标题：Whole-Brain Calcium Imaging during Physiological Vestibular Stimulation in Larval Zebrafish

期刊：Current Biology

原文链接： https://doi.org/10.1016/j.cub.2018.10.017

研究亮点

l 本研究报道了一种新型的小型化可旋转光片显微镜

l 该技术可实现斑马鱼幼体前庭刺激过程中的全脑钙成像斑马鱼幼体的刺激

l 研究绘制了斑马鱼幼鱼在正弦和阶跃式前庭刺激下的全脑神经元反应

l 研究人员根据神经元的紧张性和相位性反应特征对其进行了聚类

摘要

前庭器官为动物提供与姿势和运动相关的信息，这些信息对于充分完成众多感觉运动任务至关重要。为了以生理方式激活该感觉系统，需要从宏观上旋转或平移动物的头部，这反过来使得同时进行神经记录极具挑战性。本文报道了一种新型微型光片显微镜，该显微镜可与头部固定的斑马鱼幼体动态同向旋转，从而实现可控的前庭刺激。该显微镜的机械刚性使其能够在施加高达25度的角位移和(6,000 % ~s^{2})的旋转加速度的情况下，以一流的分辨率和信噪比进行全脑功能成像。我们通过生成首个针对正弦和阶跃式前庭刺激的全脑反应图谱，展示了这一新型实验装置的潜力。反应神经元群分布于多个脑区并表现出双侧对称性，其组织形式在不同个体中高度一致。通过傅里叶分析和回归分析，我们鉴定出三个主要功能簇，这些簇对前庭刺激表现出明确的相位性和张力性反应模式。我们的可旋转光片显微镜为系统研究脊椎动物大脑中的前庭处理过程提供了独特工具，并拓展了虚拟现实系统在模拟三维导航过程中探索复杂多感觉整合和运动整合的潜力。

图文摘要

引言

功能成像是在体监测大脑活动的一种有效替代电生理学的方法。对斑马鱼幼体这类体型小且身体透明的动物进行功能成像，能够对整个大脑进行长期、无创的记录，从而实现对神经元环路的大规模分析。该方法可可将其与多种感官刺激（如视觉、听觉、热觉或嗅觉刺激）以及行为监测相结合，以探究复杂感觉运动任务背后的神经计算过程。

当斑马鱼在三维环境中导航时，其前庭器官会持续向大脑传递身体相对于重力的方位信息，以及身体的平动和旋转加速度信息。前庭信息参与运动启动、姿势控制和视线稳定。前庭信号还能帮助斑马鱼幼体找到水面以充气鱼鳔，或在受到应激时向水底移动。前庭功能缺陷的动物无法存活。尽管前庭系统至关重要，它仍是一种无法通过全脑尺度功能成像来探究其神经基础的感觉模态。这是因为该感觉系统面临着特殊的挑战——其生理激活需要对动物进行动态旋转和/或平移。若在显微镜固定不动的情况下进行这类运动，会持续改变成像的脑部区域，从而无法长期监测单个神经元的活动。

法夫-布勒等人通过光镊直接移动椭圆囊耳石——内耳器官中传递前庭信息的微小结构——证明了在头部固定的斑马鱼幼体中可诱发前庭行为反应。这种虚拟刺激方法在可实现的刺激模式方面具有极高的灵活性，且在与本论文同期发表的一项研究中证实，该方法与功能成像是兼容的[18]。然而，由于光镊作用于耳石的力未经过校准，此方法无法以可控且可重复的方式施加类自然的前庭刺激。正如近期研究提出的，自由游动鱼类的功能记录也可作为一种补充途径。但该方法难以区分前庭变量与运动变量，且仅适用于二维轨迹。本文报道了一种旋转光片显微镜的研发与应用，该显微镜可与头部束缚的动物同步旋转，从而在为前庭系统提供刺激的同时，保障稳定的成像条件。这款紧凑型旋转显微镜能够在斑马鱼幼体接受生理性动态前庭刺激时，实现单细胞分辨率的全脑记录。

我们首先详细介绍旋转显微镜的设计，并从机械稳定性和成像方面对其进行表征表现。接下来，我们通过同时监测经历正弦滚动和阶梯式滚动运动的斑马鱼幼体的全脑尺度神经元活动与代偿性眼动，来展示该系统的全部潜力。在第二部分中，为了最小化或抑制与代偿性眼动相关的视觉输入，我们重点研究使用麻痹或双眼摘除的斑马鱼所产生的神经元反应。我们对全脑前庭反应进行了定量表征，发现反应图谱涵盖了跨越多个脑区的扩展神经元集群，且呈现出高度固定的双侧对称性。通过傅里叶分析和多元线性回归分析，我们根据神经元的相位对这些神经元群进行了分类就正弦刺激而言的关系，并依据它们对阶梯式刺激的各自相位性与张力性反应来划分。除了本文报道的技术进展外，我们还提供了一款名为“Fishualizer”的开源图形化工具，用于可视化、检查和分析四维功能成像数据。

结果

一台微型可旋转数字扫描光片显微镜

结合功能成像进行生理性前庭刺激，需要让整个成像系统和实验动物同步动态旋转（图1A），这反过来对成像系统的机械刚性提出了严格要求。显微镜旋转过程中，重力变化产生的任何机械畸变都可能导致成像平面发生位移。这类位移会使另一组神经元短暂进入成像焦平面，进而在荧光记录中产生有害的伪影。为解决这些问题，我们设计了一款适用于三维数字扫描光片显微镜的微型照明单元。通过将光学元件数量减至最少，我们将光路尺寸相较于标准数字扫描光片显微镜缩小了十分之九。显微镜。这种紧凑的设计消除了大部分机械畸变，并且使显微镜在很大程度上对振动不敏感。

光片通过两个低数值孔径（NA）物镜和一个扫描镜将光纤输出成像到样品上（图1B）。在该设计中，我们省去了传统的中继系统——该系统通常通过将反射镜的旋转点移至照明物镜的后焦平面来实现平行光束的偏转。但我们计算得出，在约平方毫米的视场内，由此产生的激光指向变化小于(alpha=0.4^{circ})（图1C；STAR方法）。由于该偏差发生在光片平面内，因此不会对成像性能产生影响。光纤出口处的光束发散度足以提供形成微米级厚度光片所需的数值孔径，无需引入光束扩展系统。值得注意的是，由于激光以反向方向穿过两个相同的物镜，该配置可补偿球差。Z轴扫描（图1B、1C；视频S1）通过压电晶体直接移动光纤出口实现。这是因为两个物镜构成的望远镜将光片束腰与光纤出口共轭成像。尽管两个物镜之间的扫描镜会破坏完美的远心度，但在250毫米的扫描范围内，由此产生的指向误差0小于0.4（图1C；STAR方法），且光片相对于焦平面的位移小于光片厚度的3%，对应样品最外侧的最大位移小于2微米。

凭借这种紧凑的设计，光片单元的尺寸仅为9×3×6×10厘米（图1B和图1C），且通过旋转和平移整个单元，即可轻松完成光片的校准。所有光学元件——包括荧光检测系统、行为追踪模块和样品架——均安装在一块光学平板上（图1A），该平板固定在超稳定高负载旋转台上（ALAR150SP；Aerotech），此旋转台可在10毫秒内将显微镜加速至60度/秒的角速度，且反向间隙极小。光片的轮廓与高斯光学的预测一致，在(1/e2)处的半高宽为2.04±0.02毫米（平均值±标准差）（图1B插图；STAR方法）。这种小型化设计实现了与当前最先进的数字扫描光片显微镜相当的光学切片效果，因此能在整个大脑中提供准单细胞分辨率，唯有双眼之间最腹侧的阴影区域除外。图像分辨率足以支持大脑大部分区域的自动化细胞分割。为验证系统的光学性能，本文提供了对6天龄（受精后天数，dpf）斑马鱼幼鱼大脑的高分辨率体积扫描结果（图1D；视频S1；其中GCaMP6s在全神经元中表达并定位于细胞核）。

图1 实验装置与成像性能两种方案的图示如下。(A) 旋转显微镜装置示意图，包含光片单元（LU）、固定的斑马鱼（ZF）和检测单元（DU）。放大图像展示了斑马鱼如何随显微镜一同旋转，使光片与检测焦平面在任意旋转角度下均重合。刺激角度沿箭头所示方向计为正。斑马鱼长体轴与显微镜旋转轴对齐，朝向光学平板。(B) 光片形成单元示意图。插图：实测光片轮廓（黑色）与理论高斯光束轮廓（红色）的对比。(C) 光片单元细节。左侧为俯视图，展示光片形成的扫描机制；右侧为侧视图，呈现光片Z轴扫描的光路图，为清晰起见未绘制扫描镜。绿色椭圆示意荧光斑马鱼大脑。光片单元的照片分别对应俯视图和侧视图，图中为泛神经元表达GCaMP6s的斑马鱼幼体，金属圆盘可旋转单元以完成校准。(D) 6日龄斑马鱼（Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)）全脑体积扫描的矢状面和冠状面切片。四幅插图展示了接近单细胞分辨率的图像以及自动分割处理的结果。比例尺：主图50毫米，插图25毫米。另见视频S1。

显微镜旋转过程中成像条件保持稳定

我们通过微球的3D追踪表征了装置在旋转状态下的稳定性。简要来说（详细信息见STAR方法），嵌入琼脂糖中、直径为1毫米的荧光微球在成像时会呈现出同心环状的特征干涉图案。其直径是一个函数微球相对于焦平面的位置（图2A和图2B）。因此，通过随时间监测环的中心位置和半径，可以对样品的运动进行三维表征。根据校准测量（图2C）推导得出，z方向的跟踪精度为10纳米（标准差，(N=) 5）。我们发现，在显微镜以±20度进行正弦旋转的过程中，扫描体积在z方向的移动量小于500纳米，即仅为典型胞体直径（8微米）的6%，而在x-y平面内的移动量则小于2微米（图2D）。

面内位移可在后续处理中通过逐次图像互相关进行校正。相比之下，轴向漂移无法被补偿，且可能会为荧光信号引入微小的伪影调制。为量化这些运动相关的噪声水平，我们对泛神经元表达红色荧光蛋白（HuC:RFP）的麻痹鱼进行了对照实验，该蛋白不反映神经元活动。我们测量了不同幅度的显微镜步进旋转所引起的每个像素强度变化的分布，并将其与显微镜静止在零度时的固有噪声分布进行了比较（图2E；图2F，浅红色和深红色）。这两种分布的标准差之差（((Delta sigma))）被用作机械诱导荧光噪声的度量指标。我们发现，(Delta sigma) 随旋转幅度增大而增加，但在±25°范围内，其ΔF/F值（以三条鱼的平均值计）仍低于2%（图2G，红色）。随后，我们对泛神经元表达钙指示剂GCaMP6s的麻痹鱼重复了相同分析（图2F，浅蓝色和深蓝色；图2G，蓝色）。在这些实验中，Ds值在ΔF/F上仍低于3%（以三条鱼的平均值计），且与通过RFP鱼测得的旋转角度呈现相同的相关性。因此，即便在显微镜旋转的情况下，该小型化装置的成像质量在信噪比和空间分辨率方面，仍可与最先进的光片显微镜装置[1]相媲美。

图2 稳定性表征与噪声水平估算。(A) 荧光微球相对于检测物镜焦平面位移的特征干涉图样。(B) 所有角度平均后的径向强度分布随设定物镜像高的变化情况。该分布用作查找表（LUT），以量化显微镜旋转过程中微球的z轴运动。虚线指示了图(A)中所示分布的拟合位置。(C) z轴追踪算法的性能测试。控制信号驱动压电装置以0.5毫米为步长移动检测物镜（红色曲线），同时通过将微球的瞬时强度分布拟合至图(B)所示的查找表中，计算得到微球与物镜的相对距离（蓝色曲线；误差棒代表标准差；(N=5)）。(D) 扫描体积沿z轴的位移随显微镜旋转角度的变化特征（蓝色曲线；误差棒代表标准差；(N=5)）；蓝色代表旋转方向为-20°至+20°，红色代表反向旋转。插图展示了x-y平面内的相应位移。示意图定义了坐标系。(E) 用于估算机械诱导噪声水平的阶梯刺激方案。(F) 显微镜旋转15°后，每个像素的强度变化相对于旋转前即刻测量的强度值的分布（表达RFP的鱼[红色]和表达GCaMP6s的鱼[蓝色]）。浅色代表未进行显微镜旋转时测得的固有噪声分布。数据通过高斯拟合进行中心化和归一化处理。(G) 表达RFP的鱼（红色）和表达GCaMP6s的鱼（蓝色）所测得的平均机械诱导噪声水平（Ds）随显微镜角度的变化（误差棒代表标准差；(N=3 fish))）

动态前庭刺激下的全脑成像与行为监测联合研究

为了展示我们平台的全部潜力，我们在正弦和逐步旋转过程中同时监测了全脑神经元活动以及诱发的行为反应（刺激和数据采集的详细信息见STAR方法）。在这些实验中，以泛神经元方式表达GCaMP6s的斑马鱼幼虫被部分包埋在琼脂糖中，以允许眼部自由活动（图S1）。斑马鱼通过重力惯性前庭眼反射（黄斑眼反射）对滚动刺激做出反应，通过代偿性眼球运动来保持清晰的视觉（图3A）。两种刺激方案都引发了幼虫大脑中神经元活动的广泛激活。神经元活动似乎与刺激相关，定位于特定的大脑区域，且相对于正中矢状面呈反对称性，如视频S2所示（第一部分：正弦刺激；第二部分：逐步刺激）。选定区域的活动轨迹示例如图3C所示。单个神经元的活动随时间跟随正弦刺激，相对于显微镜旋转存在不同的明确相移（图3C左图）。在逐步刺激过程中，我们还观察到了针对斑马鱼向左或向右角位置调整的强直样反应等多种反应。这些实验证明，所开发的平台具备了必要的稳定性和成像分辨率监测自然前庭刺激引发的行为反应以及类脑规模的神经元活动。

在两组实验中，我们都在顶盖和顶盖神经纤维层中观察到了与刺激相关的活动（视频S2；第一部分图3C中的示例轨迹），这两个区域是已知的主要视网膜接收区域。我们怀疑这种活动可能部分或全部由眼睛旋转引发的视觉感觉系统的同时刺激所诱发。虽然实验在黑暗环境中进行，但蓝色激光不可避免地会对样本腔产生漫射照明，从而为动物提供视觉线索。由于腔室相对于动物身体（头部附着的物体）是静止的，这种残留的视觉模式有望稳定眼睛位置，从而与前庭驱动的眼球代偿性旋转相冲突。然而，这种视觉驱动的抵消力可能较小，因为行为反应的增益（眼球与身体旋转的比率）经测量为0.61±0.2（标准差，(N=9)，标准差，N=9），甚至大于在完全黑暗环境中进行的行为测定所报告的数值。因此，如果存在视觉输入，其对眼球运动的影响相较于前庭输入无疑是微弱的。但这并不排除视觉刺激可能解释视觉响应区域中观察到的部分反应的可能性。为了最大限度减少任何非前庭输入，下文报告的所有实验均使用麻痹且完全包埋的鱼进行，从而排除了（1）由眼球运动引起的视网膜滑移相关的视觉输入、（2）肌肉收缩诱导的本体感觉输入以及（3）来自侧线的流体力学输入。作为进一步的对照，我们对去核鱼重复了所有实验。

图3. 行为学与神经元反应针对正弦和阶跃式动态前庭刺激的反应。(A) 上图：示意图展示显微镜旋转时鱼的滚动旋转以及诱发的代偿性眼球运动。角度以顺时针方向计为正值，即当鱼向其右侧滚动时。下图：对正弦刺激和阶跃刺激（黑色虚线）的试次平均行为反应，以及与Tg(elavl3:GCaMP6s)鱼相关的代偿性眼球运动（绿色）。为便于比较，眼球朝向的符号已反转。(B) 三张视图显示了感兴趣区域（红色、蓝色和灰色圆盘）在Z-Brain坐标系中的位置，从中提取了(C)中所示的荧光示例时间轨迹。图中展示了视顶盖（OT）和滑车神经核（nIV）的轮廓。(C) 示例荧光轨迹（原始信号和试次平均值）。水平虚线表示零值，该值由计算出的荧光基线定义（见STAR方法）。左图：对正弦刺激的反应（对应B中从吻侧向尾侧的蓝色和灰色圆盘）。右图：对阶跃刺激的反应（红色编号圆盘）。OT，视顶盖；nIV，滑车神经核；VS，前庭脊髓神经元；Rh，菱节。所有数据均已记录。另参见视频S2。

动态前庭刺激的神经元反应具有左右对称性且高度刻板

对完全包埋在琼脂糖中的瘫痪斑马鱼（核标记为 elavl3:H2B-GCaMP6s）施加正弦滚动刺激（频率0.2赫兹，振幅±10）。我们观察到强烈的全脑神经元活动如图视频S3所示。我们通过傅里叶分析计算每个脑体素（0.8×0.8×10毫米）的振幅（以信噪比为单位）以及信号相对于刺激的相移（见STAR方法），以此量化全脑的前庭反应。我们发现反应中存在连续的相移，但最大反应振幅主要出现在相移为7/8π或15/8π的情况下（图4A，上图）。需注意这些相移直接从荧光信号计算得出，因此需要减去(Delta varphi_{GCaMP}=-1.35)弧度，以校正钙指示剂的延迟响应，从而捕捉实际的锋电位发放率动态（详见STAR方法）。考虑到这一校正后，这两个主要的神经元群体在旋转角度和速度处于中间值时呈现最大反应，即当两者均为正值时（7/8π，对应a1de702-9db4-4982-85d0-8e6eb3ee535e）或均为负值时（15/8π，对应((15 / 8 pi-Delta varphi_{GCaMP}))）（图4A，下图，分别为品红色和淡绿色箭头）。因此，这些神经元可被描述为对角度和速度均具有调谐特性的混合调谐神经元。

通过逐像素相移测量，我们计算出了一张三维相位图（图4B和图4C；视频S4第一部分）。该相位图显示，表现出相似相移的神经元倾向于在空间上组织成界限分明的簇，这些簇相对于矢状中平面呈镜像对称。图4B展示了该示例相位图在Z-Brain图谱配准后选取的十个层面（详见STAR方法）。我们在纵环、缰核、视顶盖以及被盖区（包括内侧纵束核nMLF、动眼神经核nIII）中发现了有响应的神经元，滑车神经核（第四脑神经核）。在小脑和后脑也发现了大量活跃的神经元，尤其是在耳部周围的八面体外侧核（前庭核）、切线核（白色箭头）、前庭脊髓神经元（白色箭头头）以及下橄榄核。丘脑、顶盖前区和端脑的反应较弱，因此几乎无法与神经元自发活动区分开（端脑的自发活动恰好尤为强烈）。在大多数有反应的脑区，相位图具有空间组织性，两个半球之间存在清晰的分界（例如在被盖、前庭脊髓神经元或第七菱脑节）。然而，我们也观察到一些空间异相反应的区域，例如在缰核、纵纹 torus 或小脑（图4B，下方）。图4C展示了13个选定脑区中高反应性神经元的比例及相应的相位分布，结果显示从吻侧向尾侧，正相移逐渐增大（即从品红-绿色到蓝-橙色）。在本次分析中，我们在细胞分割后重新计算了每个神经元的相位图（详见STAR方法）。

图4. 麻痹斑马鱼在正弦前庭滚动刺激下全脑功能反应的相位图。（A）上图：以信噪比为单位测量的每个神经元荧光反应振幅的极坐标图（见STAR方法学），并相对于反应相对于刺激的相位延迟进行绘制。色标表示相移。虚线表示零相移神经元的预期位置信号已针对 GCaMP6s 传感器引入的相位延迟进行校正（STAR 方法）。下图：示意图展示一个刺激周期（黑色虚线）。箭头指示在考虑 GCaMP6s 传感器引入的延迟后，具有优势反应的神经元（黑色线，上图）在周期中达到最大反应的相位。(B) 上图：示例斑马鱼在配准至 Z-Brain 参考脑后选取的十个相位图图层。划定的脑区来自 Z-Brain 图谱。下图：虚线矩形所示区域的放大视图。(C) 13 个选定脑区中反应神经元的比例及相应的相移分布。(D) (B) 中所示相位图的最大投影视图，并按 (A) 中所示的四个相位区间划分。每个相位区间均展示了从左侧到中线、从背侧到腹侧的最大投影。(E) 13 个选定脑区中反应神经元的比例及相应的相位分布。(F) 平均相位图。左图：(N=B) 麻痹斑马鱼的平均值。右图：(N=9) 双侧去眼麻痹斑马鱼的平均值。展示了从左侧到中线、从背侧到腹侧的最大投影。C，尾侧；D，背侧；Hab，缰核；IO，下橄榄核；L，左侧；R，右侧；Ro，头侧；TL，纵纹核；Teg，被盖；nMLF，内侧束核；nIII，动眼神经核；nIV，滑车神经核；Cer，小脑；V，腹侧；Rh，菱节。所有数据均记录于 Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) 斑马鱼中。比例尺，50 微米和 20 微米（(B) 中的放大视图）。另见图 S2-S4 及视频 S3、S4。

为了更精准地描述这种功能组织，我们将相位图划分为四个不重叠的相移区间（图4D）。第一个相位区间（i）对应速度调谐神经元，它们主要分布在小脑和耳部周围。第二个相位区间（ii）包含对角度和速度均有调谐的混合神经元，这些神经元以相反的符号对角度位置和速度做出反应，分布在小脑、菱形节6外侧以及菱形节2-5的内侧区域。第三个相位区间（iii）的神经元为角度位置调谐型，广泛分布于整个大脑，尤其集中在缰核、视顶盖、外侧被盖区、小脑以及后脑的最内侧区域。第四个相位区间（iv）包含了响应神经元数量最多的群体，这类神经元为角度和速度调谐的混合神经元，以相同的符号对角度位置和速度做出反应。该集群涵盖了长 torus、缰核、视顶盖、被盖区（包括nMLF、动眼神经核和滑车神经核）、小脑、前庭神经核、前庭脊髓神经元、下橄榄核以及菱形节7中的神经元，但不包含菱形节3-6的内侧后脑神经元。

为了研究这种相位图在不同鱼类中的保守性，我们从8条鱼中计算出了平均相位图（图4F，左；视频S4，第二部分；单个相位图见图S2）。所选大脑中响应神经元的比例图4E展示了相关区域。在缰核、纵隆起和视顶盖区域，相位图的强度在取平均后大幅降低，这表明在这些区域，相对于相位响应的功能组织并非定型的。相比之下，被盖、小脑和后脑均表现出强烈的平均化响应，反映出其功能组织更具定型性。图S4A展示了按图4A中先前定义的四个相位区间划分的平均相位图。为彻底排除部分测得的活动可能由残留视觉输入诱发的可能性，我们在9条双去核鱼中重复了实验（STAR方法）。对应的平均相位图如图4F（右侧）以及按四个相位区间划分的图S4B所示。在有眼和无眼的麻痹鱼中获得的平均相位图的全脑尺度组织具有可比性，因此其代表了对纯前庭滚动刺激的大脑响应。具体而言，双去核麻痹鱼的单个相位图在视顶盖中也表现出响应，这意味着视顶盖必然通过前庭通路被激活。然而，与在完整鱼中进行的类似记录（图S2）相比，双去核鱼获得的单个相位图（图S3）在不同个体间表现出更大的变异性。前庭控制回路的微调可能需要数天的视觉反馈缺失，这或许能解释这种更大的变异性。即使在活动状态（非麻痹）的动物中，也观察到了平均相位图中相同的大规模组织（图S4C），两个主要的相位簇包含被盖、小脑、前庭核和菱节7中的神经元。

回归分析揭示了对前庭阶跃刺激存在三种不同相位和张力反应模式的聚类

我们现在转向类似地在麻痹且完全嵌入的鱼身上执行的分步刺激方案。该方案由一系列三个步骤组成，以递增幅度（10、15和20）交替进行显微镜的正向和负向旋转，每一步之间在零度旋转角度处保持20秒的停留时间。全脑神经元的诱发动态见视频S5第一部分。响应神经元可分为两组，其活动分别与顺时针（正向）或逆时针（负向）旋转相关。与分步刺激具有最大绝对相关系数的神经元，对正弦刺激（图5A；正弦数据与图4B-4D相同，均在同一条鱼中记录）。对正向（分别为负向）阶跃产生反应的神经元以7/8π（分别为15/8π）的相移跟随正弦显微镜的旋转（图5B）。

图5. 麻痹斑马鱼在动态前庭阶梯刺激下的全脑功能性神经元反应。(A) 散点图展示神经元对阶跃刺激的响应性（相关系数）与对正弦刺激的响应性（响应幅度定义为在刺激频率下测得的信噪比；STAR 方法）。点的颜色根据响应相对于正弦刺激的相移进行着色。SNR，信噪比。(B) 所有神经元的散点图（与图A相同），以相关系数r为半径、以相位为角度，采用与图A相同的颜色编码。左图显示所有ρ为正的点，右图显示所有r为负的点（半径为((p))的绝对值）。黑色等高线表示密度分布的等值线。(C) 多元回归分析揭示了三个神经元响应簇。回归系数（左列）和相应T值（右列）的散点图。数据来自视频S5和图A-E所示的示例斑马鱼，共包含77,648个神经元。不属于响应簇的神经元以灰色点显示；成簇神经元根据相应簇的颜色着色。品红色簇对应对正角度和正角速度均表现出强响应的神经元（在回归系数及相关T值中均处于((>95)百分位）。淡绿色簇的神经元对负角度和负角速度均具有高响应性，而金黄色簇的神经元对正、负角速度均表现出高响应性。(D) 上图：三个簇中所有神经元对阶跃刺激的试次平均轨迹。神经元索引标注在左侧（1–1,168），ΔF/F 色标条显示在顶部（数值裁剪至[0, 0.5]），神经元簇分配显示在左侧色标条中。神经元按簇分组，随后根据对位置回归因子的系数强度排序，以展示响应强度的梯度。下图：前庭阶跃刺激的旋转角度α（黑色），以及三个簇的试次和神经元平均轨迹（各簇对应颜色）。同时绘制了其平均回归拟合曲线（黑色实线）；对于品红色簇和淡绿色簇，还绘制了平均仅位置拟合曲线（黑色虚线），以说明各回归因子的贡献。(E) 使用 Fishualizer 对同一条示例斑马鱼进行的簇空间组织可视化。这些数据也显示在视频S5的第二部分（3D形式）。(F) 直方图显示了所选脑区中属于三个已识别平均簇密度的神经元比例。端脑（Tel）、缰核（Hab）、顶盖前区（PT）、背侧丘脑（DTh）、腹侧丘脑（VTh）、视顶盖（OT）、半环隆起（TSC）、被盖（Teg）、纵隆起（TL）、小脑（Cer）、菱节1-7（Rh 1–7）。

这两个神经元群体与正向和负向角度步长的高度相关性，可能意味着这些神经元的活动是根据鱼的角度朝向（由显微镜的设定角度决定）进行调节的。然而，这两个集群的平均信号（未展示）并非纯紧张性的，还包含一个相位性成分。此外，它们仅在鱼从其偏好的背朝上姿势向特定方向旋转时被激活，而对反向旋转不敏感（无抑制反应）。为量化这些观察结果，我们进行了多元线性回归分析，构建了四个回归变量，由刺激物的旋转角度和角速度分别拆分为正向和负向部分构成，再经过进一步整流处理，并与GCaMP6s反应核进行卷积（STAR方法；图S5A）。我们对4个回归系数及其对应的T分数联合应用95百分位阈值法，对具有相似反应特征的神经元进行聚类（图5C；STAR方法）。

该分析得出了三个主要聚类（图5C和5D）：聚类1和聚类2根据其对正弦刺激的中位相移分别被赋予品红色和淡绿色，而聚类3因无法归属于特定的相位调谐而被赋予中性色金色（图S5；视频S5 第二部分）。第一个聚类的神经元（图5C-5E，品红色）对正角度和正速度均表现出混合响应，而对负角度和负速度无响应（图5C和5D）。该聚类对应于相对于正弦刺激表现出15/8π相移的神经元群体（图S5B）。较大的角度旋转回归系数（图5D下方的黑色虚线）反映了神经元活动随步长增加而增强的趋势。角速度回归系数既解释了快速上升时间（这一点无法仅通过位置回归因子解释），也解释了显微镜从负角度旋转回零位时诱发的相位响应。除了混合的角度旋转和角速度响应外，这些神经元在停留时间内还表现出适应现象，这一过程未被我们的线性回归因子捕捉到，且其特征时间尺度在不同神经元间存在差异（图5D上方）。第二个聚类（淡绿色）表现出相似的响应，但针对的是反向的角度和速度。其对正弦刺激的响应主要表现出7/8π的相移，即相对于聚类1呈反相。第三个聚类（金色）包含表现出纯相位响应、且对任一方向均无明显偏好的神经元。视频S5展示了构成这三个聚类的所有神经元对阶跃刺激的神经元活动4D可视化，以及已识别聚类密度的3D动画。该可视化基于我们开发了一款名为“Fishualizer”的定制可视化工具（详见STAR方法）。

我们旨在探究前庭反应神经元的这种功能组织在不同个体间是否一致。为此，我们对8条斑马鱼进行了记录，并将所有神经元的坐标映射至Z脑图谱的参考框架中。我们估算了每个集群中细胞空间位置的连续概率密度函数，并对不同斑马鱼的这些密度图取平均（图5G；视频S5第三部分；STAR方法）。已识别的前庭反应集群的平均密度图覆盖了大脑的大部分区域。这两个镜像对称的区域（品红色和淡绿色）涵盖了被盖区——包括中缝大核（nMLF）、动眼神经核和滑车神经核的运动神经元——小脑，以及1至7号菱节，其中包含前庭脊髓神经元、前庭核和下橄榄核。在这些平均密度图中，我们未在视顶盖、纵隆起和左侧缰核中观察到显著的平均密度（见图5F中的直方图）。纯相位反应区域（金色）涵盖了半环隆起、与半环隆起相邻的视顶盖、丘脑、顶盖前区、小脑以及1至5号菱节中的神经元群（见图5F中的直方图）。

我们在11条双核鱼中重复了相同的实验和分析，发现了相同的三个平均密度簇（图5H）。这些对照实验表明，在我们的实验中，这三个功能簇主要是由前庭刺激驱动的。

值得注意的是，使用两种方案（逐步方案和正弦方案）得到的聚类结果是一致的。具体而言，通过回归分析识别出的两个相位-音调聚类（聚类1和聚类2）与相位图中处于相位区间(iv)的两个互补群体高度重叠。这些神经元确实在旋转角度和速度的中间值下，对正弦刺激表现出最大响应。然而，逐步刺激的结果让我们能够重新解读正弦刺激所诱发的荧光信号。由于所有神经元在角度或速度的特定方向（正向或负向）上都会被激活，因此可以预期它们对正弦刺激的响应是一个经过整流的相移正弦信号。荧光轨迹呈现正弦形态，仅仅是因为它是神经元响应与GCaMP6核的卷积结果，而GCaMP6核的衰减时间与刺激周期相当，最终形成了平滑的类正弦信号。

讨论

与其他感觉模态不同，前庭通路长期以来无法通过钙成像技术进行功能研究。本文介绍的紧凑型旋转光片显微镜首次实现了对接受生理前庭刺激的脊椎动物进行全脑记录刺激。该系统使我们能够系统地描绘出滚动刺激过程中参与的完整神经元群体，并揭示其形态组织。功能分析让我们识别出三个主要神经元簇，这些神经元簇对旋转角度和角速度具有不同的调谐特性。本系统为探究前庭和多感官刺激下大规模神经元回路的动态变化提供了灵活且可扩展的基础。

让功能成像与前庭刺激兼容

前庭系统的激活需要动物头部进行宏观方向调整，这在之前阻碍了细胞分辨率的功能成像。我们通过设计一款紧凑型光片显微镜克服了这一局限，该显微镜的机械刚性确保了其在动态旋转过程中具有亚微米级的图像稳定性。在本研究中，我们聚焦于滚动刺激，但利用市售的电动载物台，可轻松实现倾斜、平移等其他自由度的控制。

这款紧凑型光片显微镜的核心特征是微型化光片单元。其紧凑性有助于开发配备多个光片的装置：因此可在鱼的前方（沿吻尾轴）轻松安装第二个模块，以对当前被眼睛遮挡的腹侧脑区进行成像。除本文报道的特定应用外，该单元还可能在其他场景中发挥作用，因为它可安装在任何商用显微镜上，将其转化为数字扫描光片成像系统。由于光学组件数量较少，它成本相对较低、组装简便且校准直观。

由于光片由扫描激光束产生，我们的装置易于适配共焦狭缝检测等技术改进，这一改进可通过减少荧光光子因脑组织散射而在相邻细胞间产生的串扰，从而提升成像分辨率。若红外飞秒激光能成功与光导耦合，双光子激发[3]也可投入使用，它能消除单光子方案中蓝色（可见光）激光对视觉系统的刺激，实现对视觉输入的完全控制。此外，还可将其他激光谱线与同一光导耦合，以拓展可用荧光探针的范围。尾部追踪装置和/或与微型视频投影仪相连的鱼类下方屏幕，也可轻松安装在旋转平台上，以提供额外的视觉刺激和运动学读数。

一种可视化、检查和分析4D全脑功能数据的新型图形工具

斑马鱼大脑的光片成像会产生海量数据集。此类数据的可视化与分析虽具挑战性，却至关重要，能为研究人员提供灵活的访问、查看与交互方式。为此，我们开发了一款高效的图形化软件工具——Fishualizer。该工具可展示大型4D数据集，如全脑神经元的钙信号或放电轨迹，以及对应的刺激和/或行为反应，还支持自由旋转。缩放或平移数据。尽管可对多种物种进行可视化，但当前的实现为斑马鱼钙成像提供了多个特定选项，例如斑马鱼大脑区域的可视化[22]以及基于钙成像数据的峰电位推断。图5E、5G、5H和视频S5中的可视化效果由Fishualizer生成（详细信息见STAR方法）。Fishualizer基于通用公共许可证（GPL）免费提供（https://bitbucket.org/benglitz/fishualizer_public/）。

前庭刺激激活跨越多个脑区的扩展神经元集群

利用旋转光片显微镜，我们揭示了对滚动刺激产生反应的全脑定型神经元群。这些神经元群与椭圆囊驱动的前庭通路的已知结构相符。在进行记录的发育阶段（6-7天胚胎期），前庭刺激仅由椭圆囊传递，因为半规管尚未具备功能，而球囊仅传递高频（听觉）信号[14,26]。与椭圆囊运动相关的前庭信息通过听神经节传递至位于耳朵周围菱节1-6外侧的前庭核[27]，我们在该区域观察到了强烈的刺激驱动活性。信号随后被传递至运动神经元，以驱动（1）眼球运动来维持凝视稳定，以及（2）尾部偏转来维持身体姿势。

前庭眼反射利用椭圆囊感知的重力-惯性信息，并通过切线前庭核（菱形核5侧部）中的中间神经元将其传递至动眼神经元（第Ⅲ、Ⅳ脑神经），消融研究已证实这一点。这些对侧投射的中间神经元的树突分支区域覆盖了动眼神经核（第Ⅲ、Ⅳ脑神经核）、内侧纵束后核（nMLF）以及被盖中更前端的神经元群。这种投射模式与我们的研究结果一致，即前庭核中刺激诱发的活动与对侧被盖大部分区域（包括动眼神经核）的诱发活动同相。内侧纵束后核（nMLF）前端被盖中的活性神经元可能属于 Cajal 间质核，该核是与内侧纵束后核相关的视动前核，参与扭转和垂直眼球运动的速度-位置整合。

法夫尔-布勒等人近期报道称，利用光镊将椭圆囊从中线处移开，会诱发尾部向对侧偏转，且偏转幅度逐渐增大。由于这种模拟的前庭刺激模拟了鱼类沿其体长轴的旋转，所诱发的尾部偏转可被解读为一种矫正反射，旨在使身体恢复至正常的背侧向上位置。研究表明，对被盖区域nMLF进行光遗传学刺激，会通过后续激活轴下后肌引发类似的持续性尾部偏转，这表明前庭信息是从前庭核经由nMLF传递至脊髓的。与这些观察结果一致的是，我们观察到nMLF中由刺激诱发的神经活动与对侧前庭核的活动同相。

小脑和下橄榄核的活动表明，小脑可能参与了前庭驱动运动程序的增益适应，正如在金鱼中的研究所述其他脊椎动物。根据这些研究，残余的视网膜滑移被用作误差信号，并通过下橄榄核传递至小脑，以进一步调整代偿性眼球运动的增益]。

除了上述提及的脑区外，前庭刺激还在视顶盖、纵隆起和左侧缰核中引发了神经活动。顶盖中的神经活动可能由来自纵隆起的轴突驱动，这些轴突呈切线方向投射至顶盖的边缘层，形成了类似小脑的系统[34]。纵隆起本身接收自动眼神经核和滑车神经核的输入，这两个区域对滚动刺激表现出了强烈的反应。顶盖中的神经元活动也可能通过小脑的投射进行调节，而在我们的实验中，小脑对滚动刺激也表现出了强烈的反应。在缰核中，反应主要集中在左侧，其相位特征与相邻的纵隆起极为相似。Portugues 等人[8]曾报道，在视觉全视野正弦刺激下，这两个区域也出现了类似的协同活动。该研究的作者将缰核中的活动解读为对视觉刺激明暗交替的反应，而非对视觉刺激本身运动的反应。然而，我们观察到，在双眼摘除的斑马鱼中，缰核的反应依然存在，这表明该活动至少部分是由身体旋转驱动的。左侧缰核与纵隆起的反应特征相似，说明这两个结构之间存在直接或间接的连接。

回归分析揭示了三种不同相位性和张力性反应的主要功能簇

回归分析揭示了两个符号相反的混合相位-张力簇以及第三个纯相位簇。这两个相位-张力簇包含支配扭转性代偿眼运动的动眼神经核和滑车神经核的颅运动神经元。这一发现与罗宾逊模型一致，该模型指出，动眼神经元的角度调节反应通过驱动肌肉张力来克服动眼装置中的恢复弹力，从而将眼睛维持在特定的扭转角度。而速度反应则驱动眼睛以特定角速度运动所需的肌肉活动，因为这种动态眼球旋转需要进一步克服粘滞力。与这一解释一致，我们观察到运动神经元的活动相对于正弦刺激呈现正相移，这反映了相位成分的存在。在校正了GCaMP6s报告基因引入的延迟后，相位图中清晰显示出这一正相移（图4A，下方）。

我们的研究结果与解读与Favre-Bulle等人]提出的结论一致，他们通过光镊直接移动斑马鱼幼体的椭圆囊耳石，成功将基于光片的全脑成像与前庭系统的虚拟刺激相结合。该方法无需对鱼体进行物理旋转，还能灵活调整刺激方案，可独立刺激每只耳朵的椭圆囊，从而区分其各自的作用。两种方法均发现，前庭响应神经元广泛分布于大脑的大部分区域，包括缰核、视神经顶盖、被盖、小脑、前庭核以及后脑内的神经元分布于所有菱节中。法夫尔-布勒等人在仅刺激单个耳石时观察到了不对称的神经元反应。这一发现与我们通过回归分析确定的两个双侧对称功能簇（品红色簇和淡绿色簇）的反向反应相符。

对未来研究的启示

我们的研究结果为前庭处理的全脑环路分析迈出了第一步，并为验证特定预测和假设提供了实验与分析途径。因此，通过将成像区域扩展至脊髓，可验证巴格纳尔（Bagnall）和麦克莱恩（McLean）提出的观点：滚动刺激引发的反应会差异性激活脊髓腹侧和背侧的微环路，从而产生自扶正扭矩。让斑马鱼幼体绕其倾斜轴旋转，还能对肖皮克（Schoppik）等人的观点进行功能量化，即在俯仰旋转过程中，负责凝视稳定的前庭神经元会以6:1的鼻上/鼻下比例被不对称募集。

在当前的设计中，这台旋转显微镜可使鱼体产生最大25度的旋转幅度，并能在不到10毫秒内达到每秒60度的转速。尽管这一运动学范围尚不足以模拟与单次游泳冲刺相关的鱼体剧烈摆动，却已能模拟鱼类在三维主动探索过程中所受重力方向的变化，或是与水流相关的缓慢摇摆运动。这一技术改进将通过整合前庭感觉来拓展虚拟现实系统的应用潜力，从而助力研究三维导航过程中复杂的多感觉整合与运动调控机制。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。