题目：Adult zebrafish can learn Morris water maze-like tasks in a two-dimensional virtual reality system

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39317191/

期刊：Cell Reports Methods

研究亮点

l 为成年斑马鱼建立了虚拟莫里斯水迷宫（VMWM）任务

l 斑马鱼的空间学习能力随时间推移有所提升

l 在虚拟莫里斯水迷宫任务中，路径直线度和目标指向性均得到提升

研究背景

 大规模钙成像已成为神经科学领域的重要研究方法，可帮助解析动物在导航、社交互动、决策制定及复杂先天行为过程中的大脑功能。该方法在成年斑马鱼研究中的应用仍未充分展开，而此类研究需结合虚拟现实（VR）系统与头部固定状态下的行为实验。此外，为探究斑马鱼在导航、社交互动等复杂任务中神经元的特性，需构建可支持其在二维平面有效活动的VR系统。为此，我们研发了一套适用于成年斑马鱼的二维VR系统。为验证该系统并探究斑马鱼的空间学习能力，我们设计了类虚拟莫里斯水迷宫实验：斑马鱼需在圆形VR竞技场中觅食，同时需躲避周期性轻微电击，找到隐形安全区。本研究提出了一种可用于探究斑马鱼大脑空间神经编码的方法，为未来结合先进光学成像技术开展相关研究奠定了基础。

摘要

虚拟现实（VR）已成为研究决策、空间认知和导航神经机制的有力工具。在许多啮齿动物头部固定VR系统中，实验动物在球形跑步机上移动，该设备可提供两个轴的旋转信息，以此计算二维（2D）运动。另一方面，沉浸在水下头部固定VR中的斑马鱼可通过摆动尾部实现2D VR环境中的移动。这促使我们为成年斑马鱼开发一套VR系统，实现基于尾部运动计算的包含向前平移和旋转的二维运动。除了介绍该VR系统外，我们还证实斑马鱼能够学习类莫里斯水迷宫虚拟任务（VMWM），在该任务中，找到隐形安全区是斑马鱼躲避周期性温和电击的必要条件。研究结果表明，我们的VR系统与光学成像技术结合，在未来空间学习与导航相关研究中具有巨大潜力。

图形摘要

引言

虚拟现实（VR）是研究环境互动神经编码的合适工具，同时能在严格控制的任务中对认知行为进行定量测量，这些任务包括决策、空间认知、学习与记忆以及社交互动，且该技术已被应用于多个物种。 虚拟现实中的头部固定技术能够通过大规模钙成像记录数百个神经元的活动，这是自由活动动物无法实现的。 在多个物种中，虚拟现实主要应用于啮齿动物，例如，头部固定小鼠的空间导航任务，这类任务允许使用细胞内记录和双光子显微技术，然而，尽管许多一维线性虚拟轨道系统 ，或是身体固定的大鼠实验 ，能够揭示位置细胞、网格细胞等神经元特性，但无法复现在真实世界开放场地中观察到的神经元二维放电模式。另有一些采用身体束缚套（“护套”）固定啮齿动物躯体的系统，由于会产生头部运动，并不适用于光学成像。有研究提出一种借助轴承装置实现头部转动的方案 ，据称可适配钙成像技术，但目前尚未见到基于该系统开展的光学成像研究报道。

小型硬骨鱼类，比如斑马鱼，也适用于光学成像结合虚拟现实的行为范式，尽管主要由于技术原因，迄今为止研究中使用的都是幼鱼阶段的斑马鱼全脑记录的优势。与斑马鱼幼鱼常表现出的简单且反射性的行为模式不同，成年斑马鱼的行为范围更广，包括社会互动、复杂的先天行为以及更高等的行为认知任务中的学习能力。成年斑马鱼的大脑尺寸仍足够小，可进行高分辨率光学成像，因此它们是研究高级脑功能的理想动物模型。为了在特定任务的行为范式中探究决策的神经相关机制，我们在配备线性轨道的虚拟现实系统中设计了一项去/留任务针对头部固定的斑马鱼，我们可以识别出端脑中负责编码与特定颜色相关的任务规则以及场景流预测误差（SFPE）的神经集群。然而，涉及空间与线索学习以及社交互动的更复杂任务则需要斑马鱼的二维虚拟现实系统，该系统支持斑马鱼向前移动和转向，从而在二维空间中觅食。黄等人提出了一套面向头部固定成年斑马鱼的二维虚拟现实系统，该系统利用成年斑马鱼在自然化虚拟现实环境中的自由活动，研究其对视觉刺激的差异化和方向性行为反应，同时探究意外感官输入的影响——这类输入会在多个脑区诱发神经反应，用于编码预期与实际感官输入之间的不匹配，即预测误差。考虑到斑马鱼在虚拟空间中进行二维运动需要配套的虚拟现实系统，我们研发了一套可实现二维运动的虚拟现实系统，其能实时计算斑马鱼的前进速度与转向角度。本系统的计算机制与现有方法不同：它并非计算二维位移和旋转量，而是针对虚拟现实中第一人称视角下的物体，计算施加于其上的平动与旋转瞬时力。这一机制可借助Unity等游戏引擎的复杂物理引擎，还原斑马鱼在虚拟现实中活动时所体验的自然惯性效果。 

为了检测斑马鱼在虚拟现实中的空间学习能力，我们设计了一项虚拟莫里斯水迷宫样（VMWM）任务，该任务是对最初为啮齿类动物开发的莫里斯水迷宫（MWM）测试的模拟36。在这项任务中，我们进行了针对斑马鱼的特异性改造，比如从试验开始时引入周期性轻微电击以构建厌恶性条件，并在斑马鱼抵达初始不可见的安全区域后移除电击。因此，躲避周期性电击成为斑马鱼寻找隐形安全区域的奖励机制。我们对完成VMWM任务的一组斑马鱼的行为进行了全面分析。下述结果表明，斑马鱼能够适应我们的VR系统，并展现出相当出色的空间学习能力。

结果

面向头部固定成年斑马鱼的2D虚拟现实系统

我们在先前提出的线性虚拟现实（VR）系统的基础上，通过对硬件进行部分修改并采用全新的软件实现方式，搭建了一套二维VR系统（详见《STAR方法》）。为提升斑马鱼的尾部活动能力，我们改用周长为0.5毫米的不锈钢金属杆将斑马鱼头部固定（图1A、1B），替代了此前使用的金属杆¹。将头部固定的斑马鱼置于装有水的圆形透明水箱内，四周环绕四台显示器，以此构建VR环境（图1C）。通过放置在斑马鱼上方的网络摄像头持续记录其尾部活动。对尾部摆动进行快速傅里叶变换（FFT），在每个时间步长中提取高频比率（HFR）（《STAR方法》中公式2、3将其记为HFR(t)），并据此计算斑马鱼向前游动的作用力（((Force _{translation }))）与转向作用力（((Force _{rotation } ))）。由于引入了二次方非线性处理机制以增强两种力之间的互斥效应，斑马鱼向前游动和转向的这两种作用力会随高频比率的变化呈现非线性变化（图1D）。高频比率越高，斑马鱼向前游动的作用力越大、转向作用力越小，反之亦然。

我们让头部固定的斑马鱼在圆形竞技场中自由游动，以此探究斑马鱼能否适应这一VR系统机制，并学会在无约束条件下于二维VR空间中活动。图1E展示了1小时自由游动的典型轨迹，可见斑马鱼在竞技场的各个区域均有均匀的活动轨迹。从本文所有实验斑马鱼的活动数据中提取的速度和转向角度分布，分别如图1F、1G所示。速度直方图的形状（图1F）与此前报道的真实环境中单条斑马鱼的速度分布³⁷相近。但在本研究的VR环境中，直方图的峰值向左偏移至速度为零的位置，这可能是由于头部固定以及缺乏真实环境线索所致。转向角度分布的形状（图1G）与此前报道的存在投射光条件下真实环境中斑马鱼的转向直方图³⁸相近，这或许是因为本实验中四台VR显示器投射的光线营造了与真实环境相似的光照条件。转向直方图的对称形状表明，在整个群体中，尾部左侧和右侧弯曲的出现频率相等。然而，在整个实验过程中，个体身上可能会观察到偏向其中一侧的情况。

图1. 斑马鱼在VR系统中的固定流程、运动机制及行为直方图。(A) 虚拟现实（VR）装置中斑马鱼的固定流程。使用牙科水泥将金属杆固定在斑马鱼颅骨上，再通过螺丝把金属杆两端固定在鱼体两侧的两块透明塑料顶板上。(B) 头部上方搭载金属杆完成头部固定的斑马鱼。金属杆两端连接白色平台上的细支撑结构，该平台用于从图像中分割提取鱼的躯体。(C) VR 实验装置示意图。单条成年斑马鱼头部固定于白色背景平台上，放置在盛有水的圆形透明水箱内。通过左侧、前方、右侧、底部四块显示屏播放场景，生成虚拟现实环境。使用红外发光二极管（LED）对鱼体进行补光，相机搭配与 LED 发光频率匹配的带通滤波器，采集尾部运动信号。(D) 不同头部摆动频率（HFR）下，速度与转向对应的作用力非线性曲线。速度相关作用力随头部摆动频率升高而增大，转向相关作用力则随之减小。(E) 3 条斑马鱼在半径 335 单位的圆形虚拟场地中自由游动的运动轨迹示例，每组游动时长均为 1 小时。(F) 本文两组全部实验斑马鱼的速度直方图。速度单位为单位 / 秒，其中 “单位” 对应 Unity 软件笛卡尔坐标系的度量单位。(G) 本文两组全部实验斑马鱼的转向直方图。转向的正值代表顺时针转向，负值代表逆时针转向。

斑马鱼能够学习VMWM任务

为验证我们的虚拟现实系统并探究斑马鱼是否能利用空间记忆，我们通过模拟原版水迷宫（MWM）设计了虚拟水迷宫任务（VMWM，详见STAR方法）。在该任务的每一次试次中，斑马鱼从圆形虚拟水池的四个起始位置之一出发（图2C）（图2A-2D），借助放置在水池外的六个视觉线索作为参考，导航寻找一个隐形安全区。每次试次时长为2分钟，试次间间隔为30秒。

图2. 用于VMWM任务的虚拟现实竞技场及示例学习曲线。(A) 虚拟水迷宫场地，四周为黑色边界墙，内部设有安全区（棕色平台）。场地外围环绕 6 根不同颜色立柱，作为远端视觉线索。红色图形标记斑马鱼位置，橙色线条代表运动轨迹。在抵达安全区前，斑马鱼会受到周期性电击（黄色标记）；安全区在鱼到达之前不可见。(B) 图 (A) 的后续状态。斑马鱼抵达安全区后，安全区变为可见；鱼处于安全区内时，不再受到周期性电击。(C) 虚拟水迷宫场地的尺寸与起始位置。每一轮实验的起始位置随机设定。(D) 虚拟水迷宫的 VR 场景，整体均分为 4 个等大区块，分别在四块显示屏（左侧、前方、右侧、底部显示屏）上进行展示。(E) 对照组斑马鱼（2 号鱼）连续 3 天的滑动成功率（最近 10 次试次的成功率）。(F) 电击组斑马鱼（04 号鱼）单日的滑动成功率。(G) 电击组斑马鱼（11 号鱼）连续 3 天的滑动成功率。(H) 全部对照组斑马鱼多天的成功率。圆圈代表成功率，线条连接同一条鱼不同天数的数据；不同颜色代表组内不同个体。(I) 13 条非学习型斑马鱼的成功率。(J) 14 条学习型斑马鱼的成功率。

为在鱼类的自然栖息环境——水中设置厌恶性条件，我们从试次开始时便对斑马鱼施加温和的周期性电击（0.5–1伏）。斑马鱼会持续受到电击，直至抵达隐形安全区，此时电击将被解除。因此，躲避这种周期性电击成为本实验中斑马鱼的奖励。若斑马鱼抵达安全区并连续停留5秒，则判定该试次成功。

本研究共纳入10条未接受周期性电击、无任何厌恶性刺激的对照组斑马鱼，同时纳入27条接受电击的实验组斑马鱼。每日训练中，我们用成功试次数量除以总试次数量，计算出对照组（见表S2）与实验组斑马鱼的成功率（见表S1）。27条电击组斑马鱼的56次训练单元中，有28次被判定为“学习单元”，27条电击组斑马鱼中有14条被标记为“学习型个体（L）”（详见STAR方法）。

电击组斑马鱼学习表现的时间维度特征通过学习曲线呈现，其中每个数据点代表最近十次试验的成功率，范围在0至1之间。展示了一条来自对照组斑马鱼（3天，图2E）以及两条来自电击组斑马鱼（分别为1天，图2F和3天，图2G）的学习曲线示例。图3A呈现了第1至3天对照组和电击组斑马鱼的平均成功率。在第1天和第2天，电击组斑马鱼的成功率显著高于对照组（t检验，(p[ day 1]=) 0.0000180302，(T-stat =-4.96132)，(p[ day 2] =0.0000395339) (T-stat =-4.97722)）。然而，由于第3天部分斑马鱼活动量较少，未达到显著差异水平（((p [day 3]=) 0.00382971，(T-stat =-3.29248)）。逐日平均成功率，学习鱼的成功率（图3B）和学习回合的成功率（图3C）随天数增加而上升，但未观察到统计学显著性 ((p<0.0001))。此外，通过汇总所有受惊吓鱼在相同起始位置和同一天的试验，计算按天和按位置划分的成功率，四个起始位置的成功率在学习鱼（图3D）和学习回合（图3E）中均呈逐日上升趋势，不过未对这些单一成功率值进行统计学检验。对四个起始位置的成功率进行比较后发现，无论是学习鱼（图3F）还是学习回合（图3G），均未表现出对某一特定起始位置的偏好。

为了检测对照组和电击组之间是否存在差异，我们收集了所有对照组斑马鱼的所有实验以及所有电击组斑马鱼的所有实验的逐帧速度数据。基于这些数据，我们可以生成两组斑马鱼的速度概率分布（图3H）。对概率分布进行比较后发现，VMWM模型中的电击组斑马鱼速度显著高于对照组斑马鱼（Kolmogorov-Smirnov检验，(p=~ 0)）。为了检测斑马鱼是否学会在安全区停留至少5秒，我们计算了所有成功和失败实验中，斑马鱼进入安全区前3秒至进入后5秒的平均速度值（图3I）。两种情况下均观察到斑马鱼进入安全区后出现减速，且失败实验中的平均速度更高。

图3.组间成功率、日间成功率和起始位置的比较。(A) 虚拟水迷宫（VMWM）任务中对照组与电击组的逐日成功率对比。第 12 天可观察到成功率出现统计学意义上的显著上升。(B) 电击组学习个体的逐日平均成功率，可见随着实验天数增加，动物任务表现逐步提升。(C) 电击组斑马鱼所有学习试次的逐日平均成功率，任务表现随天数增加而提高。(D) 全部学习型斑马鱼，4 种不同起始位置下所有试次合并后的逐日成功率。(E) 全部学习试次，4 种不同起始位置下所有试次合并后的逐日成功率。(F) 全部学习型斑马鱼，4 种不同起始位置下所有试次合并后的总成功率。(G) 全部学习试次，4 种不同起始位置下所有试次合并后的总成功率。(H) 虚拟水迷宫任务中，对照组与电击组游泳速度的累积概率分布。(I) 虚拟水迷宫任务中斑马鱼的游泳速度曲线：进入安全区前 3 秒至进入后 5 秒（共计 8 秒）。竖线与箭头标记进入安全区的时刻；实线、虚线分别代表全部成功试次、全部失败试次的平均数据。

VMWM 的轨迹显示，四个起始位置的平均 SI 占比和更高 SI 占比均有所上升

为探究斑马鱼如何适应VR系统并表现出空间学习能力，我们分析了受电击鱼只成功完成的VMWM（虚拟水迷宫任务）试验。图4A展示了所有受电击鱼只按起始位置和天数分类的全部成功试验轨迹。所有受电击鱼只的平均直线度指数（SI；见STAR方法中的公式4）体现了对运动机制的适应能力以及定位平台的空间学习能力（图4C），该指数在第2天和第3天显著上升（((p [days 1-2] =1 E-09)、(Z-stat =-5.99763)、(p [days 1-3] =3.8 E-08)、(Z-stat =)，-5.37647）。此外，受电击鱼只中高直线度指数的占比也逐日上升（图4D）。值得注意的是，四个起始位置下的平均直线度指数均随天数增加而上升（图4B，上排），且在部分情况下随天数显著上升（位置1：((p [days1-2] =7.07 E-05)、(Z-stat =-3.80566)；(p [days 1-3] =4.95 E-06)、(Z-stat =-4.41943)）位置3；(p [days 1-3] =8.25 E-05) (Z-stat =-3.76725)（对应位置4）。此外，随着天数增加，所有起始位置的高SI成功试次百分比也均有所提升（图4B，底部行）。

图4. 虚拟水迷宫任务中成功试次的轨迹与路径直线度。(A) 电击组全部斑马鱼成功试次的叠加轨迹（黑色）。每一行对应相同起始位置下第 13 天的成功试次轨迹；绿色圆圈标记安全区。(B) 上行：电击组全部斑马鱼，各起始位置下成功试次的逐日平均直线度指数（SI），可观察到多天之间存在统计学显著差异。下行：电击组全部斑马鱼，各起始位置下成功试次中高直线度指数（SI ≥ 0.5）的占比。(C) 电击组全部斑马鱼成功试次的逐日平均直线度指数（SI）。(D)电击组全部斑马鱼成功试次中，高直线度指数（SI ≥ 0.5）的逐日占比。

学会组的斑马鱼在后续天数中，成功试验所需的时间与移动距离均呈下降趋势

我们计算了斑马鱼在每次成功试验中达到成功标准所需的时间。学习型斑马鱼在第三天的成功所需时间显著减少（图5A，上图）（((p [days 1-3]=1.4118 E-07)、(Z-stat =5.134857)：p[第(2-3]=2.50277 E-05)天、(Z-stat =4.055368)天]。然而，非学习型斑马鱼未出现这种时间减少现象（图5A，下图）。学习型斑马鱼的累积距离（STAR方法）与安全区中心的距离逐日缩短（图5B，上图），并在第三天出现显著下降（((p[ days 1-3]=0)、(Z-stat =7.164301)：(p[ days 2-3] =4.433 E-09)、(Z-stat =5.751109)）。同样，非学习型斑马鱼未出现这种距离缩短现象（图5B，下图）。非学习型斑马鱼（图5C，下图）和学习型斑马鱼（图5C，上图）的逐日成功转化率（STAR方法）是通过汇总学习型和非学习型斑马鱼的每日试验数据计算得出的。这些为单一数值，不适用于统计显著性分析。学习型斑马鱼的成功转化率呈逐日上升趋势。

图5. 虚拟莫里斯水迷宫任务中学习特征、持续度图谱及目标指向性分析。(A) 上图：学习型斑马鱼全部成功试次，逐日统计的平均成功用时（抵达安全区所耗时间）。下图：非学习型斑马鱼全部成功试次，逐日统计的平均成功用时。(B) 上图：学习型斑马鱼全部成功试次，逐日统计的平均累积游动距离。下图：非学习型斑马鱼全部成功试次，逐日统计的平均累积游动距离。(C) 上图：学习型斑马鱼全部试次的逐日成功转化率。下图：非学习型斑马鱼全部试次的逐日成功转化率。(D) 虚拟水迷宫任务中，基于汇总试次绘制的坚持度热图：对照组鱼 (a)、电击组鱼 (d)、学习个体 (b)、非学习个体 (c)、学习试次 (e)、非学习试次 (f)。红色与白色代表高坚持度。(E) 模拟随机试次、对照组鱼、电击组鱼、学习型斑马鱼、学习试次汇总后的GHstatic平均值。对照组与电击组之间 GHstatic 出现统计学显著升高。(F) 模拟随机试次、对照组鱼、电击组鱼、学习型斑马鱼、学习试次汇总后的GHmove平均值。对照组与电击组之间 GHmove 出现统计学显著升高。(G) 对照组鱼、电击组鱼、学习型斑马鱼、学习试次的 GHstatic 累积概率分布。(H) 对照组鱼、电击组鱼、学习型斑马鱼、学习试次的 GHmove 累积概率分布。

在VMWM学习中，对安全区域附近的停留持续性进行了视觉量化

从VMWM对照组鱼试验和受惊吓鱼试验计算得出的持续图（STAR方法中的公式5）展示于图5D。对照组鱼的持续图（图5Da）与随机试验的持续图（图S1A，第一行，最左侧图）相比，在安全区附近未显示出持续时间的显著增加，而受惊吓鱼的持续图（图5Dd）中则能看到安全区附近的持续时间数值显著更高。此外，学习型鱼试验（图5Db）和学习型实验阶段（图5De）的持续图在安全区附近显示出更高的持续时间，且即使是非学习型鱼试验（图5Dc）以及非学习型实验阶段试验（图5Df），其持续时间数值也高于对照组鱼的持续图。为检测各点位的持续时间在对照组和受惊吓组鱼之间是否存在显著差异，我们对两组鱼每个点位的持续时间数值进行了比较（威尔科克森秩和检验），并得到了显示差异存在情况的p值图（图S2）。与对照组鱼相比，受刺激鱼在安全区附近的持续性显著更高（图S2A）。将学习鱼（图S2E）和学习阶段（图S2B）的数据与对照组鱼的数据进行比较时，也可观察到类似的统计学显著性。

我们还采用了另一种方法来计算持续性³⁹，在该方法中，持续性由以下公式1定义：

其中P为持续性，G为朝向该位置的移动次数，N为总移动次数，R为随机移动为朝向该位置的概率。该方法基于朝向特定位置的移动比例，而非朝向该位置的距离净和（公式5）。然而，使用此方法（经(R=0.5)验证），得到了相似的持续性图谱，如图S1B所示。因此，持续性图谱凸显出受电击组斑马鱼为到达安全区所展现出的更高动机与努力。

在虚拟多目标记忆（VMWM）学习中，生长激素（GH）的作用得到了显著体现

为了探究斑马鱼倾向于朝向安全区的程度，我们计算了目标朝向度（((GH))）值。除了持续性外，目标朝向度（GH）是另一个衡量斑马鱼朝向安全区程度的指标。在图5E中，电击组斑马鱼实验得出的平均静态目标朝向度（GHstatic）值显著高于对照组斑马鱼实验和随机模拟（其中模拟了1200次实验）（t检验，(p=6.87229 E-36)、(T-stat =-12.5958)）。此外，学习型斑马鱼实验和学习阶段实验的平均静态目标朝向度（GHstatic）值也显著高于对照组斑马鱼（对照组vs学习型斑马鱼：(p=5.34141 E-52)、(T-stat =-15.4088)；对照组vs学习阶段：(p=1.44144 E-57)、(T-stat =-16.3453)）。在移动目标朝向度（GHmove）值方面也观察到了类似结果（图5F），其中电击组斑马鱼的移动目标朝向度（GHmove）值显著高于对照组斑马鱼（((p=1.84805 E-58))、(T-stat =)、16.3113）。此外，学习型斑马鱼和学习阶段的移动目标朝向度（GHmove）值也显著更高（对照组vs学习型斑马鱼：(p=3.49773 E-85)、(T-stat =-20.067)；对照组vs学习阶段：(p=6.49783 E-114)、(T-stat =-23.4674)）

图5G和图5H显示了温室气体静态和温室气体移动值的累积概率分布。Kolmogorov-Smirnov检验表明，在温室气体静态和温室气体移动分布的情况下，与VMWM对照试验相比，VMWM休克试验获得了更高的值（Kolmogorov-Smirnov检验，(p=1.72559 E-46)温室气体静态；(p=1.31816 E-39GHmove）。同样，来自示范鱼和示范实验的GHstatic和GHmove累积概率分布的数值均显著高于对照组鱼（GHstatic：对照组鱼 vs 示范鱼：(p=3.80538 E-74)，对照组鱼 vs 示范实验：(p=4.73704 E-81)；GHmove：对照组鱼 vs 示范鱼：(p=3.11037 E-71)，对照组鱼 vs 示范实验：(p=9.3832 E-91)）。因此，除了持续性之外，GH指标为理解VMWM任务中的目标导向行为提供了颇具启发性的视角。

讨论

延续我们之前的研究，我们构建了一套二维虚拟现实（VR）系统，支持在二维空间中移动，旨在为开展多项后续实验奠定基础。结合双光子成像技术，这些实验有望深入解析成年斑马鱼在空间学习、导航、决策、社交互动等行为过程中的神经编码机制。我们的模型中，通过对尾部运动振荡进行实时分析，并结合其他参数，来确定用于向前平移和旋转的力分量，随后借助Unity游戏引擎的物理系统将这些力分量应用于虚拟现实中的物体。这两个力分量互斥，确保了斑马鱼在高高频率（HFR）下能直线游动，方向变化可忽略不计；而在低高频率（HFR）下则能完成转向，且转向方向的平移量微乎其微。与此前发表的斑马鱼二维VR系统³⁵相比，本研究VR系统的核心差异在于：我们通过计算这两个力分量，并利用Unity物理引擎实现速度和转向过程中的自然惯性效应。而此前的系统是每次尾部曲率穿过中点（零交叉点）时，通过累加向前平移量来计算向前平移，旋转量则依据尾部曲率来确定。尽管直接对比这两套VR系统并非本文的研究范畴，但我们认为，斑马鱼在本研究的VR系统中能以更高的高频率（HFR）实现更笔直的游动；而在先前研究³⁵所述的机制下，当尾部出现幅度更大、强度更高的振荡时，斑马鱼可能难以保持直线游动，且可能在两个方向上产生交替旋转。由于本系统中向前平移与旋转互斥（图1D），在上述情况下仅会发生可忽略的旋转。同理，斑马鱼在本系统中可完成显著的转向（低高频率HFR），同时向前平移量也微乎其微。我们会持续更新中点位置，因此即便斑马鱼仅向一个方向弯曲尾部、未越过中点但仍在该侧范围内振荡时，也能计算出向前平移和旋转量。除了正常的对称尾部振荡外，在本系统中还能偶尔观察到头固定的斑马鱼出现单侧非对称振荡。自由游动的相关数据（图1E）以及后续的VMWM实验结果表明，斑马鱼能够通过在实验区域内均匀游动来适应我们设计的虚拟现实系统，这体现为斑马鱼通过学习运动机制来适应该虚拟现实系统。

此外，借助 Unity 游戏引擎，利用商用或定制的 3D 模型就能更轻松地打造高度复杂且逼真的虚拟现实场景。

正如我们之前的研究1所示，我们所采用的头部固定方法产生的头部运动微乎其微。通过大量成像实验，我们此前发现，头部运动的残余影响可通过标准图像配准进行校正，这使得我们的系统适用于双光子显微镜等光学成像设备。然而，利用双光子显微镜从端脑更深部以及视顶盖、纹状体、基底神经节等区域获取图像，面临着巨大挑战。我们确信，借助长波长三光子显微镜40，将能够相对轻松地对这些脑区深处的钙瞬变进行测量。

我们开展了虚拟水迷宫（VMWM）实验，以研究斑马鱼的空间学习与导航能力。在该实验中，我们为头部固定的斑马鱼设置了周期性轻微电击作为厌恶性环境刺激，斑马鱼需找到并抵达参照远端视觉线索定位的安全区，才能摆脱电击。每当斑马鱼抵达安全区，电击便会停止，这相当于啮齿类动物在水迷宫实验中找到并抵达隐藏平台以摆脱水中厌恶性环境的过程。因此，VMWM任务是针对斑马鱼设计的、与原版水迷宫（MWM）任务核心原理一致的模拟任务，同时保留了原版任务的关键实验流程。此前有研究在虚拟现实（VR）环境中让小鼠完成类似水迷宫的空间导航任务，但该任务在目标初始可见性、无需在目标区域停留数秒等方面与原版水迷宫存在差异。而在我们的VMWM任务中，安全区在每次实验试次开始时均为不可见状态，仅当斑马鱼抵达并停留在安全区内时才会显现，以此为斑马鱼提供视觉层面的位置确认。这一设计是对啮齿类动物在真实环境实验中，抵达并站上目标平台时获得的躯体感觉位置确认的替代方案。

在Morris水迷宫（MWM）中，学习安全区的位置被视为位置学习或空间学习，随后会进行探测试验或迁移试验（此时平台已移除），以检测学习结束时的参考记忆。另一方面，在为安全区提供视觉或体感确认的同时，联想学习的特征可与空间学习相结合，在此情况下，探测测试能够反映出所达成的空间学习程度。而与现实中的Morris水迷宫实验不同，啮齿动物可以学习安全平台的空间位置由于每天的实验次数极少，在虚拟现实环境中头部固定的斑马鱼需要完成多得多的试次才能学会安全区的位置。因此，我们的研究重点是验证成年头部固定的斑马鱼能否在虚拟现实环境中完成Morris水迷宫任务的空间学习部分，这也是未来开展光学成像研究的首要前提。不过，我们无法排除所采用的虚拟现实Morris水迷宫实验方案中包含联想学习成分的可能性。

我们假设，为了在虚拟莫里斯水迷宫（VMWM）实验中抵达安全区，斑马鱼会利用基于放置在虚拟水箱外部的远距离线索进行空间学习，这需要与啮齿动物在莫里斯水迷宫（MWM）中使用的相似脑功能。此外，虚拟莫里斯水迷宫试验的成功条件要求斑马鱼在安全区停留连续五秒，而非仅抵达安全区即可，这模拟了现实世界莫里斯水迷宫实验中，实验者需等待数秒才能救出成功找到平台的啮齿动物的情况。最后，安全区的面积不超过虚拟水箱的6%，这与现实中用于啮齿动物的莫里斯迷宫规模相当。这些实验设置使虚拟莫里斯水迷宫成为针对斑马鱼改良的、有效的莫里斯水迷宫虚拟版本。

结果显示，部分斑马鱼能够通过感知和记忆虚拟空间内的位置来完成VMWM任务。在实验天数增加的过程中，所有起始位置下的直线行进距离均有所提升，任务成功所需的时间和累计移动距离均有所减少，这表明斑马鱼逐渐适应了寻找隐形安全区的方式。此外，持续性和GH分析的结果有力证明，受电击组斑马鱼之所以能保持高成功率，是因为它们理解了实验规则并学会了VMWM任务，且摆脱周期性电击的动机更强。与对照组相比，受电击组斑马鱼抵达安全区的速度更快，这也体现出其抵达安全区的动机有所提升。总体而言，我们得出结论：成年斑马鱼能够展现出空间学习能力，从而完成VMWM任务。我们推测，未来结合本VMWM任务开展的光学成像研究，有望揭示新型空间学习的神经机制，这一机制可能涉及斑马鱼大脑中细胞的位置特异性放电。此外，本研究开发的VR系统可作为未来实验的重要平台，相关实验可包括复杂环境下的二维导航、规划与决策，以及成年斑马鱼的社会行为研究。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。