题目：BMP7 promotes cardiomyocyte regeneration in zebrafish and adult mice

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38678558/

期刊：Cell Reports

研究亮点

lBMP7的表达水平在哺乳动物出生后早期的心脏发育过程中下降

l内源性Bmp7维持斑马鱼和新生小鼠的心肌细胞增殖

lBMP7可促进斑马鱼和成年小鼠损伤后的心肌细胞再生

lBMP7通过激活SMAD5、ERK和AKT通路诱导心肌细胞增殖 

摘要

斑马鱼在心脏受损后具有终身再生能力，而哺乳动物则在出生后早期发育阶段丧失了这一能力。本研究探究了哺乳动物出生后发育过程中生长因子表达的下降是否会导致心肌细胞再生潜能的降低。研究除了证实神经调节蛋白1（NRG1）、白介素（IL）1β、核因子κB受体激活剂配体（RANKL）、胰岛素样生长因子（IGF）2以及白介素6（IL6）的增殖能力外，还鉴定出了其他潜在的促再生因子，其中骨形态发生蛋白7（BMP7）展现出最为显著的功效。在新生小鼠心肌细胞中敲低Bmp7，以及在成年斑马鱼心脏再生过程中抑制Bmp7功能，均会降低心肌细胞的增殖能力，这表明Bmp7对小鼠和斑马鱼心脏的再生阶段至关重要。相反，在再生中的斑马鱼体内过表达bmp7，或在有丝分裂后的幼年及成年小鼠体内、体外心肌梗死模型中给予bmp7，均能增强心肌细胞的增殖周期。从机制上看，BMP7通过BMPR1A/ACVR1和ACVR2A/BMPR2受体以及下游的SMAD5、ERK和AKT信号通路刺激细胞增殖。总体而言，给予BMP7是实现心脏再生的一种极具前景的策略。

图形摘要

引言

在哺乳动物体内，心肌梗死（MI）等心脏损伤会导致心肌细胞（心肌细胞）大量流失，这些细胞会被纤维化瘢痕组织取代。由于成年个体的再生能力极为有限哺乳动物的心脏，这种情况通常会导致心力衰竭。目前，心脏损伤的有效治疗方法尚缺乏，这凸显了开发心脏再生治疗策略的迫切需求。

尽管斑马鱼和部分两栖动物等非哺乳脊椎动物展现出显著且终身的心脏再生能力。 但多种哺乳动物的心脏再生仅在胚胎/胎儿期和新生阶段被证实存在显著效果。事实上，哺乳动物的心脏再生能力在出生后早期会迅速下降。在在小鼠模型中，出生后1周，大多数心肌细胞便已退出细胞周期，心脏在受损后也无法再生，最终形成永久性瘢痕11。在成年哺乳动物体内，心肌细胞的更新速度极低，不足以启动心脏再生过程。

心肌细胞的可逆去分化和增殖在促进成年斑马鱼和新生小鼠的心脏再生中发挥关键作用。此外，内源性心肌细胞是成年哺乳动物中心肌细胞低更新率的主要来源。各种微环境因素，包括神经调节蛋白1（NRG1），纤维成纤维细胞生长因子1（FGF1），骨形态发生蛋白10（BMP10），抑瘤素M（OSM），肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子，调节性T细胞分泌的细胞因子，卵泡抑素，血管内皮生长因子（VEGF），骨形态发生蛋白1.3（BMP1.3），骨形态发生蛋白2（BMP2），以及多种全身性甲状腺激素36、糖皮质激素37等因子已被证实可调节内源性心肌细胞的去分化与增殖，进而调控成年哺乳动物在严重心脏损伤后的心脏再生过程。本文提出假设：特定生长因子表达水平的下降，是导致哺乳动物出生后早期心肌细胞增殖及再生能力丧失的原因。

结果

在哺乳动物出生后早期发育阶段，心脏组织中多种生长因子的表达水平会迅速下降

在本研究中，我们旨在鉴定并研究在出生后早期心脏组织中表达水平下降最显著的生长因子的再生潜能，这一时期与心肌细胞退出细胞周期相吻合。为实现这一目标，我们在从1日龄（P1）和10日龄（P10）小鼠体内分离的心脏的RNA测序数据中，检测了117种市售生长因子（表S1）。分析结果显示，有21种生长因子的表达水平下降幅度超过50%，其中12种呈现出具有统计学意义的下降（图1A）。

我们对第二个数据集也进行了类似分析，该数据集包含从1日龄（P1）和9日龄（P9）小鼠体内分离的心脏的RNA测序数据。分析显示，15种生长因子的表达水平至少降低了50%（图1B），其中13种在首次分析中也被识别出来。通过合并两个数据集的结果，我们共鉴定出23种在出生后早期发育过程中表达显著下降的因子。其中，编码BMP7、白介素（IL）1RA、NRG1b、CTGF、GDNF、IL23a、BNP（NPPB）、胰岛素生长因子（IGF）2、LGALS7（GAL7）和LGALS3（GAL3）的基因在P1时高表达，而编码IGFBP1、FGF23、IL1b、IL17b、CXCL17、IL17f、CCL3、CXCL14、GDF5（BMP14）、IL6、核因子κB配体可溶性受体激活剂（sRANKL）（TNFSF1L）和IL10的基因在P1时表达水平较低（图1A和图1B）。

在哺乳动物出生后早期发育过程中表达下调的多种生长因子可促进新生心肌细胞的细胞周期进程

随后，我们评估了23种选定生长因子的促有丝分裂特性。我们检测了它们对新生心肌细胞周期进程的影响，这些心肌细胞于出生后第1天（P1）分离，在该阶段保留着与胚胎阶段相似的内在增殖和再生能力。考虑到发育中心肌细胞S/G2/M期的时长约为14小时，整个细胞周期时长超过24小时45，我们采用累积BrdU掺入法，如先前研究所述37，在48小时的时间范围内分析了心肌细胞的周期进程。为特异性鉴定心肌细胞，我们对肌钙蛋白I标志物进行了共免疫染色。研究数据显示，23种选定的生长因子中有18种，即CXCL17、sRANKL、BMP7、GDF5（BMP14）、LGALS7（GAL7）、CCL3、IGF2、IL6、IL1RA、IL17b、CXCL14、IL10、IGFBP、IL1b、NRG1b、LGALS3（GAL3）、IL17f 以及 GDNF 能够刺激心肌细胞周期进入 S 期（图 2）。有趣的是，此前已有研究报道 NRG1、IGF2、IL6 和 sRANKL 可促进心肌细胞增殖和心脏再生，这验证了我们的筛选方法。也有研究表明 IL1b 可诱导心肌细胞增殖，尽管它也可能导致细胞凋亡。重要的是，我们的研究揭示了其余 13 种因子的促增殖潜力。CXCL17、BMP7、GDF5（BMP14）、LGALS7（GAL7）、CCL3 和 IL1RA 的处理效果最为显著，与未处理的对照组相比，心肌细胞周期进程增加了 1.5 倍以上。IL17b、CXCL14、IL10、IGFBP、LGALS3（GAL3）、IL17f 和 GDNF 也显著促进了心肌细胞周期进程，但其效果弱于前述因子组（图 2）。

骨形态发生蛋白7作为内源性生长因子在新生阶段促进哺乳动物心肌细胞增殖

基于上述筛选和分析，我们选出了六种在BrdU检测中表现出显著效果的生长因子：CXCL17、BMP7、LGALS7（GAL7）、GDF5（BMP14）、CCL3和IL1RA。我们未对IGF2、IL6和sRANKL进行进一步分析，因为它们促进心肌细胞增殖和心脏再生的能力已被证实在以往的研究中已有提及。

如前所述，大多数哺乳动物心肌细胞心肌细胞在出生后不久便退出细胞周期。为了评估为探究所选生长因子促进心肌细胞细胞周期活动的能力，我们分析了Ki67的核免疫反应性（Ki67是细胞周期活跃期的标志物），并以心肌肌钙蛋白T作为心肌细胞的标志物。研究结果证实，所有所选生长因子均能刺激心肌细胞的细胞周期活动，其中均属于骨形态发生蛋白家族的BMP14和BMP7展现出最强的作用效果（图3A）。

在小鼠出生后的早期阶段，大多数心肌细胞会进行DNA合成和细胞核分裂（核分裂），但不会继续进行细胞质分裂（胞质分裂），从而形成双核细胞。 同样，在人类体内，大多数心肌细胞会进行DNA合成但不发生核分裂，最终形成多倍体细胞。为评估所选生长因子对新生鼠心肌细胞分裂的影响，我们分析了极光激酶B的染色情况，该酶在后期后期定位于中央纺锤体的赤道位置，在胞质分裂期间则定位于中间体。

我们的数据表明，BMP7 可触发心肌细胞的胞质分裂（图 3B）。通过对用四甲基罗丹明乙酯酯（TMRE，一种荧光线粒体染料）标记的新生心肌细胞进行延时成像，这一效应得到了进一步验证（图 3C；视频 S1）。

通过对心脏基质细胞进行免疫磁性阴性分选，在富含心肌细胞的培养物中也证实了BMP7促进心肌细胞增殖的能力（图S1A和S1B），这表明BMP7对新生心肌细胞增殖具有直接作用。

为了评估内源性BMP7是否在新生期维持心肌细胞的增殖，我们敲低了BMP7。转染48小时后证实了BMP7沉默的效率（图S1C；表S2和S3）。BMP7敲低降低了体外培养的出生后第1天（P1）心肌细胞的增殖，而外源性给予BMP7可恢复这一现象（图3D）。

总体而言，这些数据表明内源性 BMP7 可直接促进心肌细胞的细胞周期活性、向 S 期的进程以及细胞分裂。

图1. 心脏出生后早期发育过程中表达水平下降的生长因子的鉴定（A和B）通过对RNA测序数据进行荟萃分析获得的小鼠出生后第1天（P1，第一列）和出生后第9或10天（P9或P10，第二列）心脏裂解物中生长因子的mRNA表达水平16,44，以及从P1到P10（或P9）的计算降幅（以百分比表示，柱状图）。第一列和第二列中的数值以三次生物学重复的平均表达水平呈现；P值为从P1到P10（或P9）的降低所报告的数值（第三列），如下所示* (^{*} p ≤0.05)；(^{*} rho ≤0.01)；(^{* *} p leq) 0.001；(cdots p ≤0.0001)。

图2. 候选生长因子诱导新生心肌细胞周期进程的能力离体培养新生小鼠心肌细胞，用选定的生长因子（10 ng/mL）刺激48小时，即ARTN、CTGF、NPPB（BNP）、IL23a、GDNF、FGF23、IL17f、LGALS3（GAL3）、NRG1b、IL1b、IGFBP、IL10、CXCL14、IL17b、IL1RA、IL6、IGF2、CCL3、GDF5（BMP14）、LGALS7（GAL7）、BMP7、sRANKL和CXCL17。心肌细胞通过心肌肌钙蛋白I（cTnI）染色鉴定，并通过DNA合成免疫荧光分析（BrdU掺入试验）（((n=34,914)心肌细胞来自162个样本的分析）；提供代表性图片；箭头指向增殖的心肌细胞；刻度条，20 mm。值以平均值表示（误差条显示SEM），确定统计学意义

图3. BMP7 可强效诱导新生哺乳动物心肌细胞的细胞周期活性与细胞分裂。（A和B）从出生后第1天（P1）小鼠体内分离的心肌细胞进行体外培养，并用选定的10纳克/毫升生长因子刺激48小时，这些生长因子包括CCL3、CXCL17、GAL7（LSGAL7）、IL1RA、BMP14和BMP7。通过心肌肌钙蛋白T（cTnT）或肌钙蛋白I（cTnI）染色鉴定心肌细胞，并通过免疫荧光分析（A）细胞周期活性（KI67）或（B）胞质分裂（中间体极光B激酶）（(n=13,961)，心肌细胞合并自） 

骨形态发生蛋白7在斑马鱼自发心脏再生过程中促进心肌细胞增殖

BMP7蛋白由一个在各类脊椎动物中高度保守的基因编码脊椎动物物种。我们在斑马鱼模型中的前期研究研究模型表明，心脏损伤会触发骨形态发生蛋白（BMP）信号通路，而抑制该通路则会阻碍心肌细胞的再生。 尽管已有研究证实损伤后骨形态发生蛋白配体（bmp2b 和 bmp7a）的表达会增加， 但此前尚未探究过骨形态发生蛋白7（Bmp7）在斑马鱼心肌细胞再生中的具体作用。

为探究 Bmp7 在斑马鱼心肌细胞再生中的作用，我们分析了 bmp7a 基因功能缺失突变纯合子斑马鱼的再生心脏。58 通过向受精卵注射野生型 bmp7a mRNA，我们成功挽救了纯合突变体的早期胚胎致死性，56 使其能够发育至成年（图4A）。随后，我们在冷冻损伤后7天（dpi）检测EdU掺入情况，此时心肌细胞增殖处于峰值，结果发现与野生型同窝仔鱼相比，bmp7a 缺陷型鱼的伤口边缘区域心肌细胞增殖水平降低（图4B）。

斑马鱼基因组中包含两个人类BMP7的同源基因bmp7a和bmp7b，其中Bmp7b与人类BMP7的相似度高于Bmp7a（氨基酸一致性分别为80%和66%）。55 以往研究表明，敲除bmp2b、bmp4和bmp7等Bmp配体会导致背侧化表型和胚胎早期致死，56 而过表达这些配体则会诱导腹侧化。58 本研究发现，bmp7a和bmp7b在腹侧化野生型胚胎方面具有同等效率（图S2A和S2B），且bmp7b mRNA能够完全挽救bmp7a突变体胚胎（图S2C和S2D）。由此可见，斑马鱼bmp7a和bmp7b在过表达实验中具有相似的生物学活性。因此，鉴于bmp7b的序列与人类BMP7更为相似，本研究选择其开展进一步的功能获得性实验。我们构建了可热休克诱导过表达bmp7b、并通过增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标记心肌细胞的转基因斑马鱼品系（hsp70L:bmp7b，基因编号(myl7:eGFP ^{a 5 T g})）。

在未受伤的 hsp70L:bmp7b 转基因斑马鱼（(myl7:eGFP ^{a / 5 T g})）成体心脏中，通过每日热激持续7天过表达 bmp7b，可有效诱导心肌细胞中 pSmad 1/5/9 的核积累（图S3A、S3B）；但与热激处理的野生型斑马鱼相比，这一操作不足以显著增加处于增殖周期的心肌细胞数量（图S3C）。相反，心脏损伤后，bmp7b 过表达在损伤后7天（7 dpi）显著增加了增殖中心肌细胞的数量（图4C、4D）。综上，这些结果表明内源性 bmp7 可维持斑马鱼心脏再生过程中心肌细胞的增殖，而进一步提高 bmp7 的水平能够增强这一过程（图S4）。

在哺乳动物出生后的发育过程中，心肌细胞中的骨形态发生蛋白7（BMP7）表达水平会下降

我们检测了出生后不同发育阶段小鼠心脏组织中的Bmp7表达情况，分别为出生后第1天（P1）、第3天（P3）、第7天（P7）、第28天（P28）和第56天（P56）。分析证实，出生后早期发育阶段Bmp7表达显著下降，且该下降趋势在该阶段之后仍在持续（图5A）。通过对心脏基质细胞进行免疫磁选的阳性和阴性分选，我们还发现，新生（P1）小鼠体内，Bmp7在心肌细胞中的表达丰度远高于心脏基质细胞，且在出生后早期发育阶段，心肌细胞内的Bmp7表达出现特异性降低（图5B）。为了更全面地表征Bmp7在心脏组织中的表达特征，我们分析了已公开的心脏细胞群分选数据。这些分析显示，新生阶段，心肌细胞以及表达量相对较低的免疫细胞均会表达Bmp7（图S5A）。相反，新生小鼠的成纤维细胞和内皮细胞中Bmp7表达水平极低（图S5A）。此外，心肌细胞中的Bmp7表达水平从新生阶段到成年阶段大幅下降，且心脏损伤并不会诱导其表达上调（图S5B）。综上，BMP7主要由新生小鼠的心肌细胞产生，其表达量在出生后早期发育过程中逐渐降低。总体而言，我们的研究结果表明，在心肌细胞中，BMP7是一种能够触发心肌细胞增殖的自分泌因子。

BMP7 的给药可刺激成年哺乳动物心肌梗死后心肌细胞的增殖

在哺乳动物中，心肌细胞的再生能力在出生后早期会显著下降¹¹，这与它们的成熟、双核化以及细胞周期退出同步发生。为了探究再生窗口期关闭后BMP7信号通路是否能诱导心肌细胞增殖，我们检测了不同浓度的BMP7处理对从出生后第7天（P7）小鼠体内分离的心肌细胞的影响。小鼠。我们的研究结果显示，高剂量骨形态发生蛋白7（BMP7）可增强出生后7天（P7）心肌细胞的细胞周期活性（以KI67染色结果为指标）和细胞周期进程（以BrdU检测结果为指标）（图5C及图S6A）。此外，高剂量BMP7处理显著增加了BrdU阳性单核心肌细胞的数量（图5D），同时有使BrdU阳性双核心肌细胞数量减少的趋势（图S6B）。这些观察结果表明，在再生能力已丧失的情况下，BMP7足以刺激幼年心肌细胞的细胞分裂。我们进一步探究了BMP7是否足以诱导成年未损伤小鼠心肌细胞重新进入细胞周期。为此，我们对成年小鼠模型通过腹腔/静脉注射给予BMP7，持续12天（图S6C）。数据显示，经BMP7处理的小鼠，其成年心肌细胞重新进入细胞周期的比例有适度提升（图S6D）。值得注意的是，近期有研究表明，心肌梗死（MI）后给予2周BMP7可发挥心脏保护作用，减少大鼠的梗死面积并改善心功能。其潜在机制与拮抗转化生长因子-β1（TGF-β1）的促纤维化信号通路有关。然而，BMP7在心脏损伤后促进成年哺乳动物心肌细胞再生的潜力尚未得到验证。

为评估骨形态发生蛋白7（BMP7）能否在心脏损伤后刺激心肌细胞增殖，我们通过对成年小鼠（3月龄）永久性结扎左前降支冠状动脉构建心肌梗死（MI）模型，并于心肌梗死2天后通过静脉/腹腔注射方式给予BMP7，持续12天（图5E）。治疗结束时（心肌梗死后14天），我们观察到梗死边缘区心肌细胞的细胞周期再进入及增殖活性均有所增加（图5F、5G及补充图S6E），而在远离梗死区域则呈增加趋势（图5F、5G）。值得注意的是，BMP7的递送使心脏基质细胞的增殖活性略有降低（补充图S7A）。在新生鼠心脏细胞培养体系中，也观察到BMP7对心脏基质细胞的抗增殖作用（补充图S7B、S7C）。综上，我们的研究结果表明，BMP7是一种特异性触发哺乳动物心肌细胞增殖的生长因子。在哺乳动物出生后早期，心脏中BMP7水平的下降是导致心肌细胞退出细胞周期的重要原因；而在成年哺乳动物发生心肌梗死后补充BMP7，则可触发心脏再生（补充图S8）。

图4. Bmp7功能缺失和功能获得分别降低和增加斑马鱼心脏再生过程中心肌细胞的增殖。(A)冷冻损伤后7天（dpi）分析bmp7a纯合突变斑马鱼心肌细胞周期的实验设计。(B) 对bmp7a突变体斑马鱼和野生型同胞的冷冻损伤心脏进行EdU掺入和MHC（用于鉴定心肌细胞）的免疫荧光分析。野生型样本数n=7个心脏，每个心脏取三个切片，共1158个心肌细胞；突变体样本数对应(n(b m p 7 a^{-1-})=6)，每个心脏取三个切片，共472个心肌细胞。展示代表性图片；箭头指向处于增殖周期的心肌细胞；比例尺为100微米。(C) 实验设计展示了利用转基因品系实现热休克诱导的bmp7b过表达，同时心肌细胞中组成型表达GFP。(D) 对热休克处理的hsp70L:bmp7b转基因斑马鱼和野生型同胞在冷冻损伤后7天进行PCNA（增殖细胞核抗原）和肌球蛋白轻链7（MYL7，用于鉴定心肌细胞）的免疫荧光分析。注：未展示GFP荧光信号。hsp70L:bmp7b转基因样本数对应(myf7:eGFP)，每个心脏取两个切片，共421个心肌细胞；野生型样本数对应(n (wild-type) =12)，每个心脏取两个切片，共472个心肌细胞。EdU和PCNA阳性的心肌细胞

骨形态发生蛋白7通过I型受体BMPR1A/ACVR1和II型受体BMPR2/ACVR2A刺激心肌细胞增殖

BMP7是骨形态发生蛋白（BMPs）家族的成员，该蛋白属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族。所有TGF-β家族配体的活性均由丝氨酸/苏氨酸激酶受体的四聚体介导，该四聚体包含两个I型受体和两个II型受体^{61-63}。据报道，BMPs可通过ACVRL1、ACVR1、BMPR1A、ACVR1B和BMPR1B作为I型受体，以及BMPR2、ACVR2A和ACVR2B作为II型受体进行信号传导^{61-63}。具体而言，已有研究表明BMP7能够结合并激活我们在不同细胞类型和发育阶段中分别检测了 ACVR1、BMPR1A、BMPR2、ACVR2A、BMPR1B 以及 ACVR2B 的表达情况。为探究 BMP7 调控心肌细胞增殖的分子机制，我们首先利用公开数据集分析了新生小鼠心肌细胞中 BMP 受体的表达水平。结果发现，Bmpr1a 和 Bmpr2 分别是表达量最高的 I 型和 II 型 BMP 受体（图 S9A）。Acvr1b、Acvrl1、Acvr1 和 Acvr2a 呈弱表达，而 Bmpr1b 与 Acvr2b 无表达（图 S9A），因此将其排除在后续分析之外。

为了确定介导 BMP7 诱导增殖的受体，我们在新生大鼠培养的心肌细胞中沉默了编码 BMPR1A、ACVR1、ACVRL1、ACVR1B、BMPR2 和 ACVR2A 的基因，随后在 BMP7 刺激后进行了 BrdU 掺入实验。转染 48 小时后，BMP 受体的沉默效率得到了验证（图 S9B；表 S2 和 S3）。结果显示，敲低 BMPR1A、ACVR1、BMPR2 或 ACVR2A 会消除 BMP7 的促有丝分裂效应，而敲低 ACVR1B 和 ACVRL1 则无显著影响（图 6A）。这些发现表明，BMP7 通过 BMPR1A/ACVR1 和 BMPR2/ACVR2A 受体促进心肌细胞增殖，可能如先前在人类间质细胞中报道的那样形成四聚体间充质干细胞。

经典SMAD5转导BMP7的促有丝分裂信号

BMP配体激活II型受体，后者使I型受体的激酶结构域发生磷酸化，并激活多种下游信号通路。经典通路涉及受体受体调节的SMAD蛋白（R-SMADs），包括SMAD1、SMAD5和SMAD8/9。一旦被磷酸化并激活，单个或成对的R-SMADs会与SMAD4结合，从而形成异二聚体或异三聚体复合物并发生转位进入细胞核。

因此，我们分析了经BMP7刺激的培养新生大鼠心肌细胞中经典SMAD信号通路的激活情况。研究数据显示，在富含心肌细胞的培养体系和心肌细胞培养体系中，SMAD1/5/9均出现短暂激活，磷酸化SMAD1/5/9（p-SMAD1/5/9）水平的升高可证实这一点（图6B、图S10A和图S10B）。与之一致的是，与对照组小鼠相比，BMP7处理小鼠梗死边缘区的心肌细胞中，磷酸化SMAD1/5/9的核定位水平更高（图6C）。同时敲低SMAD1、SMAD5和SMAD9后，BMP7的促有丝分裂效应被完全消除，这表明SMAD1/5/9信号通路是BMP7诱导心肌细胞增殖所必需的（图6D）。我们还探究了单独敲低各SMAD基因对BMP7处理后心肌细胞增殖的影响，并在转染48小时后验证了SMAD基因沉默的效率（图S10C）。出乎意料的是，研究数据显示SMAD1和SMAD5对心肌细胞增殖的作用截然相反。在在缺乏 BMP7 的情况下，SMAD1 敲低显著增加了基础心肌细胞增殖，而 SMAD5 敲低则呈现出心肌细胞增殖减少的趋势。重要的是，SMAD5 敲低消除了 BMP7 暴露诱导的心肌细胞增殖，而 SMAD1 沉默并不影响 BMP7 的促有丝分裂活性（图 6D）。最后，SMAD9 敲低不影响基础状态或 BMP7 诱导的新生鼠心肌细胞增殖（图 6C）。我们进一步在富集的心肌细胞培养物中证实了 SMAD5 的激活，表现为 BMP7 刺激后其磷酸化水平升高（图 6E 和图 S10D）。

这些数据表明，BMP7 通过激活 SMAD 信号通路来诱导新生心肌细胞的增殖。SMAD5 在心肌细胞中特异性转导 BMP7 的促有丝分裂信号，而 SMAD1 则作为内源性促有丝分裂抑制因子发挥作用。此外，SMAD9 似乎在介导 BMP7 诱导的心肌细胞增殖中不发挥显著作用，这可能是由于其在心肌细胞中的表达水平极低（图 S10E）。

图5. 骨形态发生蛋白7的给药可促进幼年阶段哺乳动物心肌细胞的增殖，并在心肌梗死后的成年期发挥该作用

非经典ERK和AKT通路介导BMP7的促有丝分裂信号转导

BMP激活的受体已被证实可激活非经典通路，包括涉及ERK和AKT的通路。为了探究BMP7信号下游非经典级联反应的潜在作用，我们评估了ERK和AKT的活性磷酸化异构体。我们观察到，在BMP7刺激后，心肌细胞培养物中ERK和AKT出现瞬时激活（图7A）。通过免疫磁珠分离去除基质细胞，我们证实BMP7处理可增加心肌细胞富集培养物中ERK的激活（图S10F）。令人意外的是，在BMP7处理的心肌细胞富集培养物中，我们未检测到AKT激活水平的升高，这可能是因为基质细胞的缺失导致AKT在基础水平下过度激活（图S10F），这一现象值得进一步研究。重要的是，我们的体内分析显示，与对照组心梗小鼠相比，BMP7处理组心梗边缘区心肌细胞中ERK和AKT的核免疫反应性增强（图7B和7C）。

通过使用选择性ERK和AKT抑制剂，我们评估了这些通路是否在BMP7诱导的心肌细胞增殖中发挥作用。抑制AKT和ERK会降低基础状态下的心肌细胞增殖水平（图7D），这与以往的研究结果一致。重要的是，当ERK或AKT的激活被阻断时，BMP7无法促进心肌细胞增殖（图7D）。

总体而言，这些数据表明，BMP7 在心肌细胞中的促有丝分裂活性由经典的 SMAD5 以及非经典的 ERK 和 AKT 通路介导（图7E）。

图7. ERK与AKT非经典通路参与BMP7促有丝分裂信号转导。(A) 对出生后第1天（P1）的心肌细胞培养物用100纳克/毫升的骨形态发生蛋白7（BMP7）刺激30、60和120分钟后，对磷酸化细胞外信号调节激酶（phospho-ERK）、细胞外信号调节激酶（ERK）、磷酸化蛋白激酶B（phospho-AKT）、蛋白激酶B（AKT）以及α-微管蛋白的蛋白水平进行蛋白质印迹分析（每个条件重复((n=3)次）。α-微管蛋白的蛋白水平作为第二个上样对照。（B和C）心肌梗死后14天，每日注射BMP7或生理盐水作为对照的小鼠（((n=8)品系；分别在B和C中分析了总计9318个和4652个心肌细胞），对心脏切片边缘区的（B）ERK与心肌肌钙蛋白I（cTnI）或（C）AKT与心肌肌钙蛋白T（cTnT）进行免疫荧光分析。在组织切片的边缘区手动计数具有核ERK或AKT免疫反应性的心肌细胞；每个点代表一只不同的小鼠（生物学重复），每个小鼠通过分析1至2个切片进行计算。提供了代表性图片；箭头在（B）中指向ERK阳性心肌细胞，在（C）中指向AKT阳性心肌细胞；比例尺，20微米。(D) 用AKT抑制剂（Akt抑制剂VIII 0.5 mM）或ERK抑制剂（PD0325901 0.2 mM）处理新生（出生后第1天，P1）心肌细胞后，添加或不添加10 ng/mL的BMP7处理48小时，对BrdU掺入量的定量分析（(= 8204) 为从31个样本的分析中合并得到的心肌细胞）；心肌细胞通过心肌肌钙蛋白I（cTnI）免疫染色鉴定。附代表性图片；箭头指向增殖的心肌细胞；比例尺为20微米。（E）BMP7信号传导模型触发心肌细胞增殖，显示经典SMAD5以及非经典ERK和AKT的参与。（A）-（D）中的数值以平均值表示（误差线代表均值标准误），统计显著性通过单因素方差分析结合Sidak检验确定于（A）和（D）组（处理组间配对比较），在（B）和（C）组中则采用双侧t检验

讨论

多种有丝分裂原在胚胎发育期间维持心肌细胞的增殖，已有研究探索将其作为恢复这些细胞有丝分裂潜能的策略，而哺乳动物的心肌细胞在出生后早期几乎完全丧失这种潜能。本研究假设，生长因子表达的下降会促使心肌细胞退出细胞周期，从而降低心脏的再生能力。

与我们的假设一致，我们的数据显示，在小鼠出生后早期心脏发育过程中表达水平下降的23个已鉴定的生长因子中，有18个能有效促进新生心肌细胞的增殖。值得注意的是，其中部分生长因子，如 NRG1b、23、24、46 白介素6、49此前有研究报道，IGF2、47、48 以及 sRANKL47、IL1b、50 具有促再生特性。

本研究还鉴定出了其他对心肌细胞具有促增殖作用的生长因子，包括 CXCL17、BMP7、GDF5（BMP14）、LGALS7（GAL7）、CCL3、IL1RA、IL17b、CXCL14、IL10、IGFBP、LGALS3（GAL3）、IL17f 以及 GDNF。尽管 NPPB、CTGF、IL23a、FGF23 和 ARTN 未显著促进心肌细胞增殖，但更高剂量、更长处理时间或与这些因子联合给药，仍可能具有促增殖效果。此外，BMP7 对心肌细胞分裂的诱导作用最强。值得注意的是，本研究表明 BMP7 的内源性产生可维持BMP7 敲低实验证实，新生阶段的心肌细胞会发生增殖。我们的数据还表明，新生心肌细胞中 Bmp7 的表达量远高于其他心脏细胞群。因此，BMP7 似乎是心肌细胞的一种自分泌增殖因子，在哺乳动物出生后的早期阶段，其表达水平会显著下降。

研究表明BMP7在包括心脏在内的多种组织中发挥抗纤维化和抗炎作用炎症作用，包括在心脏组织中。BMP7研究表明，该疗法可在多种模型中减轻心脏纤维化压力超负荷模型、糖尿病心肌病模型以及其他心脏遗传病变和心力衰竭模型。TGF-β促纤维化信号的抑制被确定为BMP7对抗心肌纤维化的机制。在大鼠模型的心肌梗术后给予BMP7已被证实可减小瘢痕面积并改善心脏功能。我们的研究结果表明，BMP7 除了具有抗炎和抗纤维化活性外，还能直接促进心肌细胞再生。

有趣的是，在新生或成年小鼠发生心肌梗死后，BMP7的表达水平并未出现显著变化。这一发现与我们初步筛选的理论依据相符，表明新生哺乳动物心脏的增殖和再生能力至少部分取决于驱动心肌细胞生理性产前增殖的因子，这些因子在新生阶段高度表达，且在心脏损伤后不会进一步上调。值得注意的是，成年斑马鱼可以重新激活其中部分因子（如bmp7a），而成年小鼠则无法做到（本研究中观察到的结果）。这些发现或许能部分解释为何鱼类成年后仍具备再生能力，而小鼠却不能。不过，筛选在再生心脏中上调的生长因子可作为识别其他心脏再生因子的替代策略。

BMP7基因在脊椎动物物种中高度保守。此前在斑马鱼模型中已证实BMP信号通路在心脏再生中的重要性。心脏损伤后会激活Bmp/Smad通路，而抑制Bmp则会阻碍斑马鱼心肌细胞的再生。本研究研究证实Bmp7a是支持斑马鱼心脏再生过程中心肌细胞增殖的内源性因子，且提高bmp7的表达量足以促进心脏再生过程中心肌细胞的细胞周期进展。骨形态发生蛋白（BMP）家族的另一成员BMP14（即生长分化因子5，GDF5），在分析的两个数据集之一中，也显示出小鼠出生后早期表达量下降（见图1A），而给予该因子可增强心肌细胞的细胞周期活性（见图2、图3A及图3B）。有研究报道，心肌梗死（MI）后BMP14表达上调能刺激小鼠模型中心肌细胞的存活，但其在心肌细胞再生过程中的潜在作用尚未得到验证。

值得注意的是，在斑马鱼模型中，bmp2b 在心脏损伤后也会上调，且已有研究证实其过表达能促进斑马鱼心肌细胞的增殖⁵⁷。有趣的是，在小鼠模型中，我们观察到出生后早期 Bmp2 呈下降趋势（见图1A）。已有研究表明，给予 BMP2 可在体外诱导新生鼠心肌细胞增殖，并减少心肌细胞成年小鼠心肌梗死后的细胞凋亡。然而，其潜在作用触发哺乳动物心脏再生的方法仍未被探索。本研究还阐明了BMP7促有丝分裂作用的分子机制，确定了其受体以及下游的经典与非经典信号通路。我们发现，两种I型受体（BMPR1A-ACVR1）和两种II型受体（BMPR2-ACVR2A）在介导BMP7对心肌细胞的促有丝分裂效应中发挥关键作用，提示四聚体可转导BMP7的促有丝分裂信号。下游介导因子包括经典的SMAD5（而非发挥出矛盾相反效应的SMAD1），以及非经典的ERK和AKT通路。ERK在BMP7处理后的心肌细胞中似乎被直接激活，而AKT的激活则呈间接性，且依赖于基质细胞的存在，这一现象仍需进一步研究。

此外，本研究还发现，BMP7 可降低心肌梗死后心脏基质细胞在体外和体内的增殖能力。这一发现与此前报道的 BMP7 对肺成纤维细胞的抗增殖作用一致。鉴于成纤维细胞心肌梗死后，细胞增殖并迁移至受损区域，我们的数据为此前的研究提出了一种额外的机制报道的BMP7在心脏损伤后发挥的抗纤维化作用。

综上所述，本研究支持以下观点：特定心脏生长因子的丰度随时间下降，是导致哺乳动物心肌细胞退出细胞周期以及心脏再生能力丧失的原因。在这些因子中，主要由心肌细胞以自分泌方式产生的骨形态发生蛋白7（BMP7），在体外和体内均是有效诱导哺乳动物心肌细胞增殖的因子。BMP7在斑马鱼模型（该模型中可自然发生心脏再生）中对心肌细胞也具有促再生活性。因此，我们提出将BMP7递送作为触发内源性心肌细胞再生的一种有前景的策略。 

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