题目：Fovea-like Photoreceptor Specializations Underlie Single UV Cone Driven Prey-Capture Behavior in Zebrafish

原文链接: https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.04.021

期刊：Neuron

研究亮点

l 斑马幼鱼的猎物检测依赖于急性区中特化的单个紫外视锥细胞

l 该区域的高增益紫外锥增强了对紫外高对比度目标的探测能力

l 这种调节的细胞和分子机制与灵类动物中央凹的机制相符

l 紫外线锥细胞的谷氨酸释放层面还会发生进一步的优化

摘要

在眼睛中，同类型光感受器的功能必须进行区域化调节，以处理高度不对称的自然视觉世界。本研究表明，斑马鱼幼虫颞区的紫外视锥细胞专门针对其额上视野中的紫外亮猎物捕获进行了调节，这一过程可能每次仅利用单个视锥细胞的信号。为此，紫外光子的检测概率在区域范围内提升了10倍以上。此外，体内双光子成像、转录组学和计算模型研究显示，这些视锥细胞通过提高突触钙的基础水平来促进亮目标物体的编码，而这又源于光转导基因的表达调节。同时，光驱动的突触钙信号会因与水平细胞的相互作用而在区域上被减慢，随后在驱动视网膜网络的谷氨酸释放层面被增强。这些区域差异与灵长类动物外周视锥细胞和中央凹视锥细胞之间的差异相符，也暗示了二者存在共同的机制起源。

图形摘要

引言

在视觉系统中，光感受器通过持续调节突触释放来驱动视网膜网络（Baden 等人，2013a；Heidelberger 等人，2005；Lagnado & Schmitz，2015；Moser 等人，2020；Regus-Leidig & Brandstätter，2012；Thoreson，2007）。然而，入射光子通量的变化如何导致突触囊泡融合速率的改变，在不同光感受器类型之间存在显著差异（Bellono 等人，2018；Sterling & Matthews，2005；Thoreson，2007）。例如，在脊椎动物视网膜中，慢速的视杆光感受器通常具有较大的外节和高增益的细胞内信号级联，以实现对单光子的敏感性，这是弱光下视觉形成的关键（Field 等人，2005；Lamb，2016；Yau & Hardie，2009）。相比之下，视锥光感受器反应更快，外节更小，信号级联增益更低，以承接视杆达到饱和后的视觉功能（Lamb，2016；Yau & Hardie，2009）。显然，使特定光感受器类型的特性与特定的感知任务相匹配，是视觉功能的关键基础。然而，这些视觉需求在视网膜表面以及视觉空间中的对应位置可能存在巨大差异（Baden 等人，2013b；Hardie，1984；Land & Nilsson，2012；Sancer 等人，2019；Yilmaz & Meister，2013；Zimmermann 等人，2018）。因此，为了实现高效的视觉采样（Cronin 等人，2014；Land & Nilsson，2012），即便是同一类型的视锥细胞，也必须根据其在视网膜上的位置进行功能上的调节。

事实上，即便是在同一类型的感光细胞中，其调谐特性也是无脊椎动物（哈迪，1984；桑瑟等人，2019）和脊椎动物（巴登等人，2013b；博丹等人，2019；辛哈等人，2017）视觉系统的一项基本属性。即便是灵长类动物也利用了这一机制；中央凹视锥细胞的整合时间长于周边视锥细胞，这很可能是为了提高其信噪比，因为在中央凹区域，视网膜神经节细胞（RGCs）不会在空间上整合其输入信号（博丹等人，2019；辛哈等人，2017）。阐明这种功能性调谐背后的机制，对于理解感觉系统如何在自然感官环境中发挥作用，以及它们如何进化以适应新的感官生态位至关重要（克朗宁等人，2014；兰姆等人，2007；兰德与尼尔森，2012；姚与哈迪，2009）。

在此，我们发现斑马鱼幼虫颞区（施密特与唐林，1999）的紫外视锥细胞（“攻击区”[SZ]；齐默尔曼等人，2018）具有选择性调谐特性，能够检测到这些动物的捕食对象（如草履虫）（韦斯特菲尔德，2000；斯彭斯等人，2008）。

结果

斑马鱼幼体捕食行为必须依赖紫外视觉

斑马鱼幼体的捕食行为可由一个亮光点诱发（Bianco 等人，2011；Semmelhack 等人，2014），这与它们的猎物（如草履虫）在自然环境中的呈现特征相符浅水区的上层水柱在阳光照射下会出现这类生物（Zimmermann 等人，2018；图1A）。对于拥有长波长视觉的人类观察者来说（Nathans，1999），这些生物在背光下观察时基本呈透明状（Johnsen 和 Widder，2001）。但以往研究表明，草履虫等浮游动物会散射紫外线波段（320-390纳米）的光，因此会呈现为紫外线亮斑（Novales Flamarique，2012、2016；Zimmermann 等人，2018）。

为了明确验证这一观点，我们定制构建了一套相机系统，其紫外通道和“黄”通道分别与斑马鱼紫外视蛋白以及红/绿视蛋白的吸收光谱相匹配（Chinen 等人，2003）。我们利用该系统，在户外正午阳光下的自然水族箱中，对自由游动的草履虫进行了拍摄（图1B-1E；视频S1；STAR方法）。黄色通道图像能清晰呈现场景背景和水面运动的空间细节，但草履虫在杂乱的背景中难以被识别（图1D，左图）。相比之下，紫外通道的画面主要由散射光形成的垂直亮度梯度构成，这几乎完全掩盖了背景。在该梯度之上，水层上部的草履虫会以明亮的移动斑点形式清晰显现（图1D，右图及1E）。这一发现与斑马鱼的行为及神经机制相吻合：斑马鱼会利用额上侧视野来探测并捕获猎物（Bianco 等人，2011；Mearns 等人，2020；Patterson 等人，2013），而处理该视觉空间区域的视网膜内部回路，对紫外高对比度信号具有强烈的区域特异性偏好（Zhou 等人，2020；Zimmermann 等人，2018）。这证实了从斑马鱼幼体可获取的这两个波段中，能提取出差异极大、且基本无重叠的信息类型（Cronin & Bok，2016）。斑马鱼相对于场景的自身运动，可能会进一步放大紫外与黄色波段之间的差异（图1D、1E；视频S1）。这种运动会在黄色通道中产生显著的亮度变化，而紫外通道则不会。因此，在自然（而非实验室控制）的观察条件下，草履虫在黄色波段中几乎无法被识别，而在紫外波段中则极易被分辨。这有力表明，斑马鱼幼体在自然界中进行视觉猎物探测时，必须依赖紫外视觉，而非消色差视觉或长波长视觉（Cronin & Bok，2016；Novales Flamarique，2016；Zimmermann 等人，2018）。

事实上，紫外线照射显著提升了行为表现：受精后7至8天（dpf）的头部固定幼虫，在有自由游动的草履虫存在时，用紫外线（374纳米）照射比用黄光（507纳米）照射时表现出明显更多的捕食尝试（图1F至1H）。这种差异在对紫外线视锥细胞进行基因消融后消失（图1H，下图；STAR方法）。综合来看，这些结果强烈表明，紫外线视锥细胞为斑马鱼幼鱼的视觉捕食回路提供了主要输入。

图1.紫外线极大地促进了斑马鱼幼体的视觉引导猎物捕获。（A）斑马鱼幼体捕获猎物的视觉示意图。（B）拍摄草履虫的设置。在电荷耦合器件（CCD）相机前放置了一个装有紫外线和黄色带通滤光片的滤光轮，以便在阳光下对自然水箱中的草履虫进行成像。（C）叠加在斑马鱼的四个视蛋白吸收光谱（阴影）上的紫外线和黄色通道的峰归一化光谱（粗线；STAR方法）。表示紫外线和黄色通道与每个视蛋白之间的光谱重叠（细线）。Abs.，吸收；Tr.，透射率。（D）从同一位置连续拍摄的黄色和紫外线通道的示例帧。（E）从（D）放大，按指示提取线轮廓。箭头突出显示紫外线通道中可见的草履虫。另见视频S1。

单个紫外视锥细胞可能发出猎物存在的信号

斑马鱼幼鱼直径300微米的眼睛必然存在有限的空间分辨率（豪格等人，2010），这意味着视觉探测体型更小的猎物是一项巨大挑战。因此，我们着手确定斑马鱼完成这一任务时可利用的紫外线视锥细胞的最大数量。在受精后第8天，斑马鱼幼鱼每只眼睛拥有2400个紫外线视锥细胞。这些细胞分布不均，在视顶盖中心区域的密度是其他区域的三倍（齐默尔曼等人，2018）；在视觉空间中，该中心区域相对于单眼视野中心的方位角为38度，仰角为27度（图S1A）。在静止和捕猎状态下，斑马鱼幼鱼会将169±4.9度的视野分别收敛36度和76度（比安科等人，2011；帕特森等人，2013；特里维迪和博尔曼，2013），使双眼在前方的重叠视野分别达到26度和66度（图S1B-S1D）。基于这些数据，我们计算出双眼紫外线感受器阵列的空间探测极限（图2A-2D及S1A-S1D）。

在发起实际攻击之前，且在双眼视线汇聚之前，斑马鱼必须先探测到猎物（加坦等人，2005年；麦克埃利戈特和奥马利，2005年）。这一过程主要发生在上视野（仰角30度；米恩斯等人，2020年），在该区域，草履虫发出的紫外线信号尤为显著（图1D和1E）。在这一区域内，当目标从双眼视野中心向外侧偏移23度时，猎物探测性能达到最高（米恩斯等人，2020年）。双眼的视顶盖区（SZ）均覆盖了这一区域（图2A、图S1A和图S1B），这证实斑马鱼确实利用了眼睛该部位高密度的紫外线视锥细胞来探测猎物。然而，视顶盖区紫外线视锥细胞的平均间距为(0.19 cones /^{circ 2})，紫外线视锥细胞的感受野直径为0.76度，即便在探测性能峰值时，这一紫外线探测阵列对于这项关键的行为任务而言，仍对视觉空间进行了显著的欠采样（图2B）：幼体斑马鱼可在3.25毫米的距离（比安科等人，2011年）捕捉到猎物（劳伦斯，2007年；威尔逊，2012年），此时猎物所张的视角仅为1.8度。这一数值是奈奎斯特极限下可靠探测所需视角的两倍多。由此可见，斑马鱼一次不太可能使用超过一个紫外线视锥细胞来触发初始的行为反应。

一旦检测到猎物，斑马鱼会朝向猎物移动并使双眼汇聚（Bianco 等人，2011；Gahtan 等人，2005；Jouary 等人，2016；McElligott 和 O’malley，2005；Mearns 等人，2020；Patterson 等人，2013；Trivedi 和 Bollmann，2013）。这会使两个单视区（SZs）在鱼的正前方完美对齐，从而实现对猎物精确位置的立体视觉估算，以便后续捕捉（Patterson 等人，2013；图2D、图S1C和图S1D）。随后，当体长100微米的草履虫出现在1毫米的距离处时，斑马鱼便会发起实际的攻击（Patterson 等人，2013）。形成的视角为5.7度（图2D）。在这个视角大小下，每只眼睛能稳定覆盖两到三个紫外视锥细胞，却很少能覆盖更多。综上，SZ 中的单个紫外视锥细胞很可能是初步猎物探测的基础，触发猎物定向行为。此外，实际的捕食攻击随后很可能由每只眼睛中至多少数几个紫外光感受器来支撑。

图2. 斑马鱼幼体紫外视觉的探测器硬件。(A–D) 眼睛处于初始猎物探测的静止位置时（A），以及探测到猎物后聚焦定位猎物时（C），紫外视锥细胞密度投射到视觉空间的正弦映射图中。一只100微米的草履虫在3毫米距离下太小，无法被可靠探测，因此每次只能被单个紫外视锥细胞识别（B）。即使在1毫米的攻击距离下，它每只眼睛最多也只能覆盖少数几个紫外视锥细胞（D）。3D示意图（A和C）展示了两个攻击区所覆盖的大致视觉空间。比例尺：紫外视锥细胞/。另见图S1A–S1D。(E) 8天龄幼体眼睛的矢状切面，外节（OSs）经BODIPY染色呈品红色，表达绿色荧光蛋白（GFP）的紫外视锥细胞呈绿色（Tg(opn1sw1:GFP)）。(F) (E)的高倍放大切面。注意BODIPY会染色所有光感受器的外节，以及外节正下方的线粒体斑点状凹陷（图S1E–S1G）。还需注意，区域特异性的外节增大仅存在于紫外视锥细胞中。(G) 全眼紫外视锥细胞外节长度的平均值及95%置信区间。V，腹侧；SZ，攻击区；D，背侧；N，鼻侧。开源3D鱼类模型由M.Y.齐默尔曼制作。

紫外锥体外节大小在整个眼睛中的差异超过10倍

由于单锥细胞可能足以检测猎物，且考虑到自然光中紫外线信号相对较弱（Losey 等人，1999；Zimmermann 等人，2018），因此背侧区（SZ）的紫外线锥细胞必须能够高效吸收光子，以支持捕猎行为。相比之下，背侧区外的紫外线锥细胞或许能承受更低的光子捕获概率，从而节省空间和能量，因为可以整合多个紫外线锥细胞的同步信号（例如用于基于紫外线暗轮廓的捕食者检测）（Cronin 和 Bok，2016）。提高脊椎动物光感受器光子捕获概率的一种简单方法是增大其外节——光转导机制的所在部位（de Busserolles 等人，2014；Warrant 和 Nilsson，1998）。为验证这一点，我们对所有紫外线锥细胞进行了基因标记（绿色），使用膜染料 BODIPY 对所有锥细胞的外节进行染色，并通过共聚焦成像评估其形态（图2E-2G）。结果显示，外节长度存在超过10倍的差异。背侧区紫外线锥细胞的外节最长（9.0±0.4 微米），而紧邻的腹侧紫外线锥细胞外节最短（0.6±0.8 微米）。鼻侧紫外线锥细胞的外节长度出现次高峰（7.0±0.5 微米），这些细胞负责观察外部视野，这或许也能支持眼部该区域由紫外线驱动的色觉回路（Zimmermann 等人，2018）。在鲤科鱼类的光感受器中，光子捕获概率（F）与外节长度的立方成正比，公式为：

其中 k 是特定光感受器类型的吸收系数（Warrant 和 Nilsson，1998）。据此，观察到的外节长度从0.6微米到9.0微米的变化，应能使背侧区锥细胞的光子捕获概率提升14倍。综上，全眼紫外线锥细胞密度（系数3）、外节长度（系数14），以及捕猎时双眼背侧区的双眼叠加效应（系数2）共同作用，将导致整个视野内紫外线敏感度在单眼状态下存在42倍的差异，在双眼汇聚的双眼状态下存在84倍的差异。

最后，位于每个外节段正下方的SZ紫外线视锥细胞也具有持续增大的椭圆体（图2F和图S1E-S1G）。这些结构容纳着为光转导提供能量的线粒体（Giarmarco等人，2017；Okawa等人，2008）。线粒体囊可能进一步充当微透镜，将额外的光线聚焦到外节段上（Knabe等人，1997）。由于整个眼睛中椭圆体的二维面积存在超过5倍的差异（图S1G），任何此类聚焦效应都将进一步提升SZ的紫外线检测能力。接下来，我们探究了这些解剖差异如何在活体眼睛的紫外线光反应层面体现出来。

SZ 紫外光感受器具有光偏好性，且具备高增益和长整合时间

为在体内测量紫外视锥细胞的光反应，我们在所有紫外视锥细胞终足中表达了突触标记的荧光钙生物传感器SyGCaMP6f（德罗斯蒂等人，2011年）。我们在相同的opn1sw1启动子（竹内等人，2003年）下共表达了未进行突触标记的mCherry（沙纳等人，2004年），以显示每个视锥细胞的完整形态，并确认SyGCaMP6f的表达仅限于终足（图3A）。对7至8天受精后（dpf）的幼鱼进行双光子成像，像素分辨率为64×16，帧率为62.5赫兹，每次捕捉1至5个紫外视锥细胞终足。这使得我们能够对活体眼睛任意部位的视锥细胞终足钙信号的光驱动反应进行成像。

我们首先展示了来自恒定紫外线背景的明闪和暗闪（详见《STAR 方法》）。呈现一个小至2度的亮点、以90度/秒的速度移动时，可触发猎物捕捉行为（塞梅尔哈克等人，2014年）。若光点完全居中，此类移动刺激最多只会激活单个紫外线视锥细胞30毫秒。不过，草履虫有时移动速度会稍慢（参见补充视频S1和S2），这意味着稍长的刺激时长对猎物检测也具有意义。因此，我们设置了不同时长的明闪和暗闪。在一次记录实验中，我们观察到一个SZ紫外线视锥细胞确实对20毫秒和50毫秒的紫外线闪光有反应，而背侧视锥细胞未表现出可检测的反应（图3B；补充视频S3）。然而，与SZ紫外线视锥细胞相比，背侧紫外线视锥细胞对200毫秒的暗闪反应要强烈得多。

在多次此类记录中，SZ 视锥细胞对光闪均表现出强烈的响应（图3C至3F），包括对20毫秒条件的响应（图3C和3E），这表明SZ紫外视锥细胞确实非常适合检测紫外亮猎物的存在。相比之下，背侧和鼻侧紫外视锥细胞则对暗光更敏感（图3D和3F），这对于发出紫外暗捕食者存在的信号是有用的。

接下来，我们检测了紫外视锥外节段长度的变化（参见图2G）是否与紫外光诱发的突触钙信号振幅的相应差异相关。为此，我们呈现了从黑暗开始的不同振幅的闪光刺激（图3G）。这一实验证实，外节段最长的背侧（SZ）和鼻侧紫外视锥也表现出最大的突触钙信号。为量化这些差异，我们为每个区域的刺激-反应曲线拟合了希尔函数（图3H）。随后，我们确定了反应最小的腹侧紫外视锥的半最大反应振幅，并以此确定能在其他紫外视锥中诱发相同振幅反应的刺激振幅（图3H）。在这一标准下，背侧紫外视锥的反应灵敏度是腹侧紫外视锥的10倍，其次是背侧（SZ）紫外视锥（20倍），最后是鼻侧紫外视锥（40倍）。尽管这一结果在定性上与解剖结构相符，但突触钙信号层面的这些有效增益变化通常大于预期，而且并未与整个视网膜中外节段长度的相对分布直接成正比。这表明可能存在其他作用机制。为检测外网膜抑制在决定紫外视锥突触增益方面的关键作用程度，我们接下来使用氰基喹啉（CNQX；STAR 方法学）对水平细胞（HCs）进行了药理学阻断。然而，这一环路操作并未改变紫外视锥反应的相对顺序。不同区域的视锥细胞反应曲线以及整体曲线仅出现轻微的振幅变化（图3J）。尽管如此，背侧区（SZ）和鼻侧紫外光视锥细胞现在表现出更相似的反应振幅，这与其外节段长度的相似性相符。实验测得的突触钙反应敏感度（图3J）与外节段解剖结构预测值（图2G）之间仍存在的差异，可能与钙生物传感器的非线性（Chen等人，2013；Dreosti等人，2009）、突触钙处理的潜在差异（Frank等人，2009）以及光转导过程的变化（见下文）共同相关。

图3.活眼中锥形钙的成像。（A）突触靶向GCaMP6f（绿色，Tg（opn1sw1：SyGCaMP6f））在UV锥体（洋红色，Tg（opn1sw1：nfsBmCherry））中的共聚焦图像。（B）平均和单试验背侧和SZ单锥体2光子钙响应不同持续时间光-（((6 ×10^{5} photon / s / mu m^{2}))和暗步骤((0 photon / s / mu m^{2} ))从恒定的紫外线背景（((2.4 ×10^{4} photon / s / mu m^{2}))（C）对来自腹侧、鼻、背侧和SZ锥体（V、N、D和SZ；(n=9,21,23)和29，分别）的相同刺激的平均钙响应。阴影表示±1 SD。左图显示对20毫秒光步长的响应扩大。（D）（C）峰值振幅的平均和95%置信区间。

接下来，紫外线视锥细胞之间的钙动力学也存在差异。具体而言，SZ型紫外线视锥细胞在受到闪光刺激后，恢复至基线水平的速度尤其缓慢（图4A和4B）。当猎物的图像穿过光感受器阵列时，这种延长的反应可能有助于突触后回路整合多个SZ型紫外线视锥细胞的时间信号。相比之下，暗闪光刺激后的恢复速度与眼睛其他区域相比要么相似，甚至略快（图4C和4D）。为探究SZ型紫外线视锥细胞恢复动力学缓慢的潜在机制，我们再次阻断了水平细胞。结果显示，与紫外线视锥细胞的振幅不同（参见图3J），紫外线视锥细胞的动力学明显受此操作影响（Chapot等人，2017a），且呈现出区域特异性特征（图4E和4F）。在没有反馈的情况下与水平细胞相比，视黄醛紫外线敏感视锥细胞的恢复动力学显著加快，而其他紫外线敏感视锥细胞未受到显著影响。

图4. 紫外视锥细胞的时间调谐特性。(A) 对来自黑暗 (0 光子/s/μm2) 的 200 毫秒闪光 (6 × 105 光子/s/μm2) 的平均值 ± 1 SD 响应。 (B) (G) 中恢复时间常数的箱线图和小提琴图。对于 SZ、D、N 和 V，n 分别 = 29、29、23 和 13。 (C 和 D) 与 (A) 和 (B) 相同，但用于同等对比度的暗闪光。对于 SZ、D、N 和 V，n 分别 = 27、24、19 和 13。方差分析测试 *p < 0.02，*****p < 0.0001（H 和 J）。 ns，不显著。(E) 使用 CNQX（绿色）进行 HC 阻断之前（紫色阴影）和之后对黑暗中 5 毫秒闪光的平均值 ± 1 SD（阴影）钙反应。 (F) 104 光子/锥体 5 毫秒 UV 闪光后恢复时间常数的量化。对于控制条件，SZ、D、N 和 V 分别为 n = 51、29、46 和 17，HC 块后 n = 51、32、46 和 19。方差分析检验 ****p < 0.01，****p < 0.001。 ns，不显著。

紫外线依赖的猎物探测在感觉区外难以实现

结合我们从紫外视锥细胞分布和体内反应特性中获得的数据，我们建立了一个简单的线性模型，用于估算幼斑马鱼的单眼紫外探测阵列能够如何检测不同类型的紫外刺激（STAR 方法）。为此，我们首先记录了单只眼睛中每个紫外视锥细胞的位置，并将其0.76个感受野投射到视觉空间中（图5A；参见图2A、2C、图S1A和图S1C）。接下来，我们假设一个明亮的双目标以平均每秒100的速度移动，并呈现近似自然的转向行为，以此计算出一系列在该阵列上的随机游走刺激路径（Jung等人，2014；Shourav和Kim，2017）。该模拟验证了我们此前的计算结果：单个此类目标几乎从不会（((<0.1%)的时间）同时覆盖两个紫外视锥细胞（图5B）。事实上，在大多数时间里（((>60%))，超过60%），该目标会从探测阵列的间隙中穿过，从而不覆盖任何紫外视锥细胞。即便将所有非紫外视锥细胞也纳入计算（STAR 方法），单次覆盖的任意类型视锥细胞的最大数量仍为三个，而单个视锥细胞被覆盖的概率最高，达到40%（图5B，下方）。

随后，我们根据钙成像结果，为每个视锥细胞感受野基于其在眼中的位置分配了闪光和暗闪的反应幅度及衰减时间常数（图5C，对比图3D；STAR 方法）。为此，我们还计算了一个移动方式相同但尺寸更大（5）的暗目标——用于模拟小型或远处的捕食者——的相关参数。激活的紫外视锥细胞。在展示的模型响应中，当物体穿过视网膜不同区域的单个视锥细胞的感受野时，这些视锥细胞对任一物体均产生稀疏响应。模型明确预测，浅色物体在半暗带（SZ）中最易被检测到（图5D；视频S4）。即使只添加少量噪声，除基于半暗带的此类紫外光检测外，其余检测方式几乎都会迅速失效。一群突触后双极细胞（BCs）会进一步放大任何可检测性的差异，在模型中这些双极细胞仅对固定半径内所有紫外视锥细胞的信号进行求和。通过整合多个紫外视锥细胞的信号，双极细胞还能利用半暗带紫外视锥细胞较慢的光恢复时间这一特性（图5E；对比图4A和4B；STAR方法）。相比之下，沿同一路径移动的大型深色物体在整个视网膜阵列范围内均可被检测到（图5F）。在此情况下，背侧紫外视锥细胞稍大的响应幅度，大致被视网膜腹侧半更多的紫外视锥细胞数量所抵消。这使得双极细胞水平上的深色响应在整个视野范围内呈现出近似均一的状态（图5G）。

图5. 小型移动靶标激活紫外视锥细胞的模型。(A) 模型设置。整个视野中的单眼 UV 锥体分布（灰点），模型双极细胞 (BC) 阵列叠加（实心圆圈）和目标路径黑线。 SZ 位于左上象限中心，对应于上额视野。 (B) 移动 2° 所接触的锥体数量，绘制为随时间变化的迹线，直方图位于右侧。上图：紫外线锥。底部：任何类型的圆锥体。 (C) 四个示例视锥细胞模型视锥细胞激活的时间轨迹，取自阵列中的代表性区域。低于和高于零的响应分别对应于响应 2° 亮和 5° 暗目标的激活。 (D) 2° 明亮目标的整个路径上每个锥体的最大激活水平，标准化为整个阵列的峰值激活。 (E) (D) 中由 UV 锥体驱动的 BC 激活。 (F 和 G) 与 (D) 和 (E) 相同，但针对的是 5° 暗目标。

综合来看，紫外线视锥细胞密度差异（图2A）、外节大小差异（图2E-2G）以及突触前钙驱动释放层面的体内反应特性差异（图3和图4）共同作用，有力表明利用紫外线探测阵列检测草履虫的过程，在SZ区域会受到显著且特异性的促进，或许在所有区域均如此，而在视野的其他大部分区域则几乎不可能实现。

接下来，我们探究了SZ紫外线视锥细胞对光刺激的反应偏好发生显著转变的潜在机制。为此，我们重新对全眼光诱导的钙信号进行了在体记录。

钙基线差异驱动明暗反应的差异性

为了以单突触分辨率同时记录矢状面内全部120个视锥细胞足突，我们转而对整个眼球进行更高空间分辨率的扫描（STAR 方法）。在这种配置下，在恒定紫外线背景下，SyGCaMP6f 信号的基础亮度在视顶盖（SZ）中持续升高（图6A）。这种亮度梯度与SyGCaMP6f的差异表达水平无关。当同一只动物在活体成像后被固定，并对SyGCaMP6f的绿色荧光蛋白（GFP）部分进行染色时，区域间的亮度差异便消失了（图6B）。这表明活体眼球中SyGCaMP6f信号的升高与视锥细胞足突钙基线的组成型变异相关（图6C）。因此，我们进一步探究了视锥细胞之间钙基线的变化规律，以及这一变化反过来可能如何影响它们对明暗刺激的编码能力。

为了探究这一想法，我们呈现了一种简单的阶梯式刺激，其紫外线对比度在50%对比度的平均背景下从0%到100%变化（图6D；视频S5）。在每一次重复的交替中，这种紫外线刺激会叠加在基于斑马鱼自然栖息地光谱先前测量的自然主义红-绿-蓝（RGB）背景上（STAR 方法）。最后，在完成(n=5)个完整循环后，我们发出一次极亮的紫外线闪光，使钙浓度降至光诱导的最低值。以此为基准，我们将每个紫外视锥细胞的完整动态范围计算为所有灯光关闭时（钙浓度最高）与所有灯光开启时（钙浓度最低）SyGCaMP6f信号的差值。基于这一完整动态范围，我们进一步计算了在自然刺激且紫外线保持50%对比度时每个视锥细胞的基线。全眼钙基线的估算结果与此前在未受刺激的眼睛中观察到的亮度差异一致。信号基线在背侧区（SZ）达到最大值，随后在鼻侧视野附近出现第二个较平缓的峰值（图6E；参见图6C）。

接下来，我们具体比较了在不同区域的自然背景光照下，对0%和100%紫外线对比度闪光的反应幅度。与钙基线类似，这一结果清晰表明，平均而言，背侧区的明暗反应最均衡，其次是鼻侧视野，而背侧和腹侧的紫外线视锥细胞均表现出强烈的暗偏好（图6F）。

为量化这种明暗偏好行为，我们从每个视锥细胞计算了暗-光指数（DLi）（图6G；见STAR方法），其中DLi为1表示视锥细胞仅对暗刺激有反应，而DLi为-1则对应完全偏向光刺激的反应。DLi为0表示对暗刺激和光刺激的反应程度相等。这一结果显示，DLi会随眼位变化，在SZ区以及鼻侧水平线附近观察到最均衡的反应，这与先前观察到的钙基线（图6G；对比图6C和6E）及反应特性（对比图3F）的逐渐变化规律一致。相比之下，腹侧和背侧区域的DLi始终为负值。

图6. 钙基线可预测暗光反应。（A 和 B）活体 Tg(opn1sw1:SyGCaMP6f) 斑马鱼在 3 × 105 光子/s/μm2 紫外背景光下的 UV 锥 SyGCaMP6f 的全眼矢状视图 (A) 以及使用抗 GFP 抗体对 SyGCaMP6f 进行免疫染色后的全眼矢状视图 (B)。 (C) (A) 中每个锥体的实时 SyGCaMP6f 信号与 (B) 中固定信号之间差异的平均值和 95% 置信区间，红线表示与零显着不同的区域。 (D) 在没有和有光谱宽背景光的情况下，从恒定亮度 UV 3 × 105 光子/s/μm2 到 0 光子/s/μm2 暗和 6 × 105 光子/s/μm2 光步骤的平均和个体试验单锥响应。重复五次后，采用 1.5 × 107 光子/秒/μm2 紫外光步骤将钙驱动至最低（右）。(E) 钙基线相对于所示完整动态范围的平均值和 95% 置信区间，后面有单个数据点。 (F) 指定区域中所有 UV 锥体的钙对明暗对比与自然 RGB 背景光的响应的平均值 ± 1 SD。迹线被移动和缩放以对齐基线和峰值暗响应。 (G) 暗光指数 (DLi) 的平均值和 95% 置信区间，后面有单个数据点。

直接对比时，钙基线与DLi呈强相关（((rho=0.85))：钙基线越高，DLi也越高（图S2A-S2D）。不同眼区的紫外锥仅占据了看似是连接DLi与钙基线的单一连续体的不同范围。综上，我们的全眼成像数据有力表明，钙基线的系统性变化与紫外锥对明反差或暗反差的偏好密切相关。

HC 并非 DLi 区域差异的基础

紫外线视锥细胞间钙基线的差异可能由视锥细胞自身特性的差异或与水平细胞（HCs）的相互作用差异所驱动（Chapot 等人，2017b；Van Hook 等人，2019；Klaassen 等人，2012；Thoreson 与 Mangel，2012）。在后一种情况下，水平细胞提供的紧张性抑制输入强度可能存在变化（参见图3H、3J、4E和4F），这或许会导致视锥细胞基线发生变化，进而使差异光强度（DLi）产生波动。若情况属实，那么阻断水平细胞的反馈信号应能特异性地升高背侧和腹侧视网膜的低差异光强度值。然而实际观察到的结果却恰恰相反。对水平细胞进行药理学阻断并未升高背侧或腹侧的差异光强度值，反而略微升高了视顶盖（SZ）附近的差异光强度值，同时降低了鼻侧地平线处的数值（图S2E和S2F；STAR 方法学）。因此，与反应动力学不同（参见图4E和4F），水平细胞不太可能是导致紫外线视锥细胞间差异光强度值发生偏移的主要因素。相反，各紫外线视锥细胞自身特性的内在差异可能是主导因素。那么这些差异具体是什么呢？

光转导级联基因的差异表达与区域紫外视锥细胞调节的多个方面相关

为了找出可能是紫外线视锥细胞功能区域差异基础的紫外线视锥细胞内在差异，我们采用了转录组学方法（Stark 等人，2019）。为此，我们解剖了所有紫外线视锥细胞中表达绿色荧光蛋白的完整视网膜，并通过手术将感觉区（SZ）与视网膜其余部分（非感觉区）分离。随后我们对紫外线视锥细胞进行解离和荧光激活细胞分选，以进行后续的转录组分析（图7A；STAR 方法）。光转导相关基因在感觉区和非感觉区样本的转录组中占主导地位，其中紫外线视蛋白是表达量最高的蛋白质编码基因（图7B和7C）。光转导基因在感觉区样本中的表达水平普遍更高（图7D），这与其更大的外节尺寸相符（参见图2）。因此，为了比较关键光转导基因的相对表达量，我们将每个样本中各基因的表达水平按相应紫外线视蛋白的表达水平进行了标准化处理（图7E）。结果显示，部分关键光转导基因在感觉区的表达相对较高（如gc3），而另一些则表达下调（如cnga3或gngt2b）。基于我们对光转导过程的全面深入了解（Fain 等人，2010；Lamb，2013；Pergner 和 Kozmik，2017；Pugh 和 Lamb，1993；Yau 和 Hardie，2009），每一种这类调控变化都与特定的功能效应相关联（Invergo 等人，2013，2014）。

为了定量探究所有基因相对表达变化的总和可能如何影响光转导级联反应中激活因子与抑制因子的相互作用（Hurley, 1987; Pugh and Lamb, 1993; Pugh et al., 1999），我们采用了一种针对纤毛型光感受器光转导过程的计算模型（Invergo et al., 2013, 2014; 图7F）。我们保持模型的所有预设参数不变，仅根据SZ组与非SZ组之间观察到的表达差异，调整光转导相关元件的相对水平。通过这种方式，我们验证了能否通过特定的调控操作，将非SZ型视锥细胞（模型默认状态）转化为SZ型视锥细胞。事实上，仅改变四个差异表达水平最高的靶基因（转导蛋白、GC3、恢复蛋白2[Rec2]和CNG），在表型上就重现了SZ型视锥细胞中组成性基线水平的升高以及光反应振幅的相应增加（图7G）。单个基因产物相对表达水平的调控可能产生显著影响，其中转导蛋白和GC3的影响最为突出，恢复蛋白2的影响也较为明显（Dizhoor et al., 1991; Zang et al., 2015; 图7H）。值得注意的是，在灵长类动物中，外周与中央凹L/M型视锥细胞之间的转导蛋白表达也存在系统性调控差异（Peng et al., 2019），这表明该基因可能是调控视锥细胞功能的一个调控热点。

接下来，我们使用相同的光转导模型，进一步探究分子调节对紫外视锥细胞反应的动力学（图7I和7J）以及增益（图7K至7M）可能产生的影响。在此，我们的光转导模型预测，SZ组的恢复动力学略快于非SZ组（图7J；参见图7I）。最后，我们的光转导模型还预测，与眼睛其他部位相比，SZ组的紫外视锥细胞增益会发生3倍变化（图7K和7M），这在定性上将SZ紫外视锥细胞的钙成像数据与鼻侧、腹侧和背侧紫外视锥细胞的平均增益进行比较时，捕获到了小幅的增益提升（图7L）。这初步表明，光转调谐可能是最终导致突触前钙水平上观察到的紫外视锥细胞显著增益差异的一个额外因素（图3G和3H）。

综合来看，我们的转录组学数据和光转导模型有力地表明，紫外视锥细胞全眼功能异质性的多个方面（参见图3、图4和图6）都与光转导的差异调控相关（图7）。

图7. 光转导级联的调节提高了SZ基线水平。（A）紫外视锥细胞RNA测序（RNA-seq）流程。解剖7天龄（dpf）斑马鱼Tg(opn1sw1:GFP)的视网膜，并将其分为背侧特殊区域（SZ）和非背侧特殊区域（非SZ）。细胞解离后，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出紫外视锥细胞，随后立即快速冷冻。之后对样本进行文库制备，用于下一代测序。(B和C) 紫外视锥细胞中所有检测到的基因按表达标签排序，其中光转导基因已标注（B），并放大展示前200个基因（C）。表达量最高的两个基因均为非蛋白编码基因，因此紫外视蛋白是表达量最高的蛋白编码基因。(D) 背侧特殊区域（SZ）与非背侧特殊区域（非SZ）样本组的平均基因表达比率，其中光转导基因已标注。(E) 与(D)一致，但以每个样本组中紫外视蛋白的表达水平进行标准化处理，并放大展示高表达的光转导靶基因。绿色和灰色标记分别代表光反应的激活因子和抑制因子。误差棒代表均值标准误（SEM）。

活体下锥细胞突触释放的成像研究

我们接下来探究了活体眼睛中，紫外线视锥细胞突触钙的观察变化是否以及如何转化为光驱动的突触囊泡释放速率。

为解答这一问题，我们通过在突触后水平细胞中表达荧光谷氨酸生物传感器SFiGluSnFR（Marvin等人，2018年），实现了对活体眼睛中单根视锥细胞的谷氨酸光学记录。水平细胞在特化的内陷结构处与视锥细胞接触，这种结构能为细胞外基质提供部分扩散屏障（Chapot等人，2017a；Regus-Leidig与Brandst€atter，2012年），这意味着其树突可充当特异性且空间受限的谷氨酸感受器（Chapot等人，2017a）。从整体来看，斑马鱼眼睛中的水平细胞会与四种视锥细胞均形成接触（Klaassen等人，2016；Li等人，2009；Yoshimatsu等人，2014年），因此水平细胞树突信号中仅有一部分对应紫外视锥细胞的突触释放。为识别这些接触位点，我们在紫外视锥细胞中共同表达了mCherry（图8A-8C）。在鼻侧视网膜的一次示例记录中，我们施加了12.8赫兹的四色二元噪声刺激（Zimmermann等人，2018年；STAR方法），并从支配一排相邻视锥细胞的水平细胞树突处记录谷氨酸信号（图8D；视频S6）。在八个感兴趣区域（ROIs）中，每个区域均覆盖一个假定的单根视锥细胞输出位点，其中两个区域基于mCherry的共表达被鉴定为紫外视锥细胞sion（感兴趣区3和7）。在所有8个感兴趣区的谷氨酸反应中（图8E），为两个紫外视锥细胞提取的轨迹示例片段彼此非常相似，但与所有其他轨迹截然不同（图8E和8F）。此外，每个感兴趣区对噪声刺激的反应的反向相关分析显示，两个紫外视锥细胞具有显著的紫外成分，而所有其他位点则具有多样的非紫外成分（图8G）。这有力地表明相邻感兴趣区之间不存在谷氨酸溢出（另见Chapot等人，2017a；Franke等人，2017；James等人，2019的讨论）。因此，我们的方法能够以单个视柄分辨率在活体眼中记录紫外视锥细胞驱动的谷氨酸信号。接下来，我们利用该方法比较了眼睛不同部位紫外视锥细胞的钙-谷氨酸传递函数。

图8. 突触释放加剧了紫外视锥细胞之间的功能差异。（A和B）视锥细胞突触内陷处水平细胞树突的示意图。水平细胞树突中表达的SFiGluSnFR定位精准，可检测任意类型视锥细胞单个终扣处带状突触（棒状结构）释放的谷氨酸。与以往一样，通过共表达mCherry可识别紫外视锥细胞。OS：外节；ONL：外核层；OPL：外网层；INL：内核层。（C）水平细胞中SFiGluSnFR与紫外视锥细胞中nfsBmCherry的在体双光子成像图。（D）SFiGluSnFR记录的扫描视野。单个视锥细胞终扣处的水平细胞树突束清晰可见。与mCherry信号重叠的区域3和7对应紫外视锥细胞。基于像素间时间相关性的图谱（Franke等人，2017）可凸显每个视锥细胞终扣的局部活动。（E）（D）中感兴趣区域对四色二进制噪声刺激的谷氨酸平均响应及单次试验响应的部分示例曲线（STAR实验方法）。紫外视锥细胞响应以品红色标注。（F）不同感兴趣区域对之间谷氨酸响应的相关性。仅区域3和7之间呈现高度相关。色标基于各感兴趣区域的偏好响应，如（G）所示。（G）通过反向相关分析得到的各感兴趣区域对四色噪声刺激响应的线性滤波器（“核函数”）。R、G、B、U分别代表红、绿、蓝和紫外光。星号标注紫外视锥细胞。（H）背侧和腹侧紫外视锥细胞对四色噪声刺激的平均钙（SyGCaMP6f）与谷氨酸（SFiGluSnFR）响应的部分示例曲线。背景阴影标注紫外光和暗刺激时段。箭头突出显示腹侧紫外视锥细胞相较于背侧紫外视锥细胞的谷氨酸响应瞬时增强。（I）不同区域紫外视锥细胞钙响应的傅里叶域信噪比及由此产生的信息传输速率。（J）与（I）一致，为谷氨酸响应的计算结果。腹侧（S）、背侧（D）、鼻侧（N）和颞侧（V）视锥细胞钙响应的数值分别为35、20、28和18，谷氨酸响应的数值分别为51、20、22和18。

谷氨酸释放加剧了突触前钙的既有差异

在自然界中，动物探索视觉环境时，光感受器会持续暴露于快速变化的明暗信号流中。为探究眼睛不同区域的紫外视锥细胞如何差异化编码复杂的明暗序列，我们记录了钙和谷氨酸对四色二元噪声刺激的反应。对SZ区和背侧紫外视锥细胞受该刺激后的平均钙反应（上图）与谷氨酸反应（下图）进行叠加分析，结果显示这两个区域之间的突触传递存在显著差异（图8H；视频S7）：尽管钙层面的反应相对相似（上图），但只有SZ区的紫外视锥细胞对刺激反转速度最快的部分产生强烈反应（下图，箭头）。这些差异无法用GCaMP6f（Chen等人，2013年）和SFiGluSnFR（Armbruster等人，2019年；Marvin等人，2018年；图S3A）的动力学差异来解释，在钙层面仅能微弱观察到，但在谷氨酸层面则被显著放大。四个区域均观察到了性质相似的效应（图S3B–S3E）。

为了确定这些差异如何与可从其中线性解码的信息量相关联在每种情况下的反应中，我们基于傅里叶域中的信噪比（SNR）计算了信息率（图8I和8J；van Hateren和van der Schaaf，1998）。无论是在钙水平还是谷氨酸水平，线性可解码信息最多的均为SZ视锥细胞，其次是鼻侧、背侧，最后是腹侧紫外视锥细胞。此外，SZ对刺激快速变化的谷氨酸反应更为显著，这使其具有更高的信噪比，尤其是在高频域。因此，我们的谷氨酸成像实验表明，紫外视锥细胞在解剖结构（图2）、光转导（图7）、周围抑制性网络的输入（图3和图4）以及突触钙（图3、4、5和6）层面的差异性调节，在突触释放层面（图8）得到了保留，甚至可能进一步增强。

讨论

我们的研究表明，斑马鱼幼鱼可能会单次利用单个紫外视锥细胞来检测其赖以生存的紫外亮微生物（图1和图5）。为此，视网膜感觉区（SZ）的紫外视锥细胞分布尤为密集，且外节显著膨大（图2和补充图S1），以此提高局部紫外光子的检测概率。这一结构特点还得到了这些紫外视锥细胞突触钙基线水平升高的补充（图3和图6），而该升高很可能源于光转导机制的分子重调（图7）。此外，水平细胞（HCs）会选择性地减缓闪光刺激后感觉区紫外视锥细胞的恢复动力学过程（图4）。这些机制共同作用，使斑马鱼幼鱼对紫外亮信号事件的编码动态范围得以扩大（图3），并提升了其信息传递的能力。

在囊泡释放的层面穿过突触驱动视网膜回路（图8）。因此，SZ区域的紫外锥细胞经过精细调节，以支持对猎物的视觉检测。相比之下，紫外检测阵列的其余部分密度更低，其外节更短，钙基线也更低，用于检测捕食者等大型紫外暗物体。在此过程中，非SZ区域的紫外锥细胞信号发放更稀疏，推测也更节能。

脊椎动物光感受器调谐的机制

据我们所知，所有有视觉的脊椎动物至少都具有轻度的颞区或中央区，在某些物种中，如许多灵长类动物、猛禽以及部分爬行动物和鱼类，这些特化区域进一步进化出了中央凹（布林曼，2019；布林曼等人，2018；科林等人，2000；兰德，2015）。然而，除了灵长类动物（鲍丁等人，2019；辛哈等人，2017）、小鼠（巴登等人，2013b）以及如今的斑马鱼外，大多数这些物种中光感受器功能区域调节可能性的数据仍有待补充。在这后三种动物中，均已发现视锥细胞功能存在区域调节现象。

在很多方面，斑马鱼背侧紫外线视锥细胞功能调节的“目的”以及潜在的细胞和分子机制，都让人联想到灵长类视网膜外周视锥细胞与中央凹视锥细胞之间的差异（Baudin 等人，2019；Curcio 等人，1990；Kemp 等人，1988；Mowat 等人，2008；Peng 等人，2019；Sinha 等人，2017）。例如，在斑马鱼背侧紫外线视锥细胞和灵长类中央凹视锥细胞中，其外节均呈细长形态（Curcio 等人，1990；Packer 等人，1989），且光反应动力学特征也具有相似性速度变慢（博丹等人，2019年；辛哈等人，2017年）。在灵长类动物的中央凹中，视杆转导蛋白γ亚基的表达被认为是导致反应动力学变慢的一个决定因素（彭等人，2019年），这与我们在斑马鱼视锥细胞中发现的视锥转导蛋白γ亚基水平降低这一结果在概念上相关联。在上述两种情况中，这些结构和功能的改变都与检测少量光子的能力提升以及后续的信号处理过程相关。在灵长类动物的中央凹中，这些改变对于抑制噪声、为低汇聚的突触后视网膜网络提供支持至关重要（阿拉-劳里拉等人，2011年；安圭埃拉和里克，2013年）。明确斑马鱼视上区的突触后网络与灵长类动物中央凹的相似程度，将是未来一个重要的研究方向。不过，目前已经可以明确的是，降低噪声对斑马鱼视上区紫外视锥细胞而言同样是一项优势。与灵长类动物和斑马鱼不同，小鼠仅存在一个与鼻上方视觉空间对应的极轻微的中央区（布莱克特等人，2014年；德吕格尔和奥尔森，1981年；萨利纳斯-纳瓦罗等人，2009年）。但小鼠的视网膜背腹轴上存在显著的视蛋白表达梯度（塞勒等人，2000年），这与明暗对比的差异化处理相关联（巴登等人，2013年b），与斑马鱼紫外视锥细胞中观察到的差异高度一致。然而，与斑马鱼不同，小鼠腹侧短波长视觉具有暗视觉偏好（巴登等人，2013年b），这恰恰体现了光感受器可通过灵活的调节方式来支持特定视觉任务的特性。

在大多数情况下，小鼠和灵长类动物视网膜表面不同视锥细胞调优特性形成的具体细胞及分子机制仍有待阐明。基于我们的研究，我们预计在转基因斑马鱼幼体中开展高通量体内实验的可能性，将成为研究光感受器调优机制的重要优势。

不对称的视网膜外层回路参与紫外视锥的调谐

在完整的眼睛中，光感受器很少单独发出信号。相反，无论是无脊椎动物还是脊椎动物，它们往往与邻近的光感受器和/或局部反馈回路错综复杂地相互连接（Heath 等人，2020；Masland，2001；Schnaitmann 等人，2018）。因此，局部调整周围回路与单个光感受器的相互作用方式，为区域调节提供了另一种潜在机制。本研究在斑马鱼幼体中证实，水平细胞（HCs）在眼睛的不同部位与紫外视锥细胞（UV cones）存在差异化的相互作用（图3G-3J、4E、4F、图S2E和图S2F）。总体而言，阻断水平细胞回路对背侧和腹侧视网膜的紫外视锥细胞功能几乎没有影响（在鼻侧视网膜中通常也仅产生微弱影响），而在背侧-腹侧（SZ）区域的紫外视锥细胞中，HCs 显著调节了恢复动力学和反应振幅。此前针对小鼠视锥细胞的成像研究同样报告，在无 HCs 存在的情况下，视锥细胞的反应普遍加快。然而，与之相反的是，金鱼（Kamermans 等人，2001 年）和灵长类动物（Sinha 等人，2017 年）视锥细胞的电生理记录显示，在无 HC 反馈的情况下，其反应变慢。值得注意的是，除 HCs 外，斑马鱼外视网膜还接受丛间细胞的神经支配（Esposti 等人，2013 年；Robles 等人，2014 年），这可能在塑造紫外视锥细胞功能方面发挥额外作用。未来的重要研究方向是，斑马鱼外视网膜去耦合的区域效应在多大程度上适用于其他视锥细胞类型或双极细胞树突，以及这些效应是否与 HC 环路功能分布的推定差异相关。

接下来，其他视锥细胞是否会以及如何与紫外视锥细胞发生区域性相互作用，仍是一个尚未解决的问题。不过，视杆细胞与紫外视锥细胞的相互作用似乎不太会对紫外视锥细胞的调谐特性产生显著影响。首先，在受精后7天（7 dpf），斑马鱼的视杆细胞仍局限于眼睛的背侧和腹侧两极（Zimmermann 等人，2018），这与水平细胞对紫外视锥细胞的影响分布恰好相反。其次，在这个发育阶段，视杆细胞被认为尚未成熟（Branchek 和 Bremiller，1984）。第三，在包括成年斑马鱼在内的各类脊椎动物中，视杆的功能往往与红、绿视锥细胞的神经环路和功能联系更为紧密（Baden 和 Osorio，2019；Behrens 等人，2016；Li 等人，2012）。

通过突触带实现的突触调节

除了改变外节的形态和生化特性外，我们的研究结果进一步表明，视柄在功能上会进行调节，以支持眼睛不同部位紫外光感受器细胞中不同模式的钙依赖性囊泡释放。视锥细胞采用带状突触，这一直是研究神经回路功能调节的关键重点（Baden 等人，2013a；Bellono 等人，2018；Heidelberger 等人，2005；Lagnado 和 Schmitz，2015；Moser 等人，2020；Regus-Leidig 和 Brandstätter，2012；Sterling 和 Matthews，2005；Thoreson，2007；Wichmann 和 Moser，2015）。例如，鳐鱼和鲨鱼的电感觉带状突触在突触离子通道和带状形态层面均进行了差异化调节，以支持对这两类动物所需的不同信号频带进行编码（Bellono 等人，2018）。事实上，不同物种和不同感觉模式的带状突触具备极为多样的功能特性，且总体而言，每一类突触的结构与功能都可与其特定的信号传导需求紧密关联（Heidelberger 等人，2005；Lagnado 和 Schmitz，2015；Moser 等人，2020；Sterling 和 Matthews，2005；Thoreson，2007）。因此，尽管带状突触并不在支持不同功能任务的不同神经元组中存在显著差异，但据我们所知，这种调节方式尚未在单一神经元类型中得到研究。因此，未来有必要确定斑马鱼紫外线受体神经元中观察到的突触传递功能差异是否存在以及如何存在视锥细胞可与突触本身的结构和分子差异联系起来。

如何检测小型且移动的紫外高亮度猎物

如前所述，斑马鱼首次探测到紫外线亮猎物时，其落在视网膜背面的图像尺寸几乎只相当于单个紫外线视锥细胞外节的大小。然而，从行为学角度来看，斑马鱼只有在猎物移动时才会做出反应（塞梅尔哈克等人，2014年），而这至少需要两个感受器来解码刺激物中成角度的时空轨迹。这就引出了两个关键问题。单个紫外线发出的强光信号如何视锥细胞如何可靠地传递到突触后回路，其运动又该如何编码？

脊椎动物的光感受器是“关闭型”细胞，这意味着通过其正向整流突触传递短暂的开启信号可能具有一定难度（Baden 等人，2013a；Heidelberger 等人，2005）。相反，视锥带状突触尤其擅长通过在前一开启信号期间的充盈期后，以瞬时囊泡释放的瞬发爆发来传递突然的关闭信号（Thoreson，2007）。或许与直觉相反，视上核区紫外视锥细胞中减缓的钙光恢复动力学（图4A–4D）并非会削弱这种带状突触的反弹效应，实际上反而有助于在开启信号期间降低钙水平，从而在此期间促进带状突触的充盈。一旦猎物目标移出紫外视锥细胞的感受野，钙便会迅速内流，并触发囊泡释放的瞬发爆发，形成关闭信号。为支持这一观点，我们的谷氨酸成像实验（图8和图S3）表明，视上核区紫外视锥细胞尤其擅长编码从开启到关闭信号的转换（例如图8H）。由此，我们可以推测这一机制或许还能用于检测无需第二个光感受器参与的非方向性运动形式。相反，目标仅需进入紫外视锥细胞的感受野后再离开，即可为突触后神经环路处理生成瞬时且正向的谷氨酸信号。这一过程甚至可能解释猎物捕捉行为的速度依赖性（Semmelhack 等人，2014）：速度过快的目标可能无法使钙水平充分下降，而速度过慢的目标则可能削弱关闭信号的瞬时性，因为开启抑制的解除过程可能过于缓慢。同样，这也可能部分解释了为何比背景更暗的目标也能诱发猎物捕捉行为（Bianco 等人，2011）。未来的研究中，有必要探究这一“反弹机制”是否以及如何被有效用于驱动视网膜内层的猎物识别及相关神经环路。例如，在这种情况下，在合适的位置和大小上闪烁固定的紫外亮斑，使其出现开启和关闭信号，便足以触发猎物定向行为。

在实验室中研究捕食行为

斑马鱼幼体的捕食行为已在实验室中得到广泛研究（Bianco等人，2011；Gahtan等人，2005；Jouary等人，2016；McElligott与O’malley，2005；Muto与Kawakami，2013；Novales Flamarique，2016；Patterson等人，2013；Semmelhack等人，2014；Trivedi与Bollmann，2013），但从未专门在紫外线条件下进行过研究。本研究的行为实验（图1H）有力表明，为斑马鱼幼体捕食回路提供主要输入的是紫外视锥细胞，而非紫外线本身；尽管本研究所用紫外线发光二极管的光谱与视蓝质蛋白的α波段以及视红质蛋白和视绿质蛋白的β波段存在重叠，但在缺乏紫外视锥细胞的情况下，紫外线照射无法挽救该行为表型。这也排除了任何类型视锥细胞中视黄醛生色团从A1型向A2型发生潜在转变的主要作用（Enright等人，2015；Suliman与Novales Flamarique，2014），因为与长波视蛋白不同，A1型和A2型紫外视蛋白的作用光谱几乎完全相同。

尽管如此，即使在低紫外线条件下或缺乏紫外线视锥细胞的情况下，斑马鱼仍会表现出一定的捕食行为行为表现。这表明，非紫外视锥细胞在必要时可向猎物捕获回路输入信号，或许是为了在缺乏系统性背景杂斑的情况下增强信号功率，典型实验室条件下的情况亦是如此。为支持这一观点，背侧区双极细胞和视网膜神经节细胞中显著的紫外主导特征，还伴随着其他波长也能引发的较弱信号（Zhou等人，2020；Zimmermann等人，2018）。同时，需重点考虑斑马鱼紫外视蛋白的特定吸收光谱与任何照明光光谱之间的关系。出于安全考虑，行为实验中使用的商用薄膜晶体管（TFT）显示器（Franke等人，2019）、投影仪和有机发光二极管（OLED）屏幕，通常会将短波长限制在(<1%)，即420纳米以下的信号功率低于1%。相比之下，斑马鱼紫外视蛋白的吸收峰值位于365纳米（Chinen等人，2003；Robinson等人，1993），这意味着大多数此类光源的短波长信号激活紫外视蛋白的效率不足1%。不过，由于背侧区紫外视锥细胞的光子捕获效率极高，只要屏幕亮度足够，这仍可能产生可用信号。此外，不同的投影装置（Bianco等人，2011；Jouary等人，2016；Semmelhack等人，2014；Trivedi和Bollmann，2013）、室内照明下的活体草履虫（Bianco等人，2011；Gahtan等人，2005；McElligott和O’malley，2005；Patterson等人，2013），甚至荧光显微镜的激发光（Muto等人，2013），都可能实现更高的光谱重叠。因此，未来有必要更详细地探究紫外光的加入会如何影响行为表现。

用于捕食的视网膜及中枢神经连接

紫外视锥细胞功能的区域特异性差异，使得视觉系统的第一个突触处就已出现了检测猎物和捕食者的初步预处理步骤（Baden 等人，2013b；Chapot 等人，2017a）。然而，视网膜和大脑网络如何利用这些信号来可靠提取这类对行为至关重要的信息，仍是一个悬而未决的问题。最终，紫外探测器阵列不同区域捕捉到的光模式，必须引发控制不同行为程序的大脑回路产生差异性激活（Dunn 等人，2016；Preuss 等人，2014；Semmelhack 等人，2014）。为此，信号必须先通过多样的视网膜双极细胞（Connaughton & Maguire, 1998；Connaughton & Nelson, 2000；Li 等人，2012；Zimmermann 等人，2018）传递至视网膜内层的特征提取回路（Baden 等人，2019；Masland, 2001）。先前的研究强调，视网膜内层的紫外启动回路在背侧区（SZ）具有显著的主导性（Zimmermann 等人，2018），这表明来自背侧区紫外视锥细胞的信号确实会被局部的紫外启动双极细胞亚群选择性捕获，以进行进一步处理。接下来，紫外信号必须被选择性地传递至大脑中特定的相关处理中枢（Connaughton & Nelson, 2015；Robles 等人，2014；Xiao & Baier, 2007）。近期研究发现，轴突构成视神经的视网膜神经节细胞（RGCs），其在背侧区也对猎物捕捉具有区域特异性调节（Zhou 等人，2020）。与双极细胞类似，背侧区绝大多数视网膜神经节细胞均为紫外启动回路，这与背侧区紫外视锥细胞中高于背景光的信号增强现象相符（图3和图6）。此外，与眼睛其他区域相比，这些细胞的紫外信号传导速度显著减慢，初步表明最初在紫外视锥细胞中形成的动力学差异（图4）也能可靠地通过视网膜网络传递。最后，顶盖前区分支区7（AF7）是捕食行为的基础，其主要由颞侧而非鼻侧的视网膜神经节细胞（RGCs）支配（Robles 等人，2014；Semmelhack 等人，2014），这强烈表明AF7可能主要由SZ神经环路驱动。显然，斑马鱼幼体的捕食神经环路在解剖学上（Robles 等人，2014；Semmelhack 等人，2014；Zhou 等人，2020）和功能上（Zhou 等人，2020；Zimmermann 等人，2018）都具有区域化特征，以驱动具有区域偏向性的行为模式（Bianco 等人，2011；Mearns 等人，2020）。未来一个重要的研究方向是明确这种区域化特征在多大程度上仅能通过神经元类型的区域调控来实现（如紫外视锥细胞的情况），还是还需要独特神经元类型在眼睛和大脑不同部位的特异性定位来完成。事实上，近期的转录组学分析重点指出，在灵长类动物黄斑区特异性存在一种“额外”的双极细胞（BC）类型（Peng 等人，2019），但其形态和功能尚不清楚。

实验模型详情

动物

所有实验操作均符合1986年《英国动物（科学程序）法案》要求，并经萨塞克斯大学动物福利委员会批准。所有实验均使用受精后6-8天的斑马鱼（Danio rerio）幼体。本研究采用了以下已发表的转基因品系：Tg(opn1sw1:nfsBmCherry)（Yoshimatsu等人，2016）、Tg(opn1sw1:GFP)（Takechi等人，2003）。此外，通过向单细胞期受精卵中显微注射pBH-opn1sw1-SyGCaMP6f-pA、pBH-cx55.5-nlsTrpR-pA（Yoshimatsu等人，2016）或pBH-tUASSFiGluSnFR-pA质粒，构建了Tg(opn1sw1:GFP:SyGCaMP6f)、Tg(cx55.5:nlsTrpR)和Tg(tUAS:SFiGluSnFR)转基因品系。将注射后的斑马鱼与野生型斑马鱼回交以筛选首建者，阳性后代被培育以建立稳定的转基因品系。

所有质粒均通过Gateway系统（赛默飞世尔，12538120）构建，所用的入门质粒和目的质粒组合如下：pBH-opn1sw1-SyGCaMP6f-pA：pBH与p5E-opn1sw1（Yoshimatsu等人，2016）、pME-SyGCaMP6f、p3E-pA（Kwan等人，2007）；pBH-tUAS-SFiGluSnFR-pA：pBH（Yoshimatsu等人，2016）、p5E-tUAS（Suli等人，2014）、pME-SFiGluSnFR、p3E-pA。质粒pME-SyGCaMP6f的构建过程为：将聚合酶链式反应（PCR）扩增的GCaMP6f（Chen等人，2013）插入pME质粒，随后在GCaMP6f的5'端插入经PCR扩增的、不含终止密码子的斑马鱼突触素基因片段。pME-SFiGluSnFR则是将PCR扩增的SFiGluSnFR（Marvin等人，2018）片段插入pME质粒构建而成。

实验动物饲养于标准14小时光照、10小时黑暗的昼夜节律环境中，每日喂食三次。自受精后1天起，将动物置于0.1毫摩尔/升的1-苯基-2-硫脲（Sigma公司，货号P7629）中培养，以抑制黑色素生成。进行双光子活体成像时，将斑马鱼幼鱼固定在2%低熔点琼脂糖（Fisher Scientific公司，货号BP1360-100）中，置于盖玻片上并浸没于养鱼水中。眼睛向眼球后方的眼肌注射α-银环蛇毒素（1纳升，浓度2毫克/毫升；Tocris公司，货号：2133）可阻止相关运动反应。在部分实验中，向眼内注射了含CNQX（0.5微升，浓度2毫摩尔/升；Tocris公司，货号：1045）的人工脑脊液（aCSF）。

方法细节

不同波长光下草履虫的成像观察

将尾草履虫（Sciento，P320）置于装有养鱼水和鹅卵石的容器中，以大致模拟斑马鱼的自然栖息地（Zimmermann 等人，2018）。实验在户外阳光下拍摄（英国布莱顿5月的典型晴天，下午1点左右无云），使用配备有镜头（Thorlabs ACL1815L）、固定玻璃滤光片（Thorlabs FGB37）以及滤光轮上可切换滤光片（紫外：FGUV11-UV，黄色：FGV9；均为Thorlabs品牌）的CCD相机（Thorlabs DCU223M）进行拍摄。视频以10赫兹的频率采集，黄色和紫外光下的单帧曝光时间分别为1毫秒和70毫秒。相机的焦距为2.5厘米，从鱼缸外部贴靠鱼缸壁放置。通过将相机芯片本身的光谱灵敏度与光路中所有光学元件的光谱灵敏度相乘，计算出有效记录光谱。

行为实验

将7-8日龄的斑马鱼幼鱼头部固定在35毫米培养皿的2%低熔点琼脂糖（Fisher Scientific，货号BP1360-100）中，使其眼睛和尾部可自由活动，基于先前的设计（Maia Chagas等人，2017），使用树莓派相机以30赫兹的频率在红外照明（940纳米）下对其进行拍摄。利用Arduino微控制器，以1分钟为周期，在紫外线（374±15纳米）或黄色（507±10纳米）LED光之间迭代切换培养皿的顶部照明。两种LED的峰值功率均设定为相等，为(0.12 ~W ~m^{-2})。同一条鱼连续进行三个这样的拍摄周期（每条野生型鱼总拍摄时长为12分钟，另有(n=12)组的12条紫外线视锥细胞被消融的鱼也进行相同操作），并离线手动标注行为表现，分为“完整捕食动作”（眼球会聚加尾部运动）或“追踪”（无尾部运动时的单侧或双侧眼球运动）。为消融紫外线视锥细胞，将Tg(opn1sw1:nfsBmCherry)斑马鱼幼鱼用10毫摩尔甲硝唑（Sigma，货号M3761）处理2小时，随后转移至不含甲硝唑的新鲜养鱼水中。行为学检测在甲硝唑处理后一天进行，以确保紫外线视锥细胞消融完全（Yoshimatsu等人，2016）。

全视野紫外视锥细胞密度估算

斑马鱼眼中紫外视锥细胞的分布最初是通过对7天龄幼鱼Tg(opn1sw1:GFP)眼睛的共聚焦图像堆栈确定的，该品系中所有紫外视锥细胞均被标记。实验时将斑马鱼固定，使一只眼睛朝向物镜。与以往研究（齐默尔曼等人，2018年）一致，我们使用Igor Pro 6.3软件（Wavemetrics公司）中的自定义脚本检测了三维眼球中所有紫外视锥细胞的位置。为将得到的紫外视锥细胞分布投射到视觉空间，我们首先测得眼球平均直径为300微米。此外，我们确定眼球和晶状体均呈近乎完美的球形曲率，且二者有共同的原点。基于此，我们假设任意一个紫外视锥细胞都从空间中的某一点接收光线，该点与一条直线重合——这条直线将紫外视锥细胞与晶状体中心相连，延伸至外界。据此，我们绘制出了整个单眼视野中紫外视锥细胞的感受野位置。

免疫染色、染料染色与共聚焦成像

斑马鱼幼鱼（7-8日龄）通过过量曲马多进行安乐死，随后在室温下于磷酸盐缓冲液（PBS）配制的4%多聚甲醛（PFA，Agar Scientific公司，货号AGR1026）中固定30分钟。用PBS洗涤三次后，摘除完整眼球，并用30G针头尖端手动去除角膜。解剖并固定后的样本在含0.5% Triton X-100（Sigma公司，货号X100）的PBS中处理至少10分钟、最长1天，随后加入一抗。在4℃孵育3-5天后，样本用含0.5% Triton X-100的PBS溶液洗涤三次，再与二抗和/或BODIPY染料（Invitrogen公司，货号C34556）孵育。孵育一天后，将样本置于盖玻片上的1%琼脂-PBS溶液中封片，随后用成像专用封片液（VectaShield，货号H-1000）替换PBS。所用一抗为抗GFP抗体（abcam公司，鸡源，货号ab13970）和抗CoxIV抗体（abcam公司，兔源，货号ab209727）；二抗为驴源CF488A染料抗鸡抗体（Sigma公司，货号SAB4600031）和山羊源Alexa647染料抗兔抗体（ThermoFisher公司，货号A-21244）。共聚焦图像堆栈通过TSC SP8激光共聚焦显微镜（Leica）采集，分别使用40倍水浸物镜（C PL APO CS2，Leica）、63倍油浸物镜（HC PL APO CS2，Leica）或20倍干物镜（HC PL APO Dry CS2，Leica）。典型体素尺寸在xy轴和z轴分别为150纳米和1微米。在Fiji软件（美国国立卫生研究院NIH）中对图像的对比度、亮度和伪彩色进行了调整。通过手动标记外节的内外位置，使用Igor Pro 6.3软件（Wavemetrics公司）的自定义脚本对外节长度和抗GFP染色强度进行定量分析。

双光子钙与谷氨酸成像及光刺激

所有双光子成像均在 MOM 型双光子显微镜（由德国马克斯·普朗克生物化学研究所马丁斯里德分所的 W. Denk 设计，通过索特仪器/科学产品公司采购）上进行，该显微镜配备锁模钛蓝宝石激光器（Chameleon Vision-S，相干公司），其波长调至 927 纳米或 960 纳米用于 SyGCaMP6f 和 SFiGluSnFR 成像，调至 960 纳米用于 mCherry 与 SFiGluSnFR 双成像。我们为 SyGCaMP6f/iGluRSnFR 成像使用了两个荧光检测通道（F48x573，德国阿赫福/克罗玛公司），为 mCherry 成像使用了另一个荧光检测通道（F39x628，德国阿赫福/克罗玛公司），并配备水浸物镜（W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27，蔡司公司）。图像采集方面，我们使用定制编写的软件（ScanM，由德国马克斯·普朗克生物化学研究所马丁斯里德分所的 M. Mueller 与德国图宾根大学神经科学中心的 T. Euler 开发），该软件基于 IGOR pro 6.3 版本运行Windows（Wavemetrics）。记录配置如下：SyGCaMP6f 紫外闪光（图3和图4）：128×16像素（每行1毫秒，62.5赫兹）；SyGCaMP6f 全眼记录（图6）：512×512像素（每行2毫秒，0.97赫兹）；SFiGluSnFR 噪声记录（图8D–8G）：128×32像素（每行1毫秒，31.25赫兹）；SFiGluSnFR 和 SyGCaMP6f 噪声记录（图8H）：64×4像素（每行2毫秒，125赫兹）。光刺激的设置如先前所述（Zimmermann 等人，2018，2020）。简言之，光刺激通过物镜传递，由带通滤波的发光二极管（LED）提供（“红色”588纳米，B5B-434-TY，13.5坎德拉，20毫安；“绿色”477纳米，RLS5B475-S；3-4坎德拉，20毫安；“蓝色”415纳米，VL415-5-15；10-16毫瓦，20毫安；“紫外（UV）”365纳米，LED365-06Z；5.5毫瓦，20毫安，德国Roithner公司）。LED 经 FF01-370/36、T450/pxr、ET420/40 m、T400LP、ET480/40x、H560LPXR（AHF/Chroma 公司）滤光并合光，并通过微控制器和定制脚本（可在 https://github.com/BadenLab/Zebrafish-visual-space-model 获取）与500赫兹（每行2毫秒）或1000赫兹（每行1毫秒）的扫描回扫同步。LED 强度的比例经校准（以每秒每视锥细胞的光子数计），使每个 LED 能相对刺激其对应的视锥细胞类型，模拟斑马鱼栖息地自然光谱光下的激活状态（Zimmermann 等人，2018）：红、绿、蓝、紫外视锥细胞每秒每视锥细胞分别接收34、18、4.7和(2.1 x10)个光子。我们将这些“自然光谱”LED 强度作为背景光，对比度根据实验进行调整。LED 对比度设置为：暗态0%、亮闪光2500%（图3B–3F）；背景0%、闪光2500%（图3G和3H）；背景2500%、暗闪光0%（图4A和4C）；暗态0%、亮态200%（图6）。对于四色噪声刺激（图7和图8），4个LED 同时以100%对比度按12.8赫兹的已知序列独立呈现。使用强度范围为67至(104)个光子/视锥细胞的5毫秒短时紫外闪光，以测量紫外视锥细胞的敏感度（图3I和3L）及光恢复动力学（图4E和4F）。所有实验中，每次记录开始时，实验动物均保持在恒定背景光照下至少5秒，以适应激光。

紫外视锥细胞激活模型

视锥细胞分布数据取自已发表资料（齐默尔曼等人，2018年）。紫外光和蓝光视锥细胞取自同一具代表性眼球，与另一具眼球中的红光和绿光视锥细胞对齐后投射到视觉空间中。完整的阵列被裁剪至±60度的范围。双极细胞（BCs）以最小半径10随机分布。双极细胞对同一固定半径内所有视锥细胞的活动进行求和。目标轨迹被设定为无限平面上的随机游走（典型微分同胚），因此其左右和上下边界彼此连续。每经过一个步长迭代（等效于10毫秒），目标以100度/秒的恒定速度前进，同时角度发生随机变化（a），且满足(-15^{circ}<alpha<15^{circ})的条件。移动目标对视锥细胞的激活计算过程如下：在每个时间点，确定目标中心与每个视锥细胞中心之间的距离。若该距离小于目标半径（亮目标为1度，暗目标为2.5度）与视锥细胞感受野半径（0.38度）之和，则该视锥细胞被激活，从而为每个视锥细胞生成随时间变化的二值激活序列。随后，将该序列与视锥细胞的脉冲响应进行卷积。在此过程中，峰值振幅和恢复时间常数根据视锥细胞的位置确定，参考钙成像确定的四个测量点（背侧、鼻侧即水平方向、腹侧和视裂区SZ，参见图3）。沿背腹轴，数值根据水平方向与背侧或腹侧边缘的相对距离选取。例如，一个位于水平方向到背侧边缘75%位置的视锥细胞，其数值分别按背侧、鼻侧和腹侧测量值的0.75:0.25:0比例加权。此外，若视锥细胞位于视裂区中心30度范围内（30度，-30度），还需额外按视裂区的测量值以相同方式加权。每次运行中，所有激活值均归一化为整个阵列的峰值激活。

UV 视锥细胞的 RNA 测序

将7天龄的Tg(opn1sw1:GFP)斑马鱼幼虫全视网膜在充氧的人工脑脊液（氯化钙0.1275克/升、氯化钾0.1488克/升、氯化钾0.231克/升、氯化钠7.01克/升、D-葡萄糖1.081克/升、碳酸氢钠1.9克/升）中解剖，同时记录每个视网膜的方位。随后将每个视网膜切成两部分：感觉区（SZ）和非感觉区（non-SZ）。通常将10条斑马鱼（20只眼）的组织合并至一个管中，使用木瓜蛋白酶解离系统（沃辛顿公司，货号LK003176、LK003170、LK003182）进行解离，对实验方案做如下修改：在室温下用木瓜蛋白酶孵育10分钟。解离过程中，每3分钟用圆头玻璃移液器轻轻吹打组织，以促进解离。孵育10分钟后，加入脱氧核糖核酸酶和卵类粘蛋白，再通过轻柔吹打对组织进行进一步机械解离。解离后的细胞立即通过FACSMelody流式细胞仪（BD生物科学公司）按绿色荧光蛋白（GFP）表达进行分选。每管分选约100个细胞，在液氮中快速冷冻后于-80℃保存，直至后续使用。采用超低起始量RNA试剂盒（Takara公司，货号634888）构建文库，并由美国新泽西州的GENEWIZ公司进行二代测序。使用Trim Galore!软件对测序数据进行质量检测和接头去除处理，通过HISAT2软件将测序序列比对至斑马鱼基因组（GRCz11.9），再借助usergalaxy.org在线平台的公共服务器，利用featureCounts软件统计基因表达量。感觉区和非感觉区样本各进行四次生物学重复实验。

差异基因表达分析

为分析精神分裂症（SZ）与非精神分裂症（non-SZ）样本的差异基因表达，我们使用了R/Bioconductor中的DESeq2软件包（Love等人，2014）。我们仅纳入在8个样本（4个SZ样本+4个non-SZ样本）中至少2个样本里序列片段计数不低于5的基因。由于我们希望测量不同区域之间的效应并控制个体眼球的差异，我们将眼球作为额外的潜变量纳入模型（设计公式=eye+zone）。随后，DESeq2软件包使用带有对数连接函数的广义线性模型，推断基因计数的负二项分布（Love等人，2014）。通过poscount估计器得到的推断均值，通过对非零计数的乘积开 (n^{th }) 次方根来计算修正几何均值的结果如图 7B 和图 7C 所示。随后，也在 DESeq2 中对对数倍变化（图 7D）进行了估算。

为了确定经紫外线视蛋白标准化的差异表达（图7E），我们改用原始计数数据进行计算，以紫外线视蛋白基因的计数为标准化依据。由此，通过计算单个精神分裂症（SZ）样本与非精神分裂症样本配对的倍数变化，得出平均倍数变化。

光转导建模

我们使用了先前描述并验证过的脊椎动物纤毛光感受器光转导计算模型（Invergo 等人，2013，2014）。我们利用模型为非SZ模拟提供的默认参数，模拟了对100%暗对比度或100%亮对比度的光反应（图7G和7H），或对黑暗背景下不同强度5毫秒闪光的光反应（图7J和7M）。为模拟SZ条件，我们随后根据SZ与nSZ条件之间的相对基因表达变化对所有参数进行了缩放。转导蛋白的缩放通过选取各亚基（gngt2b、gnb3b、gnat2）中的最低值实现，因为转导蛋白发挥功能需要所有亚基共同参与。同样，我们基于CNGa3的表达水平对环核苷酸门控通道（CNG）进行了缩放。各条件下修改的参数列于表S4。

软件

使用 IGOR Pro 6.3（Wavemetrics 公司）、Fiji（美国国立卫生研究院开发）、Python 3.5（Anaconda 发行版，包含 scikit-learn 0.18.1、scipy 0.19.0 和 pandas 0.20.1）以及 R 3.5.1 进行了数据分析。

斑马鱼药物处理

在目标血管的活跃发育期之前，加入IGFR1抑制剂BMS-754807（购自MedChem Express）或IGFBP抑制剂NBI-31772（购自Tocris Bioscience）。替沃扎尼或舒尼替尼则在受精后4天（4 dpf）、肌肉纤维生长（MFL）开始前加入。斑马鱼幼鱼在这些抑制剂中培养直至成像。为了在lyve1b:dsRed; col2a1a:Gal4ERT2; UAS:igfbp5b品系中过表达igfbp5b，在受精后3天（3 dpf）将斑马鱼胚胎置于含10 μM 4-羟基他莫昔芬的E3培养基中处理，并培养至受精后6天（6 dpf）进行共聚焦成像。进行IGF2注射实验时，于受精后4天（4 dpf）通过心脏注射向斑马鱼幼鱼的血液中注入500皮克的人重组IGF2。

预处理与暗-光指数

基于对记录堆栈随时间变化的标准差投影进行局部阈值处理（标准差 (typically >25)），随后使用 IGOR Pro 6.3（Wavemetrics 公司）上的自定义软件对尺寸和形状进行筛选，自动定义了与紫外光锥单个突触前末梢对应的感兴趣区域（ROIs）。具体而言，仅对尺寸为 (2-5 mu m^{2})、伸长率不超过 150% 的圆形 ROI 进行进一步分析。在谷氨酸记录中，由于水平细胞（HC）树突末梢在视锥末梢的形状通常呈偏斜状，因此手动放置感兴趣区域。提取每个 ROI 的钙或谷氨酸信号轨迹，并基于系统光刺激呈现前记录开始时 1-6 秒的时间间隔进行 Z 归一化。记录数据中嵌入的刺激时间标记用于将轨迹与视觉刺激对齐，时间精度为 1 或 2 毫秒（具体取决于线扫描速度）。暗光指数（DLi）计算公式为：

其中 L 和 D 分别为紫外光闪光和暗闪光配合 RGB 背景刺激下反应振幅的众数。

信息率

为计算信息率，我们首先对记录的信号轨迹进行质量过滤：我们为每条轨迹计算了针对紫外线刺激的线性响应核，仅保留那些核的响应振幅（以其标准差衡量）不低于同一区域最大响应振幅核的70%的轨迹。随后我们按照参考文献（van Hateren 和 Snippe, 2001）中描述的步骤，采用有限数据的偏差校正方法进行了分析。在此过程中，我们假设实验重复测量之间的噪声在统计上是相互独立的。对于独立高斯统计分布，信息率 R 可通过以下方式计算：

由于光感受器对低频信号的响应效果最佳（Baden 等人，2013a），我们选择了12赫兹的截止频率。随后我们计算了经偏差校正的信噪比（SNR），计算公式如下：

其中(X_{i})代表单次实验，n为实验次数，(hat{s})和(widehat{N})分别为S和(N,)的傅里叶变换。我们采用韦尔奇法来降低估算功率谱中的噪声。

量化与统计分析

统计分析

本研究未采用统计学方法预先确定样本量。图1H和图S1G的P值采用非参数Mann-Whitney U检验计算，图1G的P值采用配对t检验计算。对于图4B和图4D-4F，P值通过单因素方差分析（ANOVA）计算，分析因素为处理方式与区域的交互作用，并采用Tukey校正进行多重比较的事后检验。相关的事后检验表格见补充表S1-S3，图中仅标注了相关比较的显著性星号。鉴于本研究属于探索性研究，未采用随机化或盲法处理。

我们使用广义加性模型（GAMs）分析了眼位与外节大小、基线值以及暗光指数之间的关系（图2G、6C、6E、6G及补充图2E）。广义加性模型可被视为对广义线性模型的扩展，它允许线性预测变量依赖于潜在变量的平滑函数（Wood, 2006）。我们在Windows 10工作站（配备8颗至强E3-1270 v5 3.6吉赫兹处理器；64吉字节内存）上使用mgcv软件包（版本1.8-28），采用默认参数进行分析。我们将目标变量的相关性建模为具有20个自由度的平滑项。此外，我们将鱼的编号纳入为随机效应。这些模型解释了40%至80%的偏差。绘图时，我们生成了预测的平均响应及约95%的置信区间，其中排除了鱼的编号（这会导致原始数据点与平均响应之间出现轻微的视觉偏移）。基线条件与HC模块条件下暗光指数相关性的差异统计显著性，通过R语言的itsadug软件包（版本2.3）的plot_diff函数获得。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。