标题：Circadian clock1a coordinates neutrophil recruitment via nfe212a/duox-reactive oxygen species pathway in zebrafish

期刊：Cell Reports

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113179

摘要

中性粒细胞向炎症部位募集似乎是一种进化上保守的对抗外源损伤的策略。然而，中性粒细胞迁移在24小时时间尺度上的节律特征及其潜在机制尚不清楚。本研究利用斑马鱼活体成像技术的优势，探究了生物钟基因clock1a如何动态调控中性粒细胞对炎症刺激的节律性募集。我们构建了clock1a突变体，发现尾鳍损伤和脂多糖（LPS）注射后中性粒细胞的迁移显著增强。转录组测序、染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告实验表明，clock1a基因通过协调nfe212a和duox基因的节律性表达来调控活性氧（ROS）水平，进而调节中性粒细胞迁移。本研究最终提供了一个直观模型，从活性氧的角度拓展了对昼行性生物中中性粒细胞募集在昼夜节律时间尺度下节律机制的理解。

图形摘要

引言

昼夜节律计时系统是一种内源性机制，能使生物体预测日常环境的变化，协调各类生理活动与行为周期，从而更好地生存。在哺乳动物体内，视交叉上核中的主时钟会协调并同步大多数外周组织及器官级振荡器。碱性螺旋-环-螺旋-过氧化物酶体增殖物激活受体受体（bHLH-PAS）家族蛋白CLOCK与BMAL1在细胞核内形成异二聚体，通过被称为E盒的顺式作用元件驱动周期基因和隐花色素基因的转录。周期蛋白与隐花色素蛋白形成另一异二聚体后，会进入细胞核并发生相互作用与CLOCK-BMAL1复合物结合以抑制其表达。此外，被称为REV-ERBs和RORs的核激素受体通过竞争性结合启动子区域中的RORE基序来抑制或激活Bmal1基因的转录，这构成了生物钟中的另一个反馈回路节律。

越来越多的研究表明，生物钟在多种免疫过程中发挥调控作用。几乎所有淋巴器官和免疫细胞（包括外周血单个核细胞和自然杀伤（NK）细胞）均表现出生物钟基因的节律性表达，这些基因可调控免疫细胞的功能，以适应生理环境随昼夜变化产生的差异。细胞因子的分泌等免疫细胞在脂多糖（LPS）刺激下产生的肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）在不同昼夜时间点表现出明显的节律性，而这种节律性在Cryptochrome 1/2（Cry1/2）突变体和脑和肌肉芳香烃受体核转运蛋白样蛋白1（Bmal1）基因敲除小鼠中常被破坏。此外，炎症相关疾病的发生也表明昼夜节律在免疫反应中发挥着重要作用。中性粒细胞约占人体循环白细胞的40%至60%，是先天免疫系统抵御外界入侵的首批细胞防御者。尽管众多免疫学研究已揭示了不同炎症模型中中性粒细胞迁移的传统调控机制，但中性粒细胞在24小时时间尺度上的节律特征及其潜在机制仍鲜为人知，尤其是在昼行性动物中。阐明中性粒细胞炎症的节律规律，无疑将为中性粒细胞募集异常相关疾病提供治疗思路。多项研究表明，在稳态状态下，中性粒细胞会向肺等多种未致敏组织进行转运和浸润在小鼠体内，肝脏也遵循昼夜节律模式。然而，在在炎症刺激下，中性粒细胞的动态节律行为也值得进一步研究。在斑马鱼中，研究表明机体对细菌感染的先天免疫反应受光照调控。然而，时钟蛋白在中性粒细胞向炎症信号募集过程中的作用及其潜在机制尚未得到充分阐明。

斑马鱼已成为研究先天免疫的理想模型，这是因为其胚胎具有光学透明性，能够在体内单细胞水平对荧光蛋白进行实时成像观察。作为昼行性动物，斑马鱼的生物钟机制与哺乳动物高度保守，因此也成为研究生物钟的理想对象。本研究充分利用斑马鱼的体内成像技术，探究昼夜节律蛋白Clock1a在中性粒细胞节律募集过程中的作用。鉴于活性氧（ROS）是斑马鱼中性粒细胞早期募集的重要趋化信号，本研究还从活性氧的角度进一步阐明了Clock1a调控中性粒细胞募集的分子机制。通过CRISPR-Cas9技术构建的clock1a突变体斑马鱼，对其中性粒细胞募集过程的体内成像研究发现，clock1a能够增强中性粒细胞的节律性迁移。本研究进一步证实，Clock1a蛋白可通过结合nfe212a启动子区域的E-box元件，直接促进nfe212a基因的表达，进而诱导活性氧的产生，最终推动中性粒细胞的迁移。本研究的可视化模型揭示了活性氧介导昼夜节律蛋白Clock1a调控斑马鱼中性粒细胞募集的潜在分子机制。

结果

昼夜节律紊乱消除了中性粒细胞向损伤部位的节律性募集

研究表明，斑马鱼胚胎需要5-6个明暗周期才能建立稳定的节律。为研究生物钟对中性粒细胞募集至组织炎症部位的影响，我们通过将胚胎持续置于光暗（LD；14小时:10小时）、持续黑暗（DD）和持续光照（LL）条件下饲养4天，构建了斑马鱼昼夜节律紊乱模型（图1A）。结果显示，在LL和DD条件下饲养的幼鱼中，clock1a、bmal1b、cry1ba和per1b基因的节律性表达受到显著干扰（图1B、1C），表现为振幅减弱。行为学实验表明，与LD条件相比，LL和DD饲养条件下幼鱼运动活性的峰值和谷值消失，意味着运动活性的节律性被打破（图1D-1F）。这些数据表明，在DD和LL条件下饲养的斑马鱼，其生物钟完全紊乱。随后，我们利用中性粒细胞标记的转基因品系Tg(lyz:EGFP)发现，节律异常的斑马鱼在受伤后3小时和6小时（hpw），中性粒细胞向受损尾鳍的迁移发生了显著改变（图1G-1I、图S1A和图S1B）；并且在持续黑暗（DD）和持续光照（LL）条件下，中性粒细胞迁移在授时时间（ZT）1和ZT15时无节律性（图S1C）。然而，当幼鱼随后在光暗周期（LD）条件下饲养5天后，中性粒细胞迁移的节律性重新出现（图S1C）。同时，LL和DD环境下斑马鱼体内荧光中性粒细胞的总数无显著差异（图1J和图K），表明尾鳍中中性粒细胞的增多主要由迁移能力的改变所致。综合来看，这些结果说明昼夜节律参与调控斑马鱼中性粒细胞的迁移过程。

图1. 昼夜节律紊乱使中性粒细胞向受损组织的募集增多

clock1a突变斑马鱼的构建与鉴定

为进一步探究昼夜节律调控中性粒细胞迁移的分子机制，我们选择构建clock1a基因突变的斑马鱼。利用“SeqBuilder”软件，我们在第六外显子中设计了CRISPR-Cas9靶向位点，该位点包含BslI酶切位点，可用于突变体的后续鉴定（图S2A）。体外合成Cas9-mRNA和sgRNA，并将二者共同显微注射至单细胞胚胎中（图S2B）。为评估突变效果，使用引物（表1）从基因组DNA中扩增出400 bp的DNA片段，并用BslI限制性内切酶进行酶切。凝胶电泳结果显示，(F_{2})斑马鱼胚胎为遗传纯合突变体（图S2C）。此外，测序结果表明，(F_{2})斑马鱼的clock1a基因发生了5个碱基的缺失（图S2D、S2E）。生物信息学分析显示，(F_{2})斑马鱼Clock1a蛋白的功能结构域序列（HLH-PAS-PAS）发生了移码突变（图S2F）。结果还表明，在clock1a突变斑马鱼中，clock1a的mRNA表达水平（图S2G）以及Clock蛋白的表达量均显著降低（图S2H、S2I）。斑马鱼clock1a基因突变后，Clock抗体识别的蛋白可能为Clock1b。综上，我们成功获得了clock1a突变斑马鱼品系。

为了确定 clock1a 基因突变是否影响幼斑马鱼的生理功能，我们评估了相关指标受精后96小时内（hpf）幼鱼的心率、摆尾频率、体长、存活率和运动活性。结果显示，与野生型组相比，clock1a基因突变对斑马鱼幼鱼的摆尾频率（30 hpf）（图S3A）、心率（48和72 hpf）（图S3B和S3C）及体长（96 hpf）（图S3D）均无显著影响。体视显微镜下观察发现，突变鱼的整体形态与对照组无显著差异（图S3E）。clock1a基因突变使胚胎发育至96小时的自然存活率略有下降（图S3F）。此外，我们还借助行为监测仪开展了光运动反应（PMR）实验，以检测突变幼鱼对光刺激的短期反应。与对照组相比，clock基因突变导致斑马鱼幼鱼的活性降低，尤其是在黑暗阶段（图S3G-S3J）。上述结果表明，clock1a基因突变对斑马鱼幼鱼的各项生理功能存在不同影响。

Clock1a 在斑马鱼生物钟中发挥作用

尽管已有研究表明 clock1 在哺乳动物的生物钟中发挥关键作用，27 但关于斑马鱼中的 clock1a 却鲜为人知。为研究 clock1a 在昼夜节律振荡中的作用，我们首先通过定量聚合酶链式反应（qPCR）检测了 clock1a 突变斑马鱼核心昼夜节律基因的表达情况。结果显示，在持续黑暗（DD）和光暗交替（LD）条件下，per1b、per2 和 cry1ba 的表达均被下调，而 clock1a 突变体中 bmal1b 的表达则被上调（图2A和图2B）；clock1b 和 clock2 的表达未发生显著变化。clock1a突变体（图S4A-S4D）。为确定clock1a中的突变是否影响运动节律，我们在光暗（LD）和全暗（DD）条件下进行了行为分析。在光暗条件下，clock1a突变体幼鱼的运动活性显著低于野生型（WT）/AB品系幼鱼（图2C-2F）。在全暗条件下，clock1a突变体斑马鱼的运动活性周期缩短（图2G、2H）、相位提前（图2I）且振幅降低（图2J）。这些结果表明，clock1a突变会在不同层面影响斑马鱼的昼夜节律。

图2. Clock1a 参与斑马鱼生物钟的调控。（A和B）斑马鱼胚胎在光暗（LD）条件下连续培养4天，随后在5天胚胎期（5 dpf）于光暗（LD）和全暗（DD）条件下进行测试。在光暗（LD）和全暗（DD）条件下，每隔4小时从野生型（WT）和clock1a突变体幼体中提取总RNA，持续24小时。实时荧光定量PCR（qPCR）分析显示，clock1a突变体鱼中核心生物钟基因per1b、per2和cry1aa的表达振幅降低，而在全暗（DD）和光暗（LD）两种条件下，bma1b基因的表达振幅均升高。本实验设置三个样本，每个样本包含50条幼体。基因表达量以β-肌动蛋白（β-actin）为参照进行标准化。采用JTK-CYCLE方法分析mRNA表达的节律性，通过双因素方差分析（two-way ANOVA）分析不同组间的差异。（C和G）从5天胚胎期（5 dpf）开始，在光暗（LD）和全暗（DD）条件下检测clock1a突变体和野生型（WT）幼体的运动活性（<uuid:((n=24)>，每组）；（D–F）在光暗（LD）条件下，clock1a突变体幼体24小时内的平均运动速度显著降低，其中（E）白天的运动速度显著下降，（F）夜间则无显著差异。数据采用非配对t检验分析。（H–J）在全暗（DD）条件下，clock1a突变体幼体的（H）运动周期和（J）运动振幅降低，（I）生物钟相位提前。数据采用非配对t检验分析。所有实验均重复三次，结果展示为单次独立实验的数据。柱状图表示均值±<uuid:(('p < 0.05;)> <uuid:(^{*} p<0.01)>：<uuid:(^{* *} p<0.001)>。

Clock1a 调控中性粒细胞向炎症组织的节律性迁移

为监测clock1a突变斑马鱼中中性粒细胞的迁移情况，我们将转基因Tg(lyz:EGFP)斑马鱼与clock1a突变斑马鱼杂交两代，获得了Tg(lyz:EGFP);(clock1a)品系（图3A）。clock1a突变斑马鱼全身荧光标记的中性粒细胞总数无显著变化（图3B、3C）。随后，我们在ZT1（开灯后1小时）和ZT15（关灯后1小时）对受精后5天（dpf）的斑马鱼进行尾鳍损伤处理，并在损伤后3、6和24小时（hpw）观察中性粒细胞向尾鳍的迁移情况（图3D）。结果显示，在ZT1和ZT15时间点，clock1a突变斑马鱼在损伤后3和6小时迁移至尾鳍损伤部位的中性粒细胞数量显著增加（图3E、3F、图S4E、图S4F），而24小时时中性粒细胞的反向迁移在clock1a突变体中未受影响（图S4G、图S4H）。此外，我们向斑马鱼体内注射了脂多糖（LPS）在ZT1和ZT15时间点对斑马鱼幼虫的听囊进行处理，并在感染后3小时（hpi）观察中性粒细胞向听囊的迁移情况（图3G）。结果显示，在ZT1和ZT15时间点，与野生型/AB斑马鱼相比，clock1a突变体斑马鱼中迁移至听囊的中性粒细胞数量显著增加（图3H和图3I）。我们还发现，clock1a突变体感染金黄色葡萄球菌后的存活率与野生型组无显著差异（图ure S4I）。此外，在ZT1和ZT15时向斑马鱼耳囊注射脂多糖（LPS），并在3小时后检测细胞因子的表达。结果表明，在基础水平（未注射脂多糖）下，clock1a突变体中(tnf-a)、il-1b、il-6和cxcl8a的水平在ZT1和ZT15时均显著高于野生型/AB型斑马鱼（图3J-3M）。在脂多糖诱导组中，与野生型/AB型斑马鱼相比，clock1a突变体斑马鱼中(tnf- alpha)、il-1b、il-6和cxcl8a的表达也在ZT1和ZT15时显著上调（图3J-3M）。综上，这些结果表明clock1a突变增强了中性粒细胞向炎症部位的节律性迁移，并提高了细胞因子水平。

图3. Clock1a 调控中性粒细胞向炎症组织的节律性迁移。(A) 对转基因品系 Tg(lyz:EGFP) 和 clock1a 突变体进行连续两代杂交，以获得 Tg((Tg| yz:EGFP);clock1a)) 品系。(B 和 C) 野生型和 (clock1a) 幼虫中荧光标记的中性粒细胞总数无显著差异（每组 n=(= 15)）。比例尺：50 微米。数据采用非配对 t 检验分析。(D) 幼虫（5 dpf）尾鳍损伤示意图，于ZT1和ZT15时在脊髓末端使用手术刀片进行损伤。(E和F) 在野生型斑马鱼中，中性粒细胞向损伤部位的迁移具有节律性，而Tg(lyz:EGFP);clock1a⁻/⁻幼虫在ZT1和ZT15时中性粒细胞迁移均增加((n = 25)，每组)。比例尺：5微米。数据采用单因素方差分析进行分析。(G) 体内于ZT1和ZT15时向耳囊微注射LPS的示意图。(H和I) 在野生型斑马鱼中，中性粒细胞向LPS的迁移具有节律性，而Tg(lyz:EGFP);clock1a⁻/⁻幼虫在ZT1和ZT15时中性粒细胞迁移均增加(((n = 25)，每组)。比例尺：5微米。数据采用单因素方差分析进行分析。比例尺：4微米。(J–M) 在稳态条件下，细胞因子tnf-α、il-1β、il-6和cxcl8a的mRNA表达具有昼夜节律，且clock1a突变显著上调其表达。在LPS刺激下，细胞因子tnf-α、il-1β、il-6和cxcl8a的表达仍具有昼夜节律，clock1a突变同样显著上调其表达。数据采用单因素方差分析进行分析。所有实验均重复三次，结果展示的是单次独立实验的数据。柱状图代表平均值±((^{circ} p<0.05)、(^{*} p<0.01)；(^{* *} p<0.001))。

Clock1a调控与活性氧产生相关的基因

为探究clock1a基因对中性粒细胞迁移的影响，本研究采用5天龄（dpf）的clock1a突变体斑马鱼及野生型/AB品系斑马鱼，在光暗（LD）条件下饲养后进行高通量RNA测序。转录组分析显示，野生型/AB斑马鱼中存在372种独特RNA，clock1a突变体斑马鱼中则有181种独特RNA（图4A）。热图和火山图展示了clock1a突变体斑马鱼中下调与上调基因的整体分布情况（图4B、4C）。此外，基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果表明，clock1a突变体中参与氧化酶活性、DNA修复及细胞分裂相关过程的基因发生显著变化（图4D、4E）。研究人员通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）对测序结果进行验证，发现clock1a突变体中多个与活性氧（ROS）生成相关的基因（如duox、mfn2、cyp11a1、cyp2x8和alas2）呈上调表达，而nfe212a基因则下调表达（图4F）。进一步研究发现，在ZT1和ZT15两个时间点，clock1a突变体中活性氧的节律性水平均显著升高（图4G-4I）。研究人员通过体外转录合成clock1a信使核糖核酸（mRNA）并将其注射到胚胎中，以回补突变体中clock1a基因的表达（图S5A、S5B），结果显示该操作可显著降低clock1a突变体中活性氧的水平（图S5C、S5D）。上述结果表明，clock1a基因突变会影响斑马鱼中nfe212a基因的表达及活性氧的水平。

图4. Clock1a调节与活性氧产生相关的基因

斑马鱼nfe212a和duox基因受Clock1a的节律调控

转录因子Nrf2（Nfe2）被认为是细胞对抗氧化应激防御的核心调控因子28,29，但其昼夜表达规律却鲜为人知。本研究在光暗（LD）条件下连续两天通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测了nfe212a mRNA的节律性表达。研究发现，在光暗（LD）条件（图5A）和持续黑暗（DD）条件（图5B）下，nfe212a均呈节律性表达，且在开灯时达到表达峰值；同时，per1b、per2和clock1a基因的突变会显著降低nfe212a在光暗和持续黑暗条件下的表达水平（图5C-5E和图S5E）。这些结果表明，斑马鱼中nfe212a的表达可能受生物钟的调控。随后，我们进一步探究Clock蛋白是否直接作用于nfe212a基因的转录调控区域。生物信息学分析显示斑马鱼nfe212a启动子区域存在一个E-box序列（图S5G），提示nfe212a的表达可能受该顺式调控元件调控。为此，我们构建了clock1a-Myc质粒，用于在胚胎中进行染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR实验（图5F），并通过蛋白质印迹实验利用Myc抗体验证了其表达情况（图S5H）。ChIP-qPCR结果显示，Clock1a蛋白能够以浓度依赖的方式结合nfe212a启动子中的E-box序列（图5G、5H）。此外，我们利用Clock抗体证实，Clock蛋白可在ZT1和ZT15时间点内源性结合nfe212a的E-box元件（图5I）。随后，我们开展双荧光素酶报告实验，以评估昼夜节律钟蛋白对nfe212a启动子活性的影响。克隆包含nfe212a E-box序列和突变型E-box序列的DNA片段，将其插入pGL启动子载体中，并共转染至HEK 293T细胞（图5J）。结果表明，nfe212a E-box相关的荧光素酶活性可被Clock1a-Bmal1b复合物激活，而被生物钟中的负调控因子Cry1aa抑制（图5K）。此外，当nfe212a的E-box序列“CACGTG”突变为“CCCGTC”时，该E-box相关的荧光素酶活性受到抑制（图5K）。

随后，我们进一步连续两天评估了duox的表达情况。结果显示，duox基因在长日照（LD）条件（图5L）和持续黑暗（DD）条件（图5M）下均呈现节律性表达，其波形大致与nfe212a的节律相反。在LD和DD条件下，per1b基因的突变显著降低了duox基因的表达，而clock1a基因的突变则显著提高了duox的表达水平（图5N-5P及图S5F）。与预期一致，我们发现补充nfe212a信使核糖核酸（mRNA）可部分降低clock1a突变斑马鱼中duox的昼夜表达（图5P）。综上，这些结果表明Clock1a通过启动子中的E-box元件直接激活nfe212a基因，进而负调控其下游duox基因的表达。

图5. 斑马鱼nfe212a和duox基因受Clock1a的节律调控

活性氧介导Clock1a对中性粒细胞向炎症部位迁移的调控

为探究 clock1a 是否通过活性氧（ROS）介导的方式影响中性粒细胞的迁移，我们尝试构建双氧化酶（duox）突变体以降低活性氧水平。我们在斑马鱼双氧化酶基因的第五外显子处设计了成簇规律间隔短回文重复序列-CRISIPR相关蛋白9（CRISPR-Cas9）靶向位点，该位点包含BamH1限制性内切酶位点，可用于突变体的进一步鉴定（图S6A）。我们将体外合成的Cas9信使核糖核酸（mRNA）显微共注射到单细胞胚胎中结合duox sgRNA（图S6B）。从(F_{2})斑马鱼基因组DNA中通过PCR扩增出约500bp的DNA片段，并用BamH1限制性内切酶进行酶切。凝胶电泳结果显示，(F_{2})斑马鱼为遗传纯合突变体（图S6C），代表性DNA测序结果表明，(F_{2})斑马鱼的duox基因存在1个碱基缺失（图S6D和S6E）。此外，生物信息学分析显示，duox突变品系的功能域序列发生移码突变（图S6F）。同时，结果表明突变体斑马鱼中duox mRNA的表达水平显著降低（图S6G）。我们还检测了duox突变体中的过氧化氢和活性氧水平，发现duox突变体的过氧化氢浓度和活性氧水平显著低于WT/AB（图S7A–S7C）。综上，本研究成功构建了duox敲除斑马鱼，该突变体可减少活性氧的产生。

随后，我们探究了活性氧（ROS）在clock1a突变斑马鱼中性粒细胞节律性募集过程中的作用。使用小分子DPI抑制clock1a突变体中的ROS水平后（图6A和6B），我们发现，在ZT1和ZT15两个时间点，clock1a突变体中性粒细胞向鳍部损伤处的迁移均有所减少（图6C和6D）。这一结果通过耳泡的脂多糖（LPS）诱导炎症模型得到了验证。在DPI处理下，ZT1和ZT15时clock1a突变体中迁移至耳泡的中性粒细胞数量显著低于未添加DPI的组别（图6E和6F）。此外，在duox突变体中，我们再次利用鳍部损伤和LPS诱导炎症模型验证了ROS在中性粒细胞迁移中的作用。与clock1a突变体相比，中性粒细胞迁尾鳍和耳泡中的中性粒细胞迁移均显著/在(clock1a ^{-1-} ;duox ^{-1-})菌株中，其水平降至野生型（WT）水平左右（图6G-6I）。同样，用DPI处理的clock1a突变体以及clock1 (a^{-1-} ; duox ^{-1-})突变体中，tnf-α、il-1b、il-6和cxcl8a的水平在ZT1和ZT15时显著下调（图6J和图S7D-S7G）。综上，研究结果表明活性氧（ROS）参与了Clock1a对斑马鱼中性粒细胞节律性迁移的调控。

讨论

昼夜节律时钟计时是一种内源性机制，可协调免疫细胞为周围环境的日常变化做好准备并作出反应。中性粒细胞向炎症部位的募集是先天免疫防御过程中的重要步骤生物体内的外来侵袭。理解中性粒细胞炎症的昼夜节律调控对基础研究和临床研究均具有重要意义。与以往主要聚焦巨噬细胞10、T细胞30、树突状细胞31等免疫细胞节律性的研究相比，关于中性粒细胞节律行为的研究相对较少，尤其是在昼行性动物中。本研究借助光学成像技术，揭示了clock1a在中性粒细胞向炎症部位节律性募集过程中的作用，并阐明了活性氧（ROS）在斑马鱼该过程中可能发挥的作用。

许多研究表明，在稳定状态下，小鼠骨髓（BM）和骨骼肌中的组成性中性粒细胞贩运在夜间（激活阶段）随昼夜节律峰值而波动。32中性粒细胞渗入小鼠肝脏的方式也time-of-day-dependent，在轻相（静息阶段）达到峰值。15在这项研究中，我们发现中性粒细胞向受伤组织的迁移/LPS挑战表现出有节奏的波动，在静息阶段达到峰值，并且连续LD治疗的昼夜节律中断消除了斑马鱼中中性粒细胞的有节奏迁移。值得注意的是，以前在小鼠中的一项研究通常假设在稳态中，白细胞的贩运在活跃阶段更加活跃，33而在斑马鱼中的这项研究和以前在小鼠肝脏中的一项研究15表明，中性粒细胞分别在炎症挑战和稳态下的静息阶段具有更强的迁移能力。这暗示不同的实验动物/模型可能有自己的调节免疫系统的昼夜节律机制。然而，需要在不同的动物中进行更广泛的研究来阐明这种生物现象。

使用CRISPR-Cas9技术，我们在斑马鱼中生成了clock1a突变体，并发现在尾鳍损伤和LPS诱导的炎症模型中，clock1a突变体中的中性粒细胞在ZT1（开灯后1小时）和ZT15（关灯后1小时）的节律迁移都显着增加。与之前对小鼠中性粒细胞的研究不同，在小鼠中，昼夜节律蛋白Bmal1的敲除废除了中性粒细胞对炎症刺激的节律，34在斑马鱼中，clock1a突变只增加了中性粒细胞迁移，但没有消除它们的节律。在这里，我们假设，由于在进化过程中基因组重复导致斑马鱼中昼夜节律基因的亚型较多，因此仅clock1a的突变并没有显着扰乱斑马鱼的昼夜节律。这可以通过clock1a突变仅改变1b、per2、cry1ba和bmal1b的表达但不会扰乱其节律表达的证据来证明。

在生物体中，通过呼吸爆发机制产生大量ROSs，是早期中性粒细胞募集的重要趋化信号，抑制duox基因功能显著减少中性粒细胞迁移在斑马鱼中。先前的研究表明ROS水平在植物的昼夜节律条件下表现出一天中的一个时间阶段和老鼠。我们的研究表明活性氧水平斑马鱼夜间高，清晨低。这可能是由于活性氧在活跃状态下持续生产和积累到深夜，而活性氧在休息状态下清除后苏醒时水平下降。我们还发现，在clock1a突变体中活性氧水平有节奏地增加，这与(clock1a)斑马鱼中迁移的中性粒细胞数量正相关，并证实Clock1a可以作用于nfe212a启动子中的E-box元素并促进其节奏表达，这与之前对Baml1基因敲除老鼠的研究相似。

我们一起在斑马鱼中发现核心分子时钟成分Clock1a通过nfe212a/duox调节抗氧化反应，从而调节中性粒细胞的节律招募行为。因此，我们在斑马鱼中应用了一个体内可视化模型，该模型将昼夜节律、活性氧和中性粒细胞招募联系起来。使用各种动物模型理解昼夜节律对中性粒细胞炎症的影响将拓宽对这一领域的理解，并为揭示昼夜节律门控中性粒细胞疾病治疗中的时间疗法提供理论基础。

研究的局限性

尽管我们已通过Clock1a-Myc融合蛋白证实外源性Clock1a可特异性结合nfe212a启动子，但内源性Clock1a蛋白与nfe212a启动子的结合实验仍较为有限。由于缺乏能在斑马鱼中特异性识别Clock1a的抗体，本研究使用识别Clock蛋白的抗体来证明内源性Clock蛋白可结合nfe212a启动子。而究竟哪种Clock蛋白亚型与nfe212a启动子发生内源性结合，仍有待进一步探究。此外，尽管本研究揭示了clock1a在斑马鱼全身水平对中性粒细胞募集的作用，阐明利用活体成像技术研究斑马鱼中性粒细胞迁移的自主节律性调控也具有重要意义。后续将构建在中性粒细胞中条件性敲除clock1a的品系，以阐明clock1a在斑马鱼中性粒细胞中的特异性作用。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。