达为特征（图5F），这两种分子参与氨、水以及(CO_{2})的转运（Horng等人，2015年；Talbot等人，2015年），表明这些细胞调控气体和离子的转运。簇3细胞以细胞外基质成分matrilin 1（matn1）、多种胶原蛋白以及成纤维细胞生长因子结合蛋白2b（fgfbp2b）的表达为特征，这同样是成纤维细胞身份的标志（图5F）。最后，间充质簇4以凝集素家族的可溶性模式识别受体的表达为特征（表S1），同时还表达血管标志物angptl6和agtr2（图5F），这表明簇4很可能代表血管周成纤维细胞。在间充质细胞簇中，去除微生物组主要会减弱与代谢相关的基因表达（图5G）。相比之下，无菌（GF）状态对血管平滑肌细胞和内皮细胞的基因表达产生了显著影响。与常规饲养（CV）对照组相比，无菌状态下的血管细胞中调控白细胞迁移、细胞增殖以及血管出芽生成的基因表达量显著降低（图5G）。此外，与间充质细胞类型不同，血管平滑肌细胞在……条件下的趋化因子表达显著降低无菌斑马鱼的生长条件（图5H和图5I）表明，血管细胞是微生物依赖的白细胞募集过程中的中介。与血管细胞在介导微生物募集白细胞过程中所起作用一致的是，我们发现与常规饲养（CV）对照组相比，无菌斑马鱼的血管平滑肌细胞下调了淋巴细胞趋化调节因子cxcl12b和粒细胞趋化调节因子cxcl18b的表达，而血管内皮细胞则下调了cd99的表达——cd99是白细胞跨内皮迁移的促进因子（Schenkel等人，2002）。综上，我们在幼鱼肠道中鉴定出了不同的白细胞和基质细胞亚型。我们的研究数据揭示了各亚型对微生物的敏感程度存在差异，并证实血管细胞是介导微生物调控白细胞迁移的关键因子。

图5. 基质细胞和白细胞群对共生微生物具有亚型特异性反应。(A)白细胞的t-SNE图，按细胞簇进行颜色编码。(B) 白细胞簇标志物的热图，按相对基因表达进行着色。左侧和顶部的彩色条标注了细胞类型。热图右侧轴展示了相较于其他白细胞群体的几个主要簇标志物。(C) 白细胞的t-SNE图，展示了白细胞亚群标志物的细胞特异性表达。(D) 小提琴图展示了白细胞2细胞标志物基因的对数归一化表达。(E) 间充质簇的颜色编码t-SNE图。(F) 间充质细胞簇标志物的热图，按相对基因表达进行着色。左侧和顶部的彩色条标注了细胞类型。热图右侧轴展示了相较于其他间充质群体的几个主要簇标志物。

微生物组对肠道血管生成至关重要

对CV和GF数据的整合分析揭示了血管内皮和平滑肌群体中依赖微生物的基因表达变化，包括血管发育调控因子的表达显著降低（图5G-5I）。因此，我们推断，与小鼠（Reinhardt等人，2012；Stappenbeck等人，2002）一样，微生物可能促进斑马鱼肠道血管生成。对血管细胞的进一步观察发现，在GF条件下饲养的幼体中，促血管生成因子（如膜伸展蛋白a（msna）和钙粘蛋白5（cdh5））以及参与血管形态发生的骨形态发生蛋白（BMP）调控因子（如smad5和smad6a）的表达量更低（He和Chen，2005；Mouillesseaux等人，2016）（图6A）。同样，我们检测到血管平滑肌中血管生成素样蛋白4（angptl4）以及转录调控因子前B细胞白血病同源盒1a（pbx1a）和pbx4的表达出现显著下降（图5A），而这些都是已知的血管发育调控因子（Cvejic等人，2011；Kao等人，2015）。综合来看，这些数据表明GF饲养可能对肠道相关血管组织的形成产生不利影响。

肠道血管生成大约始于受精后6天（3 dpf）（Isogai等人，2001），这一时间点与微生物在肠道腔的定植相吻合。在此阶段，成血管细胞从后主静脉向腹侧迁移，形成肠上动脉，并形成血管丛，该血管丛逐渐分化为一系列垂直的血管和肠下静脉（Goi和Childs，2016；Lenard等人，2015；Nicenboim等人，2015）。肠道血管将营养物质从肠道输送至肝门静脉，为生长发育提供支持。

为了确定微生物组是否影响肠道血管生成，我们使用kdrl:mCherry标记的幼体，对饲养6天且分别存在或不存在常规微生物组的斑马鱼血管进行可视化观察（图6B和6C）。我们未观察到微生物组对肠上动脉和肠下静脉的形成及分布产生影响，这两个过程属于血管内皮生长因子（VEGF）非依赖性过程。两组中，动脉和静脉均正常形成勾勒出了肠道的背侧和腹侧边缘（图6B和图6C）。相比之下，微生物组的去除对连接血管的发育产生了显著影响，这是一个依赖于血管内皮生长因子（VEGF）的过程。与此一致，我们观察到无菌（GF）斑马鱼幼虫的肠道kdrl:mCherry信号与常规（CV）斑马鱼幼虫相比降低了近50%（图5D）。因此，我们得出结论，微生物因子对于斑马鱼肠道血管系统的正常发育至关重要。

图6. 微生物促进促血管生成因子的表达与肠道血管生成。(A)与CV组相比，GF组促血管生成因子在血管内皮和血管平滑肌群体中的表达下调 ((p <0.05))显著性通过非参数Wilcoxon秩和检验确定。(B和C) 斑马鱼在CV(B)或GF(C)条件下培养6天，其kdrl:mCherry的表达情况。相应的明场图像用于识别肠道，并用蓝色勾勒出轮廓。(B和C)的下图分别显示了上图黄色框内肠道中后段的放大区域。PCV：后主静脉；SIA：肠上动脉；SIV：肠下静脉。比例尺：100微米。(D) 箱线图显示肠道kdrl:mCherry信号面积相对于肠道总面积的比例。CV组和GF组分别对应 (n=14) 和 (n=13)。异常值用红点表示。显著性通过Student's t检验确定。

讨论

肠道微生物因子是动物发育的关键决定因素（Sekirov等人，2010）。对无菌（CV）和无菌（GF）斑马鱼幼虫的对比研究揭示了微生物对宿主的诸多影响，包括对增殖、细胞命运特化的影响以及新陈代谢（Bates等人，2006；Hooper等人，2001；Rawls等人，2004；Reikvam等人，2011）。重要的是，决定肠道发育的分子和遗传网络在斑马鱼和哺乳动物之间高度相似（Davison等人，2017；Heppert等人，2021；Lickwar等人，2017）。因此，以斑马鱼为模型的研究发现有可能揭示宿主-微生物关系的基础层面。然而，关键的知识空白阻碍了我们最大化利用斑马鱼-微生物相互作用数据的价值。特别是，与小鼠和人类相比，我们对斑马肠上皮细胞内的细胞组成了解较少。例如，斑马鱼上皮中存在基础周期细胞，这些细胞可能充当上皮祖细胞（Crosnier等人，2005；Li等人，2020；Peron等人，2020；Rawls等人，2004；Wallace等人，2005）。但我们缺乏能够识别或分离祖细胞群以进行实验表征的遗传标记。同样，吸收性上皮谱系的功能异质性程度也有待阐明。为了弥补这些不足，并实现对宿主对微生物组反应的单细胞定义，我们构建了常规无菌（CV）或无菌（GF）条件下饲养的幼鱼肠道的单细胞图谱。我们在肠道及相关组织中鉴定出35个转录上不同的细胞簇，其中包括迄今尚未被描述的细胞类型。通过对比常规无菌（CV）和无菌（GF）斑马鱼，我们明确了微生物组对每种细胞类型生长、模式形成、免疫和代谢过程的影响。我们认为，这些研究结果构成了一项宝贵的资源，将助力研究人员探究微生物如何影响脊椎动物生理机能。为了让我们的数据可公开用于常规无菌（CV）和无菌（GF）条件下的单细胞基因表达分析为获取相关数据，我们已将数据集上传至布罗德单细胞门户（BroadSingleCellPortal），这是一个用于单细胞可视化的网络资源（单细胞门户链接：https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP1623/zebrafish-intestine-conventional-and-germfree-conditions）。

观察肠道上皮组织，我们鉴定出了表达经典肠道干细胞标志物的增殖细胞，例如类Delta配体dld、Notch通路组分ascl1a和atoh1b，以及Notch响应的hes相关转录因子家族成员，如her2和her15.1。值得注意的是，在无菌（GF）斑马鱼幼体的这一细胞群中，多种细胞周期标志物、her2、her15.1和dld的表达水平均有所下降，这与无菌饲养鱼类的上皮生长减弱现象一致（Bates等人，2006；Rawls等人，2004）。我们的研究结果与脊椎动物和无脊椎动物的相关研究相符（Buchon等人，2009；Cheesman等人，2011；Rawls等人，2004；Reikvam等人，2011），且提示我们可能发现了斑马鱼幼体的肠道干细胞标志物。在哺乳动物中，Lgr5是经典的肠道干细胞标志物，在Wnt信号传导中发挥作用（Haegebarth和Clevers，2009）。尽管Wnt信号对斑马鱼肠道上皮的微生物依赖性生长至关重要（Cheesman等人，2011），但斑马鱼基因组中似乎并不存在lgr5的直系同源基因。相反，该鱼类基因组编码了相关的lgr4和lgr6基因（Hirose等人，2011）。我们未在斑马鱼肠道中检测到lgr6的表达，且lgr4的表达主要见于吸收细胞，这表明Wnt-Lgr信号传导可能并非斑马鱼幼体肠道干细胞特化和生长所必需的。在这一点上，斑马鱼幼体可能更类似于果蝇，其中Wnt活性在中肠肠道干细胞生长中仅起辅助作用（Cordero等人，2012；Lee等人，2009；Lin等人，2008；Tian等人，2016）。此外，考虑到tcf4纯合突变斑马鱼仅在4周龄时出现肠道生长缺陷（Muncan等人，2007），斑马鱼幼体和成体可能对Wnt信号存在不同的需求。未来的研究可对本研究中鉴定的候选祖细胞以及表达干性标志物sox9b的细胞进行谱系追踪（Peron等人，2020），以验证其形成成熟上皮的能力，并阐明Wnt-Lgr活性在斑马鱼上皮稳态中的作用。

除了增殖的Notch阳性细胞外，我们还鉴定出了分泌性肠内分泌细胞和产黏蛋白杯状细胞的转录标志物（Crosnier等人，2005；Ng等人，2005；Wallace等人，2005）。对肠内分泌细胞群的研究发现，这些细胞的谱系可根据其吻尾分布以及所产生的肽激素谱进行区分，这表明在发育中的肠上皮内，激素的产生具有空间上复杂的模式。对无菌（CV）和有菌（GF）斑马鱼的整合比较揭示了微生物组对杯状细胞免疫信号传导的显著影响。我们发现肠道微生物诱导杯状细胞特异性表达干扰素响应性转录因子stat2、多个干扰素诱导基因以及参与白细胞趋化的基因（lect2l、saa、ccl19a.1、ccl19b），这表明杯状细胞参与协调宿主对常规微生物组的免疫反应。

通过对分化谱系的研究，我们鉴定出了具有区域和空间特异性的转录特征。斑马鱼幼鱼肠道的肠上皮细胞，以及在负责蛋白质吸收和代谢的肠道再生上皮细胞中获得了全面的基因表达谱（Park等人，2019）。本研究结果为斑马鱼肠道营养代谢的区域调控特性提供了分子基础。或许更有趣的是，我们还发现了斑马鱼中两种此前未知的细胞谱系。具体而言，我们鉴定出了Best4/Otop2阳性肠上皮细胞，这类细胞可能在后肠上皮中富集。Best4/Otop2细胞是一种特征极不明确的细胞类型，直到近期才在人类结肠中被发现（Parikh等人，2019；Smillie等人，2019）。鉴于斑马鱼在研究肠道发育（尤其是宿主-微生物相互作用方面）方面的应用价值，我们认为斑马鱼将为Best4/Otop2细胞的体内特征分析提供重要价值。此外，我们鉴定出了高表达肠道簇细胞标志物的细胞，其中包括主调控因子pou2f3。簇细胞是一种特征尚不明确的细胞类型，其发育轨迹与分泌谱系相似，但似乎能激活黏膜II型免疫反应。目前尚不清楚斑马鱼类簇细胞是否参与黏膜防御。尽管如此，我们在斑马鱼肠上皮中鉴定出的Best4/Otop2细胞和类簇细胞，凸显了鱼类与哺乳动物肠道之间的相似性。我们还注意到，本研究的数据集与近期一项关于斑马鱼肠上皮细胞分选单细胞谱的研究结果大体一致（Wen等人，2021）。

斑马鱼肠道高分辨率转录组图谱的构建，使我们能够绘制出微生物对每种细胞类型的影响。尽管观察到的某些细胞特异性变化可能源于无菌（GF）培养来源，但我们对已知微生物响应过程的重现表明，这不大可能是主要的混杂因素。重要的是，单细胞技术提供的高分辨率让我们得以在宿主中发现大量未知的微生物驱动过程，并将每个过程解析至不同细胞簇的层面。我们的研究表明，微生物群对生长、发育、代谢和免疫过程的调控具有显著的细胞特异性。举一个例子，我们探讨了微生物群对宿主免疫活性的影响；不过，我们指出，我们的数据还能识别出微生物对多种生理过程的影响。

我们的研究揭示了斑马鱼生殖系编码的免疫基因表达模式此前未知的复杂性，这表明不同肠道上皮细胞类型之间的免疫功能存在精细的分工。吸收型肠道上皮细胞高表达解毒性碱性磷酸酶（Bates等人，2006）以及髓系激活相关的血清淀粉样蛋白A（Kanther等人，2011；Murdoch等人，2019）。相比之下，祖细胞和簇状细胞高表达细菌肽聚糖识别蛋白nod2以及核因子κB通路的核心元件，而肠内分泌细胞和白细胞则大量表达白介素22（il22）——这是一种能激活上皮防御机制的细胞因子（Dudakov等人，2015）。吞噬细胞的特征是促炎细胞因子（如il1b、tnfa和tnfb）表达升高，而间充质细胞则是免疫调节性转化生长因子-β（TGF-β）类细胞因子的主要来源。对常规饲养（CV）和无菌（GF）斑马鱼的对比研究发现，微生物组对上述所有过程均有显著影响，许多免疫效应分子的细胞特异性表达也受其调控。

在GF鱼中，这些介质几乎完全减少、重新定位或消失。未来需要开展研究，以阐明细胞特异性免疫信号对肠道稳态的影响。

为探究去除微生物对幼虫发育的影响，我们聚焦于肠道血管生成过程。在鱼类中，肠道血管系统由成血管细胞形成，这些细胞从后主静脉向腹侧迁移，形成血管丛，并逐渐分化为背侧肠上动脉、腹侧肠下静脉，以及一系列连接动脉与静脉的平行血管（Goi和Childs，2016；Isogai等人，2001；Lenard等人，2015；Nicenboim等人，2015）。我们注意到，无菌（GF）幼虫中关键血管生成调控因子的表达水平降低，尤其是在连接血管形成中具有明确作用的VEGF类受体（Goi和Childs，2016）。对无菌鱼的观察发现，微生物群对动脉和静脉的定位与间距并非必需。相比之下，去除微生物群会对连接血管产生不利影响，这证实了微生物组在肠道血管系统构建中的作用。我们的研究结果与小鼠中的相关观察一致，即无菌饲养也会降低绒毛的血管生成能力（Reinhardt等人，2012；Stappenbeck等人，2002），这表明脊椎动物肠道血管生成过程均需要微生物信号的调控。我们认为，本研究取得的进展将有助于我们解析调控发育中脊椎动物肠道血管生成的分子和细胞网络。

方法详情

无菌斑马鱼的构建

斑马鱼胚胎基本按照 Melancon 等人（2017年）的方法制备为无菌胚胎。收集一批胚胎后进行洗涤，并分为两个组。CV 组置于无菌胚胎培养基（EM）中培养，GF 组则置于添加了氨苄青霉素（100 mg/mL）、卡那霉素（5 mg/mL）、两性霉素 B（250 ng/mL）和庆大霉素（50 mg/mL）的无菌 EM 中培养。CV 组和 GF 组分别每 2 小时用 EM 或含抗生素的 EM 洗涤一次胚胎。当胚胎发育至原肠胚形成50%阶段时，GF 组依次用 EM 洗涤三次，随后在含 0.1% 聚乙烯吡咯烷酮-碘（PVP-I）的 EM 中处理2分钟，再用 EM 洗涤三次，接着在含 0.003% 次氯酸钠（漂白剂）的 EM 中孵育20分钟。之后再用 EM 洗涤三次胚胎，并转移至装有无菌 EM 的组织培养瓶中。CV 组进行相同次数和时长的洗涤，仅用 EM 替代稀释的 PVP-I 或漂白剂。所有操作均在生物安全柜中进行，先以10%漂白剂消毒，再用70%乙醇消毒。我们按照既定流程（Melancon 等人，2017年）在受精后4天检测 GF 组培养瓶中的细菌污染情况。从 CV 组和 GF 组的培养瓶中收集 EM，通过接种到胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板以及针对细菌16S 核糖体DNA的聚合酶链式反应（PCR）来检测细菌。亲代鱼缸水和无菌过滤水分别作为阳性和阴性对照，亲代鱼缸水中经检测确认为有细菌，无菌水中则未检出细菌。后续分析仅使用未检出细菌的 CV 组培养瓶和检出无菌的 GF 组培养瓶。

肠道脉管系统的成像与定量分析

Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼（Wang等人，2010a）在常规水体（CV）或无菌（GF）条件下饲养至受精后6天（dpf），随后用三卡因麻醉，于4℃条件下固定过夜。幼鱼用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，然后包埋于含0.7%超低纯低熔点琼脂糖（Invitrogen 16520）的玻璃底培养皿中。在配备25倍0.95数值孔径水浸HC Fluotar物镜的Leica Falcon SP8共聚焦显微镜下，拍摄整尾斑马鱼的拼接图像和Z轴堆叠图像（切片厚度5微米）。图像通过Leica Application Suite X软件（Leica）进行拼接，随后导入Fiji软件（Schindelin等人，2012）生成最大强度Z投影图像，并对图像的亮度、对比度进行调整，同时进行伪色彩处理。为量化肠道血管情况，在Fiji软件中利用相应明场图像确定肠道边界。随后将荧光图像转换为二值图像，测量kdrl:mCherry信号面积占整个肠道面积的比例。箱线图通过RStudio软件结合ggplot2包绘制生成。

瞬时转基因斑马鱼的构建与分析

利用Tol2试剂盒（Kwan等人，2007年）构建了Tg(tnfrsf11a:GFP)斑马鱼。简要来说，通过PCR从斑马鱼基因组DNA中扩增tnfrsf11a转录起始位点上游3441个碱基对的片段，随后利用KpnI和SacII限制性酶切位点将其亚克隆至5'入门载体。通过限制性酶切消化验证p5E-3.4-tnfrsf11a构建体，随后采用Gateway克隆技术将5'入门载体、中间载体（pME-EGFP）和3'入门载体（p3E-polyA）整合至目的载体（pDestTol2CG2）中。最终构建体同样通过限制性酶切消化验证。为制备瞬时转基因斑马鱼，向1细胞期胚胎中注射约50皮克DNA和25皮克转座酶RNA。注射后的胚胎培养至6天龄（dpf），筛选同时表达cmlc2:GFP且肠道具有GFP信号的幼虫。阳性幼虫经5倍浓度三卡因（tricaine）安乐死，解剖肠道并置于冰浴的磷酸盐缓冲液（PBS）中4%多聚甲醛（PFA）溶液内，4℃固定过夜。随后用含0.75% Triton-X的PBS（PBT）清洗肠道，在含3%牛血清白蛋白（BSA）的PBT（PBTB）中封闭1小时，再于4℃在封闭液中与(1^{circ })抗血清（Invitrogen鸡抗GFP，1:4000稀释）孵育过夜。次日，用PBT清洗肠道，在PBTB中与二抗（1:1500稀释）和Alexa (Fluor ^{TM}) 647鬼笔环肽（Invitrogen A22287，1:2000稀释）孵育1小时。之后清洗肠道，在PBT中用Hoechst 33258（ThermoFisher，H3569，1:2000稀释）复染后封片。使用配备滨松EMCCD（C9100-13）相机的Olympus IX-81转盘共聚焦显微镜，在Volocity 4软件控制下获取Z轴堆叠图像（切片厚度0.3-0.5微米）。Z轴堆叠图像导出后，利用Fiji软件进行处理（Schindelin等人，2012年）。

为单细胞RNA测序制备单细胞悬液

按同一胚胎群收集的斑马鱼按前述方法培养为CV或GF品系。每批取5条幼鱼，置于含5×三卡因的磷酸盐缓冲液（PBS）中安乐死，随后立即用无菌器械解剖肠道，放入1.5毫升微量离心管中的200微升无菌PBS内并置于冰上，交替收集CV和GF品系肠道，直至每种条件下收集到25条（重复1）或55条（重复2）肠道（每种条件共收集80条肠道）。每次重复的总解剖时间控制在2小时以内。解剖完成后，立即将肠道置于1.5毫升微量离心管中，与200微升解离混合液共同孵育30分钟（37℃），该混合液含1毫克/毫升新鲜胶原酶A、40微克/毫升蛋白酶K和0.25%胰蛋白酶（溶于PBS），每10分钟上下吹打40次以促进消化。随后，（重复1）在解离开始时加入ZombieAqua活细胞染料（BioLegend），终浓度为1:1000，以染色死亡和濒死细胞；向解离混合液中加入10%非乙酰化牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液，使终浓度达1%以终止消化；将细胞在0.3相对离心力（RCF）、4℃条件下离心15分钟沉淀细胞；用200微升含0.04%BSA（非乙酰化）的PBS轻柔重悬细胞，随后在0.3 RCF、4℃条件下通过40微米细胞筛（Pluriselect）离心1分钟；将过滤后的细胞通过BD FACS Aria III流式细胞仪分选，收集活的单细胞（ZombieAqua阴性）。或（重复2）向解离混合液中加入10%非乙酰化BSA的PBS溶液，终浓度达1%以终止消化；将细胞在0.3 RCF、4℃条件下离心15分钟沉淀细胞；用200微升含0.04%非乙酰化BSA的PBS轻柔重悬细胞，随后在0.3 RCF、4℃条件下通过40微米细胞筛（Pluriselect）离心1分钟；利用(OptiPrep ^{TM})密度梯度培养基（Sigma，货号D1556-250ML）收集活细胞。具体操作：用2体积(OptiPrep)和1体积0.04%BSA的1×PBS/DEPC处理水配制40%（w/v）碘克沙醇工作液；再用该缓冲液将工作液稀释为22%（w/v）碘克沙醇溶液；取1体积工作液与0.45体积细胞悬液轻柔颠倒混匀；将混合液转入15毫升锥形离心管，用工作液补至6毫升；上层覆盖3毫升22%（w/v）碘克沙醇溶液，再在22%碘克沙醇层上方覆盖0.5毫升含0.04%BSA的PBS；将离心管在20℃、800×g条件下离心20分钟，通过密度梯度分离活细胞；从顶层界面收获活细胞，并用含0.04%BSA的PBS稀释；随后在0.3 RCF、4℃条件下离心10分钟沉淀活细胞；弃去上清液，用含0.04%BSA的PBS重悬细胞。（两次重复均适用）：用血细胞计数板对细胞悬液计数；台盼蓝染色检测细胞活力，所有CV和GF样本的活力均＞95%；将单细胞悬液立即通过10X Genomics Chromium控制器，搭配Chromium单细胞3'文库与凝胶珠试剂盒v3.1进行处理；参照10X Genomics Chromium单细胞3'文库与凝胶珠试剂盒v3方案构建文库；将文库送至诺禾致源（Novogene），该机构通过Nanodrop进行定量检测、琼脂糖凝胶电泳检测文库降解/污染情况、Agilent 2100分析仪分析文库完整性与定量；在Illumina Hiseq平台上进行双端测序，两端读长均为PE150 bp。

单细胞RNA测序数据的处理与分析

对于单细胞分析，使用 Cell Ranger v3.0（10X Genomics）对 Illumina 测序的原始碱基识别文件进行解复用，并将读数比对至斑马鱼参考基因组（Ensembl GRCz11.96）。在 RStudio 中，利用 Seurat R 软件包 3.1 版（Butler 等人，2018）分析 Cell Ranger 输出的矩阵。去除拥有少于 200 个独特分子标识符（UMIs）、超过 2500 个 UMIs 或线粒体读数占比超过 50% 的细胞，以减少低质量细胞和双细胞的数量。随后，使用 Seurat 对整合数据集的表达值进行标准化处理，并以 1.0 的分辨率和 26 个主成分（PCs）进行细胞聚类，其中最佳主成分通过 JackStraw 评分（Macosko 等人，2015）和肘部图确定。在 Seurat 中使用“FindMarkers”功能识别每个聚类的标记基因后，根据斑马鱼中已知的细胞类型标记物或哺乳动物中的同源标记物对聚类进行注释。对图 3D、4E、5H、5I、S5 及 S6 中的基因进行了手动功能注释。

基因本体论（GO）富集分析

使用 GOrilla（基因本体论富集分析与可视化工具）对标记基因（p值阈值＜0.05）以及整合数据集下调基因列表（p值阈值＜0.05）进行分析，以确定基因本体论（GO）条目富集情况（Eden 等人，2009）。采用双列表无排序比对方式分析基因，以整个数据集的基因列表作为背景。为去除冗余的GO条目，利用 REVIGO（精简与可视化基因本体论工具）对 GOrilla 输出的富集条目及相关p值进行处理，选用 SimRel 语义相似性度量标准，允许相似性设为0.4（Supek 等人，2011）。使用 RStudio 中的 ggplot2 手动生成柱状图。

NanoString nCounter 基因表达分析

同一胚胎群的斑马鱼按所述方法分为CV组或GF组。每个培养瓶取15条6天龄（dpf）的斑马鱼，每种条件设置四个重复样本。幼虫在添加5倍浓度三卡因的磷酸盐缓冲液（PBS）中实施安乐死，随后立即用无菌器械解剖肠道，将其置于1.5毫升微量离心管的250微升三唑试剂（Trizol）中并置于冰上。收集到15条肠道后，对样本进行匀浆处理并在-80℃下保存。冷冻后解冻样本，采用标准的三唑-氯仿萃取法分离RNA。样本浓度与质量在送至NanoString Technologies公司前通过安捷伦生物分析仪2100进行检测，随后利用nCounterElementsTM平台进行基因表达分析。

16S 核糖体RNA基因测序

受精后第五天，采用无菌技术解剖幼虫肠道，并将其收集在200微升微珠溶液中。共收集30个肠道，每个重复样本合并10个肠道。使用MoBio超净微生物DNA分离试剂盒（货号12224-250）提取微生物DNA。为评估肠道细菌群落组成，对515正向引物和806反向引物覆盖的16S rRNA基因V4可变区进行测序。质控与测序工作由诺禾致源公司采用Illumina NovaSeq平台PE250完成。序列数据通过QIIME2-2019.10软件进行处理（Bolyen等人，2019）。使用DADA2流程合并双端读数、去除嵌合序列，并生成用于解析扩增子序列变异体的特征表，参数均采用默认设置。DADA2去噪后共得到468,380条读数。剔除所有样本中读数少于200的扩增子序列变异体（ASVs）。采用基于SILVA132_99%全长参考序列训练的朴素贝叶斯分类器进行物种分类注释，并通过NCBI BLAST验证分类结果。随后对序列表进行过滤，剔除未注释、未注释至门水平及注释为真核生物的序列，最终得到441,712条序列，对应59个独特特征。

成年斑马鱼肠道的透射电子显微镜观察

成年鱼按照阿尔伯塔大学生物科学动物护理与使用委员会批准的方案实施安乐死并进行解剖，该委员会依据加拿大动物护理委员会的指导准则开展工作。为制备透射电子显微镜（TEM）样品，分离其后肠，置于2.5%戊二醛、2%多聚甲醛（PFA）和0.1摩尔磷酸盐缓冲液中固定数天。随后，样品用0.1摩尔磷酸盐缓冲液洗涤，再用含1%四氧化锇的0.1摩尔磷酸盐缓冲液处理，之后再次洗涤。肠组织经梯度乙醇系列脱水后，用Spurr树脂进行渗透处理。渗透后的样品被置于扁平模具中，以Spurr树脂包埋，并在70摄氏度下固化过夜。随后，使用Rechert-Jung UltracutE超薄切片机将包埋块切成70-90纳米厚的切片，切片先用乙酸铀酰染色，再经柠檬酸铅染色。图像通过运行电压为80千伏、配备Gatan Orius电荷耦合器件（CCD）相机的FEI-Philips Morgagni 268透射电子显微镜采集。

定量与统计分析

针对CV和GF单细胞RNA测序数据集之间的差异表达分析，除了细胞数量较少的群体（图5、图6和图S5中的白细胞、基质细胞和祖细胞样细胞）外，我们在Seurat中采用经Bonferroni校正的非参数Wilcoxon秩和检验来确定显著变化，针对这些群体则直接进行Wilcoxon秩和检验。在所有情况下，显著性均定义为(p value <0.05)。具体的统计学细节可参见图注。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。