标题：Sustained Rhythmic Brain Activity Underlies Visual Motion Perception in Zebrafish

期刊：Cell Reports

原文链接：http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.09.065

摘要

在跟随移动的视觉刺激（条件刺激，CS）后，许多生物在没有物理刺激的情况下会感知到相反方向的错觉运动。这一现象被称为运动后效（MAE）。本研究以运动后效为工具，探究斑马鱼幼体视觉运动感知的神经元基础。以斑马鱼眼球运动作为视觉运动感知的指标，我们发现幼体能够感知运动后效。在呈现条件刺激期间通过光遗传学阻断眼球运动并未影响运动后效，但顶盖切除会显著削弱这一效应。通过对表达GCaMP3的活动幼体进行双光子钙成像，我们发现与运动后效感知相关的方向选择性顶盖神经元在刺激后出现持续的节律性活动。此外，对条件刺激方向敏感的顶盖神经元发生了习惯化，而视网膜神经元并未出现该现象。最终，一个基于方向选择性神经元间竞争的模型复现了运动后效，这表明存在能够产生视觉运动感知的神经元环路。

图形摘要

引言

视觉后效常被视为神经元适应过程为优化感官感知而产生的副产物。典型例子包括运动感知与自主运动之间的校准、通过去相关提升感官编码效率，以及通过增益调控感官刺激以扩展检测的动态范围（Thompson 和 Burr，2009）。因此，视觉后效是研究视觉感知背后神经元机制的有效工具。

视觉后效的一个典型例子是运动后效（MAE），即持续、连贯的运动视觉刺激在停止后，会使人产生相反方向运动的错觉感知。运动后效最早于公元前330年由亚里士多德在其著作《自然诸短篇》（比勒译，1898年）中描述。此后，众多研究阐释了该现象的不同心理物理学特征（乔杜里，1990年；马斯兰，1969年；马瑟等人，1998年；沃尔格穆特，1911年）。除知觉性运动后效外，持续、连贯的运动视觉刺激还可诱发眼动性运动后效（布劳恩等人，2006年；陈等人，2014年；瓦塔马尼乌克和海嫩，2007年）。尽管关于运动后效的文献颇丰，但仅有少数研究探讨了其潜在的神经机制。研究发现，运动后效与方向选择性神经元的反应减弱或增强相关。方向选择性神经元专门负责检测沿视野特定轴的运动，它们对沿特定方向（偏好方向）运动的视觉刺激产生反应，而对沿相反方向（零方向）运动的刺激则无反应或反应较弱。通过单神经元记录技术，研究人员在不同动物物种的多个脑区均发现了与运动后效相关的适应性变化：兔视网膜（巴洛和希尔，1963年）、枭猴颞叶内侧（彼得森等人，1985年）、猫初级视皮层（贾西亚西等人，1993年）、鸽子中脑豆状核（牛等人，2006年）以及果蝇小叶板（斯里尼瓦桑，1993年）。

尽管取得了这些进展，但我们仍缺乏在环路层面上解释运动适应效应（MAE）潜在机制及其神经元关联的全面理论。为此，为阐明视觉运动感知的潜在机制，我们使用了表达基因编码钙指示剂GCaMP3的转基因斑马鱼幼体。我们在完整、未麻醉的行为脊椎动物模型中，利用双光子显微镜监测了不同脑区大型神经元回路的动态变化。

在斑马鱼中，视网膜神经节细胞（RGCs）投射至至少十个分支区域，其中视顶盖（OT）是最大的分支区域（Burrill和Easter，1994；Nevin等人，2010）。视顶盖是斑马鱼最复杂的分层脑结构，对于视觉引导的猎物探测和捕获至关重要（Gahtan等人，2005；Romano等人，2015）。视网膜（Nikolaou等人，2012）和视顶盖（Gabriel等人，2012；Gebhardt等人，2013；Grama和Engert，2012；Hunter等人，2013；Romano等人，2015）中均存在方向选择性神经元。

通过双光子钙成像技术，研究已证实顶盖前核以及视顶盖浅层会对呈献给对侧眼的大范围相干视觉运动产生反应（Portugues 等人，2014）。同样地，对顶盖前核区域进行单侧刺激，可诱发类似于视动反射（OKR）的眼球运动（Kubo 等人，2014）。

本研究表明，在呈现能够诱发视动反射的连贯运动视觉图案（条件刺激，CS）后，斑马鱼幼鱼在无感官刺激的情况下，会产生与条件刺激诱发方向相反的视动运动。这一现象与运动后效应（MAE）相似，说明幼鱼在条件刺激后感知到了反向的视觉运动。通过光遗传学技术在条件刺激呈现期间暂时阻断眼部运动，研究证实肌肉疲劳和眼部本体感受反馈均不参与视动型运动后效应样行为的产生。此外，对顶盖进行双光子激光消融可显著降低该类运动后效应样行为。利用表达GCaMP3的转基因斑马鱼幼鱼进行双光子钙成像，研究人员监测了其两个主要视觉中枢（视网膜和顶盖）的神经元活动。结果发现，刺激停止后，对条件刺激方向敏感的方向选择性神经元在顶盖中表现出显著的习惯化，而在视网膜中未出现该现象。同时，研究人员在特定的方向选择性顶盖神经元群体中观察到与视动型运动后效应样行为相关的持续性节律性神经元活动，这为该类运动后效应样行为的神经元相关机制提供了证据。最后，基于与方向选择性顶盖神经元活动竞争关系构建的经验性数学模型，能够复现视动反射、视动型运动后效应样行为，以及无运动视觉刺激时观察到的非条件性自发眼部运动。综上，本研究结果表明斑马鱼顶盖中存在可实现视觉运动感知的功能性神经元回路。

结果

斑马鱼幼体表现出类似运动后适应效应的行为

为了检测斑马鱼幼体是否能够感知运动后效，我们利用了幼体的眼动反射。眼动反射是当呈现移动的视觉刺激时产生的平滑追踪与快速扫视眼球运动的连续组合。在眼动反射过程中，平滑追踪会跟随刺激方向，使移动的外界环境在视网膜上保持稳定，而扫视则会重置眼球的位置（Huang和Neuhauss，2008）。这种追踪-扫视的眼球运动模式会在整个刺激期间反复出现（图1D）。在缺乏在大范围相干视觉运动的刺激下，斑马鱼幼体会发生自发性眼球转动，该过程由一次快速扫视、一段眼球注视期以及一次反向的二次扫视组成（伊斯特与尼科拉，1997；米里等人，2011）。因此，通过观察眼球转动的运动学特征，可推断幼体是否感知到运动以及运动的方向（奥格等人，2000，2008；奥格与贝尔，2005；钱等人，2005；林纳等人，2005；勒瑟与贝尔，2003）。为验证斑马鱼幼体可产生运动后效这一假设，我们将斑马鱼幼体包埋于低熔点琼脂糖中。琼脂糖凝固后，将幼体转移至圆形腔室中央的升高式载台上。随后向腔室中注入鱼胚胎培养基，并移除眼球周围的琼脂糖以保证其可活动。在此条件下，我们监测受精后7至9天幼体的眼球运动（图1A和图1B），同时在幼体周围的屏幕上投射静止的大范围黑白方波光栅，持续500秒（条件刺激前对照期）。接着，我们以不同速度（17度/秒、26度/秒或59度/秒）、不同时长（50秒、100秒、200秒、250秒、400秒或500秒），并沿两个方向（向左或向右）呈现条件刺激（单向漂移的方波光栅）。条件刺激结束后，移动的光栅停止运动并保持静止500秒（条件刺激后对照期）。为表述清晰，我们将条件刺激的方向定义为其实际运动方向（向左或向右），将运动后效的方向定义为相反方向（即假设产生运动后效时预期的方向）。

在CS刺激前的阶段，斑马鱼幼鱼会产生自发性眼球运动（扫视平均时长为0.12±0.04秒；注视平均时长为20±10秒）。在某些情况下，眼球注视会向向心方向缓慢漂移（图1C）。与这种典型的自发性眼球行为不同，连贯运动刺激（CS）的呈现会诱发强烈的视动反射（OKR）（图1D）。在CS刺激停止后（CS刺激后对照阶段），我们观察到幼鱼出现重复性、单向性的眼球旋转追随-扫视样运动，其方向与CS刺激诱导的方向相反（即运动后效MAE方向；图1D中紫色曲线；视频S1）。人类在经历运动后效时也观察到类似的眼球追随运动（Braun等人，2006年）。因此，我们将这些追随-扫视运动解释为幼鱼感知到与CS方向相反的视觉运动的表现，这与运动后效相似，我们将这种条件性眼球旋转称为视动性运动后效样行为。与人类感知到的运动后效速度低于CS刺激、位移小于CS刺激的特点一致（Masland，1969年；Wohlgemuth，1911年），斑马鱼幼鱼的视动性运动后效样行为表现为眼球追随的旋转速度和幅度均低于CS刺激阶段的水平（图1D；补充实验方法）。为了量化视动性运动后效样行为，我们定义了运动后效指数（图1E和1F；补充实验方法）。该指数表示CS方向与MAE方向的平均追随次数之差与眼球运动总平均次数的比值。若仅观察到MAE方向的追随运动，该指数为1；若仅记录到CS方向的追随运动，指数为-1；而自发性眼球运动（扫视运动或CS与MAE方向追随次数相等的情况）时，指数约为0。（CS和MAE方向）。MAE指标在CS后控制阶段进行计算，连续时长为50秒，总时长为500秒。出于统计目的，我们将控制指标定义为CS前控制阶段的MAE指标。

图1. 斑马鱼幼体感知运动后效。（A）实验装置。将固定在琼脂糖中的幼虫周围的刺激物投射到屏幕上。随后去除幼虫眼睛周围的琼脂糖，通过物镜、镜筒透镜和摄像机从上方记录其眼球转动。（B）眼睛朝向检测。对原始图像进行阈值处理并转换为二值图像以检测眼睛。黄色为眼睛轮廓及拟合椭圆的长、短轴；灰色虚线为外轴。眼睛的朝向以外侧水平轴为基准计算。（C）无视觉刺激时的典型自发眼球转动。某一方向的扫视后会有一段注视期，随后发生反方向的扫视。（D）条件刺激（CS）期间及CS后对照期的眼球转动。可见条件刺激（品红色）引发的追随运动，以及CS后对照期反方向的追随运动（蓝色），这与视动性MAE样行为相似。后者的频率逐渐降低，直至约250秒时恢复典型的自发眼球运动。CS最后200秒内的平均眼球速度为1.50±0.03度/秒，视动性MAE样行为期间的眼球速度为(0.8^{circ} / s pm 0.03^{circ} / s) ((p=1.6 ×10^{-54})（威尔科克森秩和检验）。CS期间的眼球幅度为13.7±0.2，视动性MAE样行为期间的眼球幅度为7.0±0.1 ((p=1.03 ×10^{-4})（威尔科克森秩和检验；(n=40)次实验，来自11只幼虫，CS持续时间为500秒）。（E）CS后对照期前50秒内不同类型运动的比例随CS持续时间的变化（CS持续时间分别为50、100、200、250、300、400和500秒时，分别来自10、9、10、10、10、9和11只幼虫的36、36、39、34、36、34和40次实验）。所有情况下，CS速度均为26度/秒。绿色为MAE方向的追随运动；红色为CS方向的追随运动；蓝色为自发眼球运动；灰色阴影为标准误。（F）CS后对照期内平均MAE指数随时间的变化。曲线根据CS持续时间进行颜色编码（右上角图例）。灰色虚线代表对照指数。星号表示与对照存在显著差异((p <0.01)（克鲁斯卡尔-沃利斯检验），颜色与对应颜色一致。误差棒为标准误。（G）视动性MAE样行为的平均持续时间随CS持续时间的变化。颜色与（F）中CS持续时间的颜色编码一致。对于（F）和（G），CS持续时间为50、100、200、250、300、400和500秒时，分别来自20、19、20、19、19、19和17只幼虫的(n=120) 104、117、110、114、112、97次实验。对照组为(n=14)次实验，来自14只幼虫。误差棒为标准误。

通过对比呈现不同时长条件刺激（CS）的实验中，平均绝对误差（MAE）指数与对照指数之间的统计学显著差异，我们发现视动性类似运动适应后效（MAE）行为的诱导及其持续时间依赖于条件刺激（CS）的时长（图1F）。对于50秒和100秒的条件刺激（CS）时长，平均绝对误差（MAE）指数与对照指数无显著差异（所有区间均为(p>0.05)，采用克鲁斯卡尔-沃利斯检验）。对于持续200秒和250秒的条件刺激（CS），在前100秒内我们观察到了显著差异在CS结束后的对照期。对于持续300秒和400秒的CS，我们在前150秒观察到显著差异（((p<0.05)，Kruskal-Wallis检验）。对于500秒的CS，MAE指数在CS结束后的前300秒显著高于对照指数（(p<0.01)，Kruskal-Wallis检验），且显著高于200至400秒CS诱导的指数（((p<)，P<0.01，Kruskal-Wallis检验）。因此，要诱导视动性类MAE行为，幼虫需接受至少100秒的CS刺激。类MAE行为的持续时间取决于CS时长的进一步增加（图1F和1G）。在使用500秒CS的实验中，85%的实验观察到了视动性类MAE行为（视动性MAE样行为的存在定义为：在条件刺激后对照期的至少前50秒内，MAE指数大于对照指数的95%）。同理，我们发现MAE的时长与条件刺激期间追视次数的习惯化水平呈正相关（图S1D）。

随后我们测试了条件刺激（CS）速度（17/秒、26/秒和59/秒）对视动运动后效样行为诱导的影响。尽管我们观察到在26/秒的CS速度下运动后效指数有增大的趋势，但在三种测试速度的CS后500秒对照期内，运动后效指数未出现显著差异（(p>0.05)，克鲁斯卡尔-沃利斯检验）；不过，它们并未呈现出相同的趋势。这些结果表明，在17/秒至59/秒的范围内，CS速度对视动运动后效样行为的调节并未发挥主要作用（图S1A）。

我们还研究了条件刺激后控制期内不同静态视觉刺激模式的作用。我们测试了三种条件：（1）条件刺激期间呈现的光栅静态版本（白黑方形光栅）；（2）通过打乱第一种条件的像素位置生成的固定噪声图案；（3）黑屏（补充实验流程）。通过运动适应后效指数对动眼样运动适应后效行为进行量化，三种条件间未发现显著差异（(p>0.05)，克鲁斯卡尔-沃利斯检验；图S1B）。因此，我们认为条件刺激后控制期的视觉反馈对于动眼样运动适应后效行为的产生并非必需。与使用其他动物模型得到的结果不同，在这些模型中，感知运动适应后效需要静态视觉图案（Anstis等人，1998；Mather等人，2008），斑马鱼幼体能够在完全黑暗的环境中感知运动适应后效。由于驱动斑马鱼产生运动适应后效无需视觉反馈，运动适应后效是一种在无视觉刺激的情况下也能产生感知的现象，因此它是研究斑马鱼视觉运动感知背后神经元动力学的有效工具。

利用光遗传学阻断眼球运动

为探究运动后负效应（MAE）的潜在机制，我们首先探究了在条件刺激（CS）期间，眼部肌肉疲劳或眼部本体感觉是否是产生视动性类运动后负效应行为所必需的。为此，我们通过光遗传学手段，仅在条件刺激（CS）期间阻断眼球运动。在条件刺激（CS）结束后，我们解除这一抑制作用，以评估视动性类运动后负效应行为的诱导水平。

为通过光遗传学技术阻断眼球运动，我们使用了在整个神经系统中表达盐细菌视紫红质的转基因幼虫（HuC:Gal4；UAS:NpHR（盐细菌视紫红质）-mCherry 品系；补充精神学实验程序；阿伦伯格等人，2009年）。通过连接100毫米光纤的565纳米发光二极管（LED）对卤代视紫红质进行局部激活（图2A；补充实验程序），该光纤单侧放置在菱体5大致上方，此前研究发现，通过光遗传学抑制此处会影响斑马鱼的定向扫视生成（斯库恩海姆等人，2010年）。该位置可能对应外展神经核（马等人，2014年）。

为评估光激活盐视紫红质对条件刺激（CS）期间眼球运动的影响，我们向幼鱼呈现了一种视觉刺激，该刺激由以26度/秒移动的光栅持续呈现300秒组成。在前100秒后开启565纳米发光二极管（LED），并持续100秒。盐视紫红质激活后，眼反射（OKR）被显著抑制，且当刺激LED关闭时，眼反射几乎立即恢复。由于光纤单侧覆盖了菱节5，眼球运动抑制效应呈单向性。该效应完全阻断了从光纤定位点向同侧方向的眼反射，包括扫视和平稳追随运动（即朝向光纤所在侧的眼反射方向；图2C；补充电影S2）。

一旦我们能够通过光遗传学技术有效抑制视动反射（OKR）后，我们便测试了条件刺激（CS）引发的眼球运动对视动性MAE样行为产生的影响。我们监测了350秒的自发眼球运动（CS前对照期）。随后，我们用条件刺激对幼体进行500秒的视觉刺激，同时激活盐细菌视紫红质。当条件刺激停止时，盐细菌视紫红质的激活也随之停止，并额外监测500秒的眼球运动（CS后对照期；图2D）。通过这一实验范式，我们成功消除或显著减弱了视动反射（(p<0.01)，克鲁斯卡尔-沃利斯检验；图2D和2E）。尽管条件刺激期间眼球运动的次数显著减少，我们仍观察到了视动性MAE样行为。视动性MAE样追踪次数与未激活盐细菌视紫红质的实验相比无显著差异（(p>0.05)，克鲁斯卡尔-沃利斯检验；图2E）。这些结果表明，条件刺激期间的眼球肌肉疲劳或眼球本体感觉均对视动性MAE样行为的产生无关键作用。

图2. MAE在感觉大脑区域生成。（A）在MAE的演示文稿期间用于阻止眼球运动的实验装置。眼球运动被记录如图1A所示。为了抑制眼球运动，我们使用转基因幼虫泛神经元表达NpHR和105毫米光纤耦合到安装在显微操作器上的565nm LED。（B）使用（A）中的设置获得的幼虫图像。在所有实验中，纤维被正交和单边地定位在菱形球5上方。黄色圆圈显示照明区。（C）在CS演示文稿期间OKR的光遗传学抑制的示例，眼睛方向作为时间的函数。CS在整个300 s期间被呈现。黄色斑块代表照明期。注意到在晕视紫红质激活时对眼球运动的剧烈和快速抑制。（d）实例表明，在CS的呈现过程中，光遗传学抑制眼球运动并不干扰MAE；在CS期间，眼睛方向作为时间的函数。绿色曲线，前CS；粉红色曲线，CS；蓝色曲线，后CS；黄色斑块，NpHR活化期。（e）CS期间和后CS期间的平均追逐次数，总结所有实验如（d）。粉红色背景，CS期间；紫色背景，后CS控制期间；蓝色条，控制（CS期间LED关闭）；红色条，CS期间LED打开；正值，在CS方向上的追逐；负值，在MAE方向上的追逐。星号标记显著差异((p<0.01)，Kruskal-Wallis；来自9个幼虫的(n=9)试验）。误差条，SE。

运动适应后效体现在尾部运动层面

为了进一步研究感觉和运动系统在类运动后效行为产生中的作用，我们利用了幼虫的另一种稳定行为——视动反应（OMR）。在视动反应过程中，幼虫通过朝着单向连贯运动视觉刺激的方向进行定向尾部偏转来游动（Portugues 和 Engert, 2009）。与平稳跟踪反射（OKR）一样，视动反应能使移动的外部世界在视网膜上保持稳定。相比之下OKR（眼动反射）和OMR（视动反射）涉及的是重新调整尾部运动而非眼球转动。尽管OKR和OMR有着相同的行为目标，但控制这两种行为的运动中枢存在差异。因此，在OMR层面观察到类似MAE（运动适应后效）的行为，表明MAE是在眼球和尾部运动中枢共有的上游脑区中产生的，该区域极有可能是斑马鱼幼体的视觉感觉系统。

为验证这一假设，我们向幼鱼展示了以下实验范式：条件刺激（以每秒26帧的移动光栅持续500秒），随后是条件刺激后对照期（静止光栅持续500秒）。在本实验中，我们移除了眼部和尾部周围的琼脂糖，使幼鱼能够同时表现出眼动反射（OKR）和游动反射（OMR）行为（图2F和2G）。在条件刺激阶段，幼鱼同时表现出眼动反射和尾部运动。然而，尾部运动的频率低于眼球运动（仅有39%±16%的眼球运动伴随尾部运动）。在此期间，74%±13%的条件刺激诱导的尾部偏转朝向条件刺激的方向（图2G和2H）。在条件刺激后对照阶段，我们观察到预期的视动运动后效应样行为，该行为与尾部翻转相关（条件刺激后对照阶段68%±37%的追踪运动伴随尾部翻转）。尾部翻转方向相应反转（73%±13%的尾部偏转朝向条件刺激的反方向；图2G和2H）。这些结果表明，斑马鱼运动后效应样行为的产生涉及感觉脑区，而非眼部的运动回路。

视顶盖的消融会影响运动后效应

视顶盖是斑马鱼幼鱼大脑中最高级的视觉中枢。因此，为了验证视顶盖是否参与MAE样行为的产生，我们研究了顶盖被切除的幼鱼中MAE的诱导情况。为实施切除操作，我们使用双光子显微镜对HuC:GCaMP5幼鱼视顶盖的整个室周层进行了扫描（补充实验方法）。切除操作会引发大量顶盖细胞凋亡（邓恩等人，2016年）。作为细胞损伤的首个迹象，我们观察到GCaMP5荧光出现了显著的相对增强，尤其是在细胞核中（视频S3）。为检测顶盖神经元的凋亡情况，我们用吖啶橙对幼鱼进行了标记，吖啶橙是细胞凋亡的标志物（帕凯等人，2009年）。标记操作要么在切除后立即进行，要么在切除24小时后进行。两种情况下，吖啶橙几乎都标记了整个顶盖，证实了顶盖已被切除（图3A和3B；视频S3；补充实验方法）。

经过24小时的恢复周期，我们测试了顶盖切除幼虫诱导MAE样行为的能力（图3；补充实验步骤）。为了量化顶盖切除对CS诱导的眼球运动以及视动性MAE样行为的影响，我们计算了CS方向与MAE方向追视次数差值的平均值（补充实验步骤）。

完整的幼虫表现出眼动反射，沿条件刺激（CS）进行的追踪次数逐渐减少。这种追踪次数的下降遵循两个时间常数：12秒和195秒（图S5A）。相比之下，对顶盖切除幼虫的追踪次数进行拟合时，仅使用一个时间常数或两个时间常数常数项得出了相似的结果（第二个指数的系数相对于第一个可忽略不计；(ratio =0.2)）。此外，在条件刺激（CS）的最初和最后50秒内，顶盖切除的幼鱼在朝向运动刺激方向的平均追踪次数显著低于完整幼鱼（完整组：14.06；切除组：8.62；(p<0.01)，Kruskal-Wallis检验；图3C）。在条件刺激结束后的最初100秒（条件刺激后阶段），顶盖切除的幼鱼表现出的视动性MAE样平均追踪次数显著更低（完整组：5.11；切除组：2.44；(p<0.01)，Kruskal-Wallis检验；图3C），这表明其视动性MAE样行为有所减弱（((n=)，来自4条幼鱼的26次试验）。顶盖切除大约破坏了85%的顶盖神经元。因此，MAE的减弱而非完全消失，或许可以用无法完全切除视顶盖来解释。

作为对照实验，我们对脚间核（IPN）进行了消融处理。脚间核是一个非感觉处理区域，会向腹侧被盖区（VTA）、中缝核等调节性脑区发出投射。在斑马鱼中，脚间核控制着社交攻击行为（周等人，2016；冈本等人，2012）。脚间核消融既未影响视动反射（OKR）过程中的两个习惯化时间常数（16秒和218秒），也未影响运动后效应（MAE）。不过，我们观察到视动反射过程中的追踪次数总体有所增加（图S1C）。一个潜在假设是，脚间核的消融提高了斑马鱼的唤醒水平或警觉度，从而引发了更强的视动反射反应。

正如此前通过视顶盖神经纤维网中视网膜神经节细胞轴突末梢的消融实验所证实的那样（Roeser 和 Baier，2003），消融大部分顶盖神经元并未消除眼动反射，这表明顶盖在眼动反射的产生过程中并不发挥主要作用。然而，顶盖似乎是对新异刺激产生初始强烈行为反应以及条件刺激诱导的行为习惯化（眼动反射增益降低）所必需的结构。同样，在视顶盖的条件刺激诱导的神经元反应中，存在强烈的新异反应和习惯化效应，而在视网膜中却未观察到该现象（图S2E和S2F）。条件刺激诱导的行为习惯化缺失或许可以解释消融幼鱼中运动后效减弱的现象。因此，我们认为运动后效的产生可能是顶盖对条件刺激产生适应的结果。

图3. 视顶盖的消融会损害MAE的产生。(A) 双光子激光消融后HuC:GCaMP5斑马鱼顶盖的光学平面图像。为便于可视化，展示了单个顶盖半球的消融情况。实验中，两个半球均被消融。可见消融神经元的荧光强度相较于完整半球显著增强。(B) 与(A)条件相同，但在用吖啶橙标记凋亡神经元后进行成像。标记操作在行为学实验结束后立即进行（消融后1天）。(C) 上图：顶盖消融后行为学实验的总结。图表展示了条件刺激（CS）期间和CS后期间的平均追逐次数。粉色背景为CS期；紫色背景为CS后对照期；蓝色柱为对照组（完整的视顶盖）；红色柱为条件刺激的反向刺激；负值为朝向MAE方向的追逐次数（(p<0.05)、(^{*} p<0.01)，Kruskal-Wallis检验；(n=)，来自4条幼鱼的26次试验）。误差棒代表标准误。下图：上图中指定区域（绿色虚线）的放大时间尺度。可见消融幼鱼对条件刺激的初始行为反应微弱，且其类视动MAE行为远弱于完整幼鱼。星号标记显著差异。

条件刺激诱导视顶盖中方向选择性神经元的习惯化

为了检测条件刺激是否诱导顶盖特定神经元产生适应，我们监测了斑马鱼幼鱼两个主要视觉中枢——视网膜和视顶盖的活动。为此，我们对表达基因编码的指示剂 GCaMP3（(Ca^{2+})）的斑马鱼幼鱼进行了双光子钙成像。我们首先将幼鱼固定在低熔点琼脂糖中并使其麻痹（0.3 毫克/毫升溴化潘库罗宁；托克里斯生物科学公司），以避免眼睛发生任何可能的转动。为了检测视网膜和视顶盖中方向选择性神经元对条件刺激诱导的反应是否存在潜在适应（图 S2E 和 S2F），我们采用了包含三个步骤的实验范式：（1）向幼鱼依次呈现两个方向的光移动条形刺激（条件刺激和运动适应后效应方向，每 10 秒呈现一次）；（2）呈现条件刺激，即连续 500 秒呈现同一方向的移动条形刺激；（3）条件刺激后对照组中，我们每10秒以交替方向呈现光动棒，持续时间为500秒（详见补充实验方法）。

第一步确定了神经元的方向选择性（CS方向或MAE方向），并作为CS呈现前其(Ca^{2+})反应幅度的对照。随后将这些幅度与CS后对照期内移动条形刺激所诱导的幅度进行比较。该对比使我们能够测试CS后方向选择性神经元是否发生了潜在的适应。

我们最初将研究重点放在幼虫的视网膜上。为此，我们使用了ath5:Gal4;UAS:GCaMP3转基因品系，该品系几乎仅在视网膜中表达GCaMP3（补充实验方法）。该品系可用于监测视网膜神经节细胞的轴突末梢活动。我们最初将研究重点放在幼虫的视网膜上。为此，我们使用了ath5:Gal4;UAS:GCaMP3转基因品系，该品系几乎仅在视网膜中表达GCaMP3（补充实验方法）。该品系可用于监测视网膜神经节细胞的轴突末梢活动。

为量化条件刺激（CS）呈现后SROI方向反应的可能调节，我们定义了一个适应指数（补充实验程序）。为计算该指数，我们首先计算了条件刺激（CS）呈现前后，方向选择性SROI对CS方向移动条的群体反应比值。随后，将该数值除以针对MAE方向移动条反应计算出的相似比值。该指数的范围为-1至1。负值表示CS方向选择性SROI产生习惯化，正值表示MAE方向选择性SROI产生习惯化，零值表示条件刺激（CS）呈现前后的方向反应无差异。利用该适应指数，我们观察到，仅在条件刺激（CS）呈现后的20秒内，CS方向选择性视网膜神经节细胞（RGCs）的反应相对于零值存在轻微习惯化（(p<0.01)，威尔科克森符号秩检验；图4A、4B；图S2E）。然而，习惯化的动力学过程与视动性MAE样行为的时间尺度（150-200秒；图4B；图S2D）并不匹配。

为了测试视顶盖中方向选择性神经元反应是否受条件刺激（CS）的调节，我们采用了一种类似的方法在泛神经元启动子（HuC；补充实验步骤）下表达GCaMP3的斑马鱼幼虫的实验设计。这种转基因斑马鱼品系能够以单神经元分辨率监测视顶盖室管膜层的一大部分重要区域（每个光学平面有839±38个神经元）。方向选择性神经元约占所监测神经元的14%（对于CS和MAE方向，每个光学平面分别有59±8和55±7个神经元）。与视网膜神经节细胞（RGCs）不同，方向选择性顶盖神经元的适应指数呈现显著更大的负值（(p<0.01)，威尔科克森符号秩检验）考克森符号秩检验；图4A和图4B；图S2F），选择的时间段能更好地匹配视动类MAE行为的时间尺度（150–200秒；图4B；图S2D）。

此外，在视顶盖中方向选择性神经元中观察到的这种习惯化效应，显著大于在方向选择性视网膜神经节细胞（((p<)，p<0.01，威尔科克森秩和检验；图4B）中观察到的习惯化效应。因此，我们认为斑马鱼幼鱼视动类MAE行为主要反映了在CS方向上方向选择性顶盖神经元的习惯化。

图4. 视顶盖中方向选择性神经元的习惯化。（A）方向选择性（DS）神经元群（CS-DS，上方；MAE-DS，下方）活动的总和。（Ai）视网膜神经节细胞（RGC）的投射；（Aii）顶盖神经元。蓝色柱代表CS前和CS后对照期内RGC的反应；红色柱代表CS前和CS后对照期顶盖神经元的反应；粉色箭头表示CS的呈现；灰色斑块表示CS方向的移动条形刺激的呈现时间；黄色斑块表示MAE方向的移动条形刺激。注意到在CS后前100秒内，视顶盖的反应出现习惯化。（B）适应指数（AI）随CS后时期时间的变化。每个点代表以20秒为时间窗计算的AI值。蓝色代表RGC轴突末梢；红色代表顶盖神经元。蓝色和红色星号表示AI值与零（无习惯化）存在显著差异（(p<0.01)，威尔科克森符号秩检验）。黑色星号表示不同AI值（RGC与视顶盖）之间存在显著差异（(p<0.01)，威尔科克森秩和检验）。对于RGC，数据来自6条幼鱼的(n=18)次实验中的741个SROI。对于视顶盖，数据来自6条幼鱼的(n=24)次实验中的688个神经元。误差线代表标准误。

视顶盖中运动适应后效的神经元相关机制

由于视顶盖的消融会影响类MAE行为的产生，且在幼虫的视顶盖而非视网膜中观察到了与MAE相关的神经元习惯化，我们接下来研究了与视动类MAE行为相关的顶盖神经元动态变化。为此，我们采用以下实验流程，在未麻醉、未麻痹的幼虫中对顶盖活动进行成像，同时监测其眼球转动。首先，通过向幼虫依次呈现两个方向的光移动条形刺激，确定方向选择性神经元。根据对这些刺激的反应，我们将成像的神经元群分为三类：非方向选择性神经元、条件刺激（CS）方向的方向选择性神经元以及相反方向（MAE方向）的方向选择性神经元。其次，在条件刺激前的对照期，我们让幼虫在无视觉反馈（黑屏）的状态下进行500秒的自发眼球运动和顶盖神经元活动。第三，在条件刺激期，向幼虫呈现持续移动的条形刺激（沿CS方向或MAE方向），持续时间为500秒。最后，在条件刺激后的对照期，将幼虫置于与条件刺激前对照期相同的条件下（补充实验流程）。

在条件刺激（CS）控制期结束后，我们观察到了显著的视动性运动后效（MAE）样行为（图S2D）。在同一时期，顶盖区的神经动态表现出节律性的同步神经元群体活动。这些同步活动主要出现在对运动后效（MAE）方向敏感的方向选择性神经元之间（图5A）。为了验证运动后效（MAE）方向选择性神经元的同步活动是否与视动性运动后效（MAE）样行为相关，我们将该活动与条件刺激（CS）控制期结束后眼旋转的运动学数据进行了互相关分析（图5B）。为了比较不同实验间的相关性，我们根据95百分位值对眼旋转数据进行了标准化，随后计算了运动后效（MAE）方向选择性神经元总神经活动的平均值（补充实验方法）。接下来，为检验相关性的显著性，我们为神经元活动构建了零模型。结果发现，运动后效（MAE）方向选择性神经元与MAE方向眼追随运动的相关性显著高于零模型的预测（(p<0.01)，克鲁斯卡尔-沃利斯检验；图5B）。条件刺激（CS）方向选择性神经元也观察到了类似现象（((p<)，P<0.01，克鲁斯卡尔-沃利斯检验；图5C）。尽管差异不显著，但运动后效（MAE）方向选择性神经元的相关性仍高于条件刺激（CS）方向选择性神经元。( (p=0.06) , Kruskal-Wallis; 图5D)。为了量化相关水平的差异，我们从空模型相关系数均值上方2个标准差中减去相关系数的峰值（图5D）。

最后，在CS后期间，MAE方向上每次眼动时MAE神经元与CS神经元活性之比的分布整体偏向正值（比值大于0.06和小于0.06的样本中，72%为正值、28%为负值，平均比值分别为30.1和6.4）。因此，我们认为MAE神经元与CS方向选择性神经元群体的活性失衡驱动了眼动的方向。在MAE期间，这种失衡偏向MAE方向选择性神经元（表现为正值；图5E）。

图5. 视顶盖中运动适应后效应的神经相关物

我们利用视动类MAE行为的节律特性以及条件刺激（CS）后时期的群体神经元事件进行了频谱分析。视动类MAE运动的归一化功率谱在基频（0.048 ± 0.008 Hz）及其谐波处显示出显著峰值，数据来自8条斑马鱼幼鱼的(n=9)次实验（图6A；补充实验方法）。随后，我们对三类神经元群体的活动进行了相同类型的频谱分析：非方向选择性神经元、CS方向选择性神经元和MAE方向选择性神经元。在CS后对照期，MAE方向选择性神经元组的归一化功率谱轮廓与视动类MAE行为的轮廓高度匹配，在视动类MAE基频及其谐波附近呈现出显著的高功率值。相比之下，CS方向选择性和非方向选择性神经元组的归一化功率谱更为均匀，对特定频率无偏好（图6A）。

为了量化MAE方向选择性、CS方向选择性和非方向选择性神经元群的同步活动与视动性MAE样行为之间的关联程度，我们针对每个神经元群，测量了其在CS后对照期内活动的归一化功率谱（图6A）。随后，我们针对三个神经元群分别计算了与MAE样OKR显著相关的频带的归一化功率（图6B；补充实验程序）。为了在不同实验间进行比较，我们将各频率的功率通过显著频率下所有神经元的平均功率进行归一化处理。该方法使我们能够比较三个方向选择性神经元的相对功率具体到视动类MAE行为框架内的神经元群。我们观察到，在所有实验中，类MAE方向选择性神经元的功率均显著高于CS方向选择性神经元和非方向选择性神经元。作为对照，我们进行了相同的分析，但针对的是与视动类MAE行为无显著关联的频带（图6B；补充实验步骤）。我们发现，没有任何一个神经元群的功率水平存在显著差异。

图6. 与MAE相关神经元的频率分析及拓扑结构。（A）上图：类MAE行为期间眼球运动的归一化功率谱。下图：类MAE行为期间神经元数据的归一化功率谱。紫色，MAE方向选择性神经元；粉色，CS方向选择性神经元；绿色，非方向选择性神经元；黄色斑块，显著的行为频率与非行为相关频率。CS（归一化功率谱超过设定为零的阈值，灰色虚线）。（B）上图：CS后对照期内行为相关显著频率的归一化平均频率功率。灰色线条为CS、MAE和非方向选择性神经元的单个实验数据；黑色线条为平均功率值。CS方向选择性调制=0.71±0.13分贝，MAE方向选择性调制=0.68±0.11分贝，非方向选择性调制=0.52±0.09分贝（CS和MAE方向选择性神经元的双样本t检验，P<0.05；非方向选择性和MAE方向选择性神经元的Wilcoxon秩和检验，P<0.05；CS和非方向选择性神经元的Wilcoxon秩和检验，P<0.05）。下图：与上图类似，但为非显著频率。CS方向选择性调制=2.3±0.7分贝，MAE方向选择性调制=1.96±0.72分贝，非方向选择性调制=-2.19±0.75分贝（CS和MAE方向选择性神经元的双样本t检验，P<0.05；非方向选择性和MAE方向选择性神经元的Wilcoxon秩和检验，P<0.05；CS和非方向选择性神经元的Wilcoxon秩和检验，P<0.05）。两种情况下，误差棒代表标准误。数据来自8条幼体的共120次实验。（C）CS后时期MAE方向选择性神经元活动的成对相关矩阵。该矩阵按k均值聚类排序。色阶条表示相关程度。（D）上图：按（A）排序的CS后对照期MAE方向选择性神经元的光栅图。中图：钙活性总和。下图：眼球方位。约30%的神经元出现与MAE方向所有眼球追踪相关的同步钙瞬变。（E）MAE方向选择性神经元的拓扑分布。绿色，与MAE方向追踪相关的神经元；红色，非相关神经元。

在类运动适应后时期，所有三类神经元的(Ca^{2+})事件发生率相近（朝向CS方向的选择性神经元：0.08±0.03；朝向运动适应后方向的选择性神经元：0.08±0.04；无方向选择性神经元：0.07±0.03）。因此，在视动性类运动适应后行为期间，不同神经元群体间的功率差异仅与类运动适应后行为相关的频率有关，而非运动适应后方向选择性神经元整体活动增加的直接结果。

通过将顶盖方向选择性神经元的群体活动与眼球旋转运动学相关联（补充实验程序），我们发现了两类神经元：（1）未表现出自发活动的方向选择性神经元与视动性MAE样行为相关的活动，以及（2）在条件刺激后时期与视动性MAE样行为表现出相关活动的方向选择性神经元（眼球运动选择性神经元）。这些方向选择性神经元和眼球运动选择性神经元占方向选择性神经元总群体的26%±0.06%（图S3B）。

最后，我们观察到与类MAE行为相关的同步事件(Ca^{2+})主要源自眼动选择性神经元群体中单个神经元的活动。这些神经元的节律性活动高度相关，并与同步群体事件保持相位锁定（图6C和6D）。这些具有节律性的神经元稀疏地分布在顶盖网络内，未表现出明显的拓扑结构（图6E）。

总体而言，这些结果首次证明了持续性节律活动可作为运动后效的神经元相关物。

一个经验性交叉抑制数学模型复现了类MAE行为的主要特征

长期以来，人们认为两个方向选择性神经元群体之间的竞争是运动后效的基础，但这一点从未得到实验证实。我们的研究结果研究表明，在条件刺激（CS）呈现期间，条件刺激方向选择性神经元的活性高于相反方向的神经元。受条件刺激诱导的习惯化影响，在条件刺激后控制期，条件刺激方向选择性神经元的自发放电活性低于运动适应效应（MAE）方向选择性神经元（图5A；图S3A）。对这两类神经元群体的比较能够定性解释我们所观察到的类运动适应效应。因此，类运动适应效应可能源于顶盖亚回路，该回路会对两种方向选择性神经元群体的活性进行比较，并产生相应的方向运动指令。方向选择性和眼动选择性神经元群体的鉴定为这一假设提供了支持。

为了探究我们的研究结果是否能在该假设框架内得到解释，我们构建了一个经验数学模型。该模型基于一个比较性顶盖子回路，该回路由两个交叉抑制的神经元群体组成：CS比较器和MAE比较器，每个群体均从对应的方向选择性神经元组接收兴奋性输入（图7A；补充实验流程）。这些比较器群体是MAE方向选择性神经元的亚群，其表现出与视动性MAE样行为相关的同步节律活动（图5A和图6A）。该比较器回路计算两者活动之间的差值方向选择性神经元群：每次节律性刺激都会产生一种“胜者通吃”的动态过程，在此过程中两个比较器群体中的一个会以依赖输入的方式主导另一个。

在该模型中，通过向两个对比神经元群体输入幅值相近的周期性信号来实现节律性。这种周期性刺激可源自顶盖的内在节律性活动、顶盖的节律性传入信号，或是与眼球扫视相关的本体感觉输入。我们发现，无法转动眼球的麻痹幼体在条件刺激（CS）终止后，其视觉运动方向选择性（MAE）神经元中未出现自发生节律性活动（图S4）。因此，我们认为神经元的节律性是由眼球运动的神经指令与眼球物理运动所引发的眼球本体感觉之间形成的闭环所产生的。

对该模型的模拟与实验结果相符（图7B、图7C；补充图S5C-S5F）。在条件刺激（CS）出现前，两个比较神经元群体接收的输入相似，因此每个群体以交替的方式获胜（Laing和Chow，2002）。模拟中节律性输入的波动使得这种交替并非完美无缺。在条件刺激（CS）期间，来自条件刺激方向选择性神经元的输入使竞争偏向于条件刺激比较神经元。条件刺激（CS）结束后，未习惯化的运动后效（MAE）方向选择性神经元发出的自发输入略大于已习惯化的条件刺激（CS）方向选择性神经元的自发输入，因此它们产生了偏向于运动后效（MAE）比较神经元的偏置。习惯化现象会逐渐减弱，直至该模型恢复至控制值，回到了条件刺激（CS）出现前的状态。利用从实验数据中获取的参数（行为学和神经元适应时间常数，以及条件刺激方向选择性神经元自发活动频率的均值和峰值；补充实验程序），该模型能够复现神经元及运动适应后效（MAE）样行为的时间动态，以及自发的扫描样眼球运动。运动适应后效（MAE）持续时间对条件刺激（CS）持续时间的依赖性也得到了较好的复现（图7C；图S5C-S5F）。这些结果表明，我们的实验发现足以解释与幼虫运动适应后效（MAE）样行为相关的若干特征。因此，我们认为介导条件刺激（CS）方向选择性神经元与运动适应后效（MAE）方向选择性神经元活动比对的顶盖神经环路，是观察到的运动适应后效（MAE）样行为的合理解释。

图7. 运动适应后效的经验数学模型。(A) 该模型包含四类神经元群体：方向选择性CS神经元（CS-DS）、MAE神经元群体（CPs），以及对应每个方向的两类比较神经元（CS-CP和MAE-CP）。方向选择性群体接收视网膜输入，而比较神经元（CPs）的细胞接收节律性输入。比较神经元从对应的方向选择性群体接收兴奋性输入，从另一类方向选择性群体接收抑制性输入，且彼此间存在交叉抑制。(B) 一次典型计算机模拟中四类群体的输入电流和放电率。在300–800秒的时间段内，CS-DS细胞接收到CS视网膜输入。在CS刺激期间，CS-DS群体的放电率上升并表现出显著的适应现象。然而在CS刺激结束时，CS-DS群体的放电率低于其自发活动时的水平。因此，尽管两类比较神经元接收的节律性输入相当，但CS-CP主要在CS刺激期间放电，而MAE-CP则在MAE刺激期间放电更多。(C) 作为CS刺激持续时间函数的MAE持续时间模型。MAE持续时间被定义为MAE指数显著高于对照指数的时间段（图S5F）。为便于对比，黄色曲线展示了行为实验数据的结果（图1F）。

讨论

先前的研究已在多种生物体中发现了运动适应后效应（MAE）或类运动适应后效应的行为（巴洛和希尔，1963；贾斯基等人，1993；马瑟等人，1998；牛等人，2006；彼得森等人，1985；斯里尼瓦桑，1993；沃尔格穆特，1911）。本研究首次报道斑马鱼在幼体早期发育阶段可感知运动适应后效应。因此，在发育中的神经元回路中诱导运动适应后效应的能力，支持了运动适应后效应是大脑视觉运动检测基本计算原理不可避免的结果这一假说。

与人类不同，斑马鱼幼鱼在没有任何视觉反馈（处于黑暗环境）的情况下也能感知运动后效，这表明运动后效仅反映视觉运动感知，不涉及视觉检测，且视觉运动感知可仅由神经元回路的自发动力学产生。这种差异可能源于与运动后效相关的大脑皮层区域的额外适应性（例如初级视皮层和中间颞叶区；科恩与莫夫尚，2003；瓦塔马尼乌克与海因，2007）。这些皮层回路可能是进化而来的，用于减少持续视觉运动后出现的不良运动感知或眼震后效应。

与以往研究（久保等人，2014；勒瑟与拜尔，2003）相似，我们发现视顶盖并非产生视动反射所必需的结构。然而，顶盖切除术会阻碍动物对条件刺激的行为习惯化（这一点通过视动反射的习惯化得到证实），并影响类似运动后效应行为的产生。此外，鉴于运动后效应的产生并不依赖眼球运动，且在视动反射的框架内观察到了类似视动的运动后效应行为，我们推测运动后效应的产生可能与感觉脑区相关，而非运动中枢。

通过对表达GCaMP3的幼虫进行双光子钙成像，我们观察到MAE样行为与对条件刺激方向敏感的顶盖神经元的习惯化相关，而这种习惯化并非从视网膜传递而来。因此，我们认为视顶盖对于眼震反射的产生并非必需，但对于初始强烈的新奇反应及其后续的习惯化不可或缺。眼震反射的顶盖调节可通过之间的循环投射实现视顶盖和顶盖前核（Vanegas等人，1984）。已有研究表明，后者对于视动反射的产生既是必要的也是充分的（Kubo等人，2014）。此外，我们通过同时监测清醒完整幼虫的眼球运动和视顶盖神经元动态，发现了一组特定的运动适应方向选择性神经元亚群，其同步节律活动与视动性运动适应样行为相关。

我们构建了一个经验数学模型，其中顶盖方向选择性神经元的习惯化会导致MAE方向选择性和CS方向选择性神经元回路的自发放电活动之间出现失衡。随后，顶盖回路比较器会计算这一失衡，并由此产生眼部和尾部的定向运动指令。该模型能够复现MAE的行为学和神经元回路动力学特征，同时也能复现自发放眼运动的运动学特征。

该模型提出了一种简单的功能性神经元回路，能够在斑马鱼中产生视觉运动感知。更具体地说，我们认为，至少在运动适应后效（MAE）的情境下，运动感知源于方向选择性顶盖神经元驱动顶盖比较器回路的能力。最后，神经元的持续活动传统上与持续数十秒的工作记忆过程相关（Quintana 和 Fuster，1999；Romo 等人，1999；Sumbre 等人，2008）。本研究发现，视觉诱导的持续节律性活动也可能是感知神经元过程的基础，例如持续时间前所未有的（数百秒）视觉运动感知。我们的实证模型揭示了运动后效感知背后这些持续活动产生的潜在神经环路机制。

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