题目：Sublethal neurotoxicity of saxitoxin in early zebrafish development: Impact on sensorimotor function and neurotransmission systems

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38545180/

期刊：Heliyon

摘要

石房蛤毒素（STX）是一种备受关注的海洋毒素，会给水生生态系统以及公共食品安全造成严重危害。作为一种强效麻痹剂，石房蛤毒素阻断电压门控钠通道（VGSCs）的作用机制已得到充分阐明。然而，其低剂量毒性背后的具体分子机制在很大程度上仍不清楚。本研究将斑马鱼胚胎和幼鱼置于梯度浓度石房蛤毒素（0、1、10、100 μg/L）条件下进行亚慢性暴露处理，直至受精后第 7 天。本研究采用触觉刺激检测实验，评估石房蛤毒素暴露可能引发的行为异常。行为学与转录水平分析均发现斑马鱼触觉应答功能受损；即便是最低的石房蛤毒素暴露剂量，该损伤也与两种不同电压门控钠通道亚型（scn8aa/ab、scn1Laa/ab）的信使 RNA（mRNA）显著上调存在关联。值得注意的是，该最低浓度的毒素暴露还会改变胆碱能通路与 γ氨基丁酸（GABA）能通路关键基因（包括ache和gabra1）的转录模式。此外，石房蛤毒素会造成神经递质 γ氨基丁酸（GABA）含量显著下降。本研究结果表明，斑马鱼早期发育阶段长期低剂量接触石房蛤毒素，会严重破坏其触觉应答行为。本研究证实，处于发育阶段的斑马鱼长期暴露于低剂量石房蛤毒素，会改变神经传递通路，最终导致触觉行为发生异常。

引言

在全球范围内，海洋与淡水生态系统中特定甲藻和蓝细菌引发的有害藻华（HABs）频繁暴发，带来了严峻的生态与公共卫生风险。石房蛤毒素（STX）是在此过程中产生的一种强效神经毒素。

这些藻华会抑制电压依赖性钠通道（VGSCs），导致神经冲动紊乱和肌肉麻痹[1]。水体样本中STX的浓度会随环境条件变化。例如，Oluwafemi等人[2]的一项研究显示，雨季水体样本中的STX浓度为2.1至2.4毫克/毫升，旱季则为3.0至3.04毫克/毫升。此外，该研究还发现贝类中STX浓度存在差异，凸显了该毒素在生物体内的生物富集现象。例如，蓝蟹的甲壳在雨季的STX浓度为69.93±0.90微克/克，旱季则为114.71±0.02微克/克。此外，伊尔库茨克水电站附近开展的案例研究[3]显示，受有害藻华影响区域的水体样本中STX浓度高达600±100微克/升。该研究将这种污染与长孢藻的藻华关联起来，揭示了藻类腐烂过程中STX释放的动态变化规律。Ledreux开展的研究[4]则揭示了STX在娱乐水体中的流行情况。该研究在原水中检测到超过3微克当量STX/升的浓度，并确定纤细束丝藻可能是石房蛤毒素的产生菌。

这些综合研究强调了stx在不同环境中的浓度存在差异，并指出需要详细探究其在水生生态系统中的存在情况。了解这些浓度对于评估其对鱼类和其他生物的潜在危害至关重要，凸显了严格的监测与管理策略的重要性。如上所述，有害藻华的发生和stx的产生受水温、盐度、养分可利用性等环境参数的调控[5,6]。随着藻华形成，stx会在食物链中发生生物富集，引发麻痹性贝类中毒，并对水生生物造成影响，这对生态系统和全球粮食安全均具有重要意义[7,8]。气候变化预测表明有害藻华的发生频率和严重程度将加剧，因此需要制定严格的有害藻华管理策略，以降低stx暴露风险及其相关的生态和经济影响 

截至目前，已有多项针对斑马鱼、青鳉、鲱鱼、鳉鱼和大西洋鲑等多种鱼类的研究，证实了石房蛤毒素的积累和生物放大作用会产生有害影响[9-13]。这些不利影响涵盖了一系列亚致死效应，具体包括：a) 生长抑制，例如，暴露于石房蛤毒素的鱼类通常会表现出生长速率降低的现象[9,12,14]；b) 攻击行为加剧，石房蛤毒素暴露可能导致鱼类的攻击性增强[15]；c) 运动能力下降，鱼类可能出现游泳活动和移动能力降低的情况[9,10]；d) 食欲减退，暴露于石房蛤毒素的鱼类往往会出现食欲下降的问题[14]；e) 抗氧化活性降低，石房蛤毒素可导致鱼类抗氧化活性下降，这可能使鱼类更易受到氧化应激的影响[16]；f) 游泳模式异常，鱼类可能表现出异常的游泳模式和行为[13,14]；g) 存活率降低，石房蛤毒素暴露会导致鱼类的存活率下降[9,14]。

在分子层面，石房蛤毒素已被证实与多种不良反应相关，包括细胞毒性、遗传毒性、氧化应激和免疫抑制。此外，在神经元层面，研究发现石房蛤毒素会上调青鳉胚胎中参与神经元修复和增殖的特定蛋白质，如核苷二磷酸激酶（NDK）和微管蛋白家族蛋白[12]。这些研究结果共同表明，石房蛤毒素暴露会从行为到分子等多个生物学层面引发广泛的负面影响，凸显了深入了解并减轻石房蛤毒素对水生生态系统和生物有机体影响的重要性。

STX 是神经细胞中电压门控钠通道（VGSCs）强效、天然且具有选择性的阻滞剂，可引发麻痹效应[1]。人体接触 STX 会出现从面部和四肢麻木到致命性呼吸衰竭等多种症状[7]。电压门控钠通道是动作电位产生和传导的关键组成部分，从而促进可兴奋细胞之间的信号传递[19]。这类通道由特定膜蛋白构成，具有孔道结构，可使离子快速被动地跨脂质双分子层扩散[20]。当动作电位沿轴突传导时，电压门控钠通道的激活会引发膜去极化，进而使电压门控钙通道（((Ca^{2+}))）开放。由此产生的钙离子内流（(Ca^{2+})）会调节神经递质向突触后神经元或肌纤维的释放[21]。乙酰胆碱的释放会促进兴奋性传递，而γ-氨基丁酸能系统则通过释放γ-氨基丁酸抑制传递。越来越多的证据表明，STX 会对这一复杂系统造成显著干扰。具体而言，STX 的胍基可作为钠离子的阳离子替代物，最终改变神经兴奋和抑制的正常模式。一方面，STX 具有强烈的神经毒性，剂量低至 1–4 毫克/千克就可能致命。另一方面，凭借其高特异性，STX 成为研究不同条件下电压门控钠通道结构与功能的有力工具，包括用于研发精神疾病治疗药物[21,24]。哺乳动物和斑马鱼在胚胎发育阶段均会表达编码孔形成α亚基蛋白（Nav.1）的钠通道基因（SCN1A）[25]。鉴于斑马鱼与哺乳动物钠通道在结构和遗传上的相似性，斑马鱼成为探究毒物对离子通道影响的极具价值的模型系统。

本研究的主要目的是全面探究石房蛤毒素（STX）对鱼类的毒性作用，重点聚焦于电压门控钠通道（VGSCs）和神经递质通路。本研究以斑马鱼胚胎为模型系统，旨在阐明即使是亚致死浓度的石房蛤毒素（STX）所诱导的神经毒理学变化。我们还研究了不同浓度石房蛤毒素（STX）暴露下斑马鱼胚胎的行为反应和基因表达谱。本研究的核心目的是揭示石房蛤毒素（STX）暴露相关的潜在危害，并从电压门控钠通道（VGSCs）调控神经传递的角度，深入理解其神经毒理学影响的机制。本研究的发现不仅超越了其直接的毒性作用，还有助于更全面地认识石房蛤毒素（STX）在水生环境中带来的生态风险，尤其关注其对鱼类种群的影响。通过将行为观察与基因表达的分子水平分析相结合，我们旨在全面呈现石房蛤毒素（STX）的作用，进而阐明其潜在的生态后果。本研究不仅为理解石房蛤毒素（STX）的毒性提供了有价值的见解，也为制定减轻其对水生生态系统影响的策略提供了参考。对斑马鱼胚胎中石房蛤毒素（STX）对电压门控钠通道（VGSCs）影响的详细研究，为水生毒理学和神经生物学等更广泛领域的未来研究奠定了基础。

材料与方法

斑马鱼饲养

成年斑马鱼（斑马鱼属）在康塞普西翁大学生物技术中心（智利康塞普西翁）的自动化Aquaneering系统中持续培养，该系统配备机械和生物过滤器。实验鱼在受控系统中饲养，温度为28±0.3摄氏度，光周期为14小时光照:10小时黑暗，并持续充氧。实验鱼每天投喂两次由干燥鱼卵孵化的活卤虫无节幼体（编号(≈48 ~h old)；美国大盐湖卤虫卵）。每天分析水的温度、pH值和电导率等理化参数，铵、亚硝酸盐和亚硝酸盐含量则每周检测一次，检测使用商业试剂盒。STX暴露实验的胚胎通过自然交配获得，将野生型（AB品系）成年雄鱼与雌鱼在专用产卵室中配对过夜。收集鱼卵后进行清洗，并用体视显微镜检查，根据Kimmel等人[27]的方法进行分期，随后转移至含有E3培养基的培养皿中。

石房蛤毒素的提取

按照鲁比奥等人此前发表的方法[28]进行了石房蛤毒素的提取与纯化。简要来说，研究人员从智利蓬塔阿雷纳斯附近不同本地海湾采集了智利贻贝。从贻贝肌肉中提取毒素前，需先将贻贝去壳并清洗干净。取100至150克肌肉组织在网中沥干5分钟，随后在高速搅拌机中均质60至120秒，再向100克匀浆中加入100毫升0.1摩尔/升盐酸。用0.1摩尔/升氢氧化钠或5摩尔/升盐酸将pH值调至3，然后在通风橱内的电热套中轻轻煮沸，以避免过度蒸发。将样品置于冰浴中冷却至室温，再次将pH值调至3.0。将提取液转移至试管中，用0.003摩尔/升盐酸定容至最终体积200毫升

 干扰物去除与纯化

为去除蛋白质并使贻贝提取物达到纯化条件，采用 C-18 固相萃取柱（Oasis HLB，Waters 公司，美国马萨诸塞州）进行固相萃取（SPE）。将 50 毫升体积的贻贝提取物上样至固相萃取柱，随后进行 10 分钟的平衡。以 1.3 毫升/分钟的流速进行洗脱，实现了 85%（质量分数）的蛋白质去除。随后，脱蛋白后的贻贝提取物通过制备型高效液相色谱法进行纯化采用C-18 Kromasil色谱柱（柱长250毫米、内径10毫米、粒径5微米）进行高效液相色谱（HPLC）分析，流动相流速为15.3毫升/分钟。该流动相经25%氨水调节至pH 7.1，由11毫摩尔/升庚烷磺酸钠、16.5毫摩尔/升正磷酸和11.5%乙腈组成。为去除流动相中的盐类及其他化合物，将纯化后的馏分通过6.0毫升Oasis WCX阳离子交换固相萃取（SPE）小柱进行去离子处理。先用去离子水洗涤WCX小柱，再用5.0%甲酸洗脱石房蛤毒素。最后，将石房蛤毒素在-52摄氏度下冻干24小时，并用0.003摩尔/升盐酸溶解。通过分析型高效液相色谱（HPLC）验证了石房蛤毒素的浓度。

高效液相色谱分析方法

对于分析型高效液相色谱法，采用Kromasil C18反相色谱柱（5微米，300毫米×4毫米），柱温为室温。流动相采用等度洗脱模式，流速为1毫升/分钟，由11毫摩尔庚烷磺酸盐、5.5毫摩尔磷酸和11.5%乙腈组成。柱后衍生化使用氧化相（5毫摩尔高碘酸和100毫摩尔磷酸）和酸性相（0.75毫摩尔硝酸）进行，两者流速均为0.4毫升/分钟。衍生化反应在80摄氏度的烘箱中进行，毒素检测采用荧光检测，激发波长为330纳米，发射波长为390纳米。样品中石房蛤毒素的定量分析采用外标校准曲线，该曲线由NIST 8642a石房蛤毒素标准品（103.0微克/克）绘制（参见补充图S1）。

暴露于石房蛤毒素及感觉运动反应测定

先前的实验表明，在7天的暴露期内，暴露于227±26微克石房蛤毒素当量/升和426±100微克石房蛤毒素当量/升的环境会完全抑制斑马鱼幼体对机械感觉刺激的反应[9]。作为预实验，我们依据经济合作与发展组织（OECD）《化学品、鱼类、急性毒性试验测试准则》（203号，2019年）[29]，评估了不同浓度的石房蛤毒素（0、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200和600微克/升）对斑马鱼幼体7天内的潜在毒性（图1）。不同浓度的石房蛤毒素均在E3培养基中稀释。每个处理组选取20个胚环期胚胎，以4个重复的方式分配至24孔板中（每个重复5个个体）。在整个暴露期间，将胚胎置于28.5℃的培养箱中培养，以保证其发育速率稳定。在处理开始和结束时，分别监测pH值（6.5–7.5）、电导率（600–800微西门子）和溶解氧含量（6.6–7.6毫克/升）。每日使用徕卡ES2体视显微镜观察胚胎和幼体，并测定其触碰反应及死亡率。

图1. 实验设计示意图。该图展示了斑马鱼（*Danio rerio*）发育阶段（168小时受精后）的石房蛤毒素处理及分析流程。所有个体自0小时受精后起在28℃下饲养，直至处理结束。处理于5.7–6小时受精后启动，此时胚胎处于胚环与盾状阶段之间，持续至168小时受精后。分析内容包括：1）48小时受精后进行的感觉运动能力检测；2）72小时受精后进行的mRNA绝对定量分析；3）120和168小时受精后进行的免疫荧光测定。由BioRender.com制作。

受精后48小时（hpf）起，每日对斑马鱼幼鱼的触觉反应进行评估，此时幼鱼已完全脱膜。使用镊子对幼鱼脊髓背侧（机械感觉神经元所在位置）施加轻柔刺激。参照Lefebvre等人[9]的方法并稍作修改，记录该反应。我们通过以下标准定义正常反应：（1）斑马鱼对触觉刺激立即做出反应；（2）具备正常的游泳模式。初始阶段，反应表现为快速游动，随后逐渐转变为更频繁的拍动-滑行式游泳，直至120 hpf后发展为更活跃的游泳状态。因此，对触觉刺激能维持正常游泳模式的幼鱼被判定为反应正常。反之，通过以下标准将触觉反应记录为异常：（1）反应延迟（需多次触碰才产生反应）；（2）幼鱼对触觉刺激无法维持正常游泳模式（沉至底部）；（3）无任何反应（瘫痪）。

石房蛤毒素处理的实验设计

根据先前实验的死亡率和触感应毒性数据，确定了三种stx浓度（100、10和1微克/升）为亚致死浓度，并将其用于后续分析。针对每种浓度，选取230枚胚环期胚胎进行三次重复暴露实验。此外，还设置了由230枚未暴露胚胎组成的对照组用于对比。在每种浓度下，分别于暴露48、72、96、120、144和168小时（he）对实验个体进行取样。暴露期间，幼虫不进行投喂，且在每个处理阶段的开始和结束时测定氨、pH值、电导率和溶解氧等参数（图1）。

RNA提取与定量聚合酶链式反应

采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测了神经系统中胚胎和幼虫发育阶段表达基因的转录反应。具体基因信息及引物组序列见表S1。用于qRT-PCR的引物通过NCBI引物在线设计软件设计。暴露于0、1、10和100 μg/L的STX后，在72、96、120、144和168小时，使用TRIZOL试剂®（0.2毫升；美国密苏里州Sigma-Aldrich公司）从30个匀浆胚胎中分离总RNA，并通过260 nm处的吸光度进行定量。通过琼脂糖变性凝胶电泳验证纯化RNA的完整性。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad公司）从总RNA中合成cDNA。采用SYBR Green主混合液（Bio-Rad公司）进行qRT-PCR。每个qRT-PCR反应体系包含SYBR Green主混合液、2微升cDNA、每种引物500纳摩尔/升，以及无RNase水，最终体积为10微升。扩增在96孔板中进行三次重复，热循环条件如下：95℃初始激活10分钟，随后40个循环，95℃变性15秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒。使用已知浓度的含PCR插入片段的质粒进行系列稀释，计算所检测各基因的绝对拷贝数（见表S1）。

 斑马鱼幼虫全标本免疫荧光法

120小时受精的斑马鱼幼鱼被取样，在冰上处死，并在室温下振荡条件下用4%多聚甲醛固定2小时。固定后，幼鱼在室温下用1×PBS、3%的(H_{2} O_{2})和0.5%的KOH脱色30分钟。随后，用PBS（1×）洗涤幼鱼。接着，依次用浓度递减的甲醇（90%、75%、50%和25%甲醇/1×PBS-吐温0.1%（PBS-T））进行复水，并用1×PBS-T洗涤10分钟。然后将幼鱼置于封闭液（0.2克牛血清白蛋白+10毫升1×PBS-T）中，在室温、避光且持续振荡的条件下封闭2小时。样品在4℃下与稀释于封闭缓冲液中的兔抗GABA抗体（Sigma，货号ab2052，1:150）和山羊抗ChAT抗体（Sigma，货号ab144P，1:100）一抗孵育过夜。将稀释于封闭缓冲液中的Alexa 594偶联山羊抗兔二抗（Abcam，货号ab15007，1:1000）和驴抗山羊二抗（1:1000）与4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）一同加入，在室温、避光且持续振荡的条件下孵育3小时。当省略一抗时，未观察到免疫反应性。使用蔡司体视显微镜ZEISS Axio Zoom.V16和蔡司激光共聚焦显微镜LSM780 NLO获取图像。

图像分析

斑马鱼幼鱼以侧位方式进行成像，随后使用Fiji（ImageJ）对图像进行处理。进行γ-氨基丁酸（GABA）定量分析时，分析每尾幼鱼的躯干-尾部区域的荧光强度；而胆碱乙酰转移酶（ChAT）分析则在卵黄后延伸部上方的神经肌肉接头（NMJ）的三个肌节上开展定量。使用蔡司Axio Zoom.V16拍摄的GABA图像按以下方式分析：先进行灰度处理并拆分通道((Image > Color >)（拆分通道）。通过Fiji的“分析>设置测量”命令设定测量参数，勾选面积、平均灰度值、积分光密度和阈值限制选项。随后对图像进行阈值处理以生成二值图像，选取目标区域并添加至感兴趣区域管理器，将选定区域应用至原始图像并测量上述参数。接着使用“多边形选区”工具标记幼鱼以外的区域，记录背景水平。对照组和沙蚕毒素处理组的所有分析幼鱼均按此流程操作。

使用40倍甘油浸液物镜获取共聚焦图像，共收集并分析了243个z轴堆叠图像（厚度62微米）。使用“选择多边形”工具，在浏览不同玻片时，绘制出三个肌节的目标区域并添加至感兴趣区域管理器，以便在堆叠图像中对多个感兴趣区域进行插值处理。设置与原始图像中先前描述的相同测量参数。随后移动绘制的区域，将幼虫排除在外记录堆栈的背景测量值。以任意单位为单位，对每只幼虫的校正总细胞荧光（CTCF）进行如下测量：CTCF = 积分密度 -（所选细胞/区域面积 × 背景读数的平均荧光值）。

数据分析

采用R-RStudio界面进行统计分析。所有数值均以平均值±均值标准差（SD）表示。通过Kaplan-Meier（K-M）曲线，绘制了暴露于不同初始浓度STX的斑马鱼幼虫随时间变化的存活概率。触觉反应分析采用双向混合方差分析（two-way mixed ANOVA）对统计数据进行检验。表达分析中，分别使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验对所有数据进行正态性和方差齐性检验。随后采用双向方差分析（two-way ANOVA）结合Tukey HSD事后多重比较检验进行数据分析，以石房蛤毒素处理组和未处理组、样本时间作为自变量。图像分析采用Student t检验对校正总细胞荧光（CTCF）的差异进行统计学检验。当(p-value <0.05)时，结果被认为具有统计学显著性。所有图表绘制和分析均通过RStudio完成。

结果

石房蛤毒素（STX）暴露改变斑马鱼胚胎的发育轨迹

我们的首要目的是确定亚慢性暴露过程中膝沟藻毒素（STX）亚致死剂量对斑马鱼幼鱼存活率的影响。Kaplan-Meier（K-M）曲线通常以1.0（代表100%存活概率）为起点，随着时间推移，随着死亡等事件发生次数的增加，曲线呈现下降趋势。研究发现K-M曲线在早期出现显著分化，表明不同STX浓度组间的存活概率存在较大差异（图2）。更具体地说，初始浓度为600 μg/L时，斑马鱼幼鱼从暴露后的最初24小时起存活率便显著下降，至168小时时存活率降至0%。当初始浓度降至200 μg/L时，幼鱼存活概率在72小时前维持在较高水平，但随后持续下降，168小时时同样降至0%。值得注意的是，初始浓度为100 μg/L时，幼鱼存活率的下降趋势更为平缓，168小时时累计存活率仍保持在50%以上。对数秩检验的进一步分析验证了不同浓度组间存活概率的差异，显示出统计学上的显著偏差((p-value <0.05))。因此，本研究结果表明，斑马鱼幼鱼的STX浓度与存活概率呈直接相关：浓度越高，存活率下降速度越快；而浓度越低，幼鱼随时间推移的存活情况则越好。

图2. 不同初始浓度下斑马鱼幼鱼暴露于STX七天期间在R软件中生成的Kaplan-Meier生存曲线。Y轴代表特定时间点的累积存活概率，X轴代表暴露于STX后的小时数。曲线的水平线代表该时间间隔的存活时长，以死亡事件发生为结束点。垂直线代表曲线进展时累积概率的变化。

石房蛤毒素的亚致死浓度会诱导斑马鱼早期发育过程中逐渐出现的感觉运动功能缺陷

为阐明石房蛤毒素（STX）的作用机制，我们以斑马鱼胚胎的感觉运动反应作为行为反应的关键指标进行了关键评估。研究结果显示，与未处理的对照组相比，不同浓度STX暴露均引发了显著的神经毒性效应，表现为触觉反应随时间逐渐下降，而对照组的触觉反应未出现任何显著变化。具体而言，我们观察到，在初始STX浓度为100 μg/L的条件下暴露48小时后，触觉反应减弱的胚胎比例显著下降了25%。相反，较低浓度的STX（10 μg/L和1 μg/L）仅在后续更晚的时间点才产生此类效应，分别在暴露后96小时和120小时出现。在120小时时，100 μg/L组的触觉反应相较于0 μg/L和1 μg/L STX组出现显著降低。到144小时，所有STX暴露组的触觉反应均达到最严重的下降程度。100 μg/L暴露组的触觉反应相较于其他三组（0、1和10 μg/L STX）出现显著下降。同时，10 μg/L STX处理组的触觉反应相较于对照组（0 μg/L STX）也显著降低。实际上，在100 μg/L STX暴露的幼虫中，仅有约7%表现出正常反应。然而，10 μg/L和1 μg/L STX暴露的幼虫触觉反应相对较好，分别有50%和70%的幼虫表现出正常触觉反应。相比之下，在168小时时，STX处理组的正常触觉反应呈现出轻微的恢复趋势，且最高浓度组与所有其他石房蛤毒素浓度（图3，参见补充表S2）。这些结果的可靠性凸显了一个关键推论：低剂量石房蛤毒素暴露会导致斑马鱼胚胎出现进行性的感觉运动缺陷。此外，这种效应的严重程度受石房蛤毒素暴露浓度和暴露时长的双重显著影响。

图3. 暴露于亚致死浓度的石房蛤毒素会降低斑马鱼幼鱼在受精后前7天对触觉刺激的反应。每种不同处理均包含四个重复组，每个重复组有10个胚胎。暴露从胚胎处于胚环期（6小时受精后）开始。机械感觉反应以平均值±标准差绘制。相同时间点下不同石房蛤毒素浓度之间的显著差异用符号（▴、Δ、￭、□、、￮、ɵ）表示，相同符号代表存在显著差异。 

亚慢性石房蛤毒素暴露改变钠通道α亚基异构体的表达模式

基于早期暴露于STX后观察到的感觉运动反应减弱现象，我们接下来旨在探究可能涉及的分子机制。我们重点关注电压门控钠通道（VGSCs）成孔α亚基的转录（图4）。通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR），我们检测了自斑马鱼胚胎发育早期即开始表达的两组重复scna基因（scn1Laa与scn1Lab，以及scn8aa与scn8ab）的表达水平[25]。与对照组相比，暴露于1 μg/L STX后，我们观察到scn8aa的转录水平从暴露后96小时起显著升高，scn1Laa则从暴露后72小时起显著升高。此外，scn8ab的表达水平在暴露后120小时和168小时显著上升，而scn1Lab仅在暴露后168小时出现显著升高（图4A-D）。在更高的10 μg/L STX浓度下，scn8aa mRNA的表达水平从暴露后120小时起显著升高，scn8ab则从暴露后144小时起显著升高。同时，scn1Laa的转录水平在暴露后144小时出现明显上升。与对照组相比，scn1Lab mRNA在暴露后144小时和168小时均表现出显著升高（图4A-D）。在实验所用的最高浓度100 μg/L STX处理下，scn8aa和scn1Lab mRNA在暴露后144小时出现显著过表达，scn8ab转录本则在暴露后72小时、144小时和168小时均显著过表达。值得注意的是，scn1Laa mRNA表达水平呈现独特的变化轨迹，先是在96小时出现下调，随后在120至168小时期间上升（图4A-D）。除scn1Lab mRNA表达谱外，与对照组相比，所有STX处理组在144小时时scn8aa和scn1Laa转录本表达均显著上调，在168小时时scn8ab转录本表达也显著上调（图4A-D）。值得注意的是，在暴露期间，不同STX处理组之间的scn8aa、scn8ab、scn1Laa和scn1Lab表达存在显著差异（参见补充表S3）（图4A-D）。这些研究结果表明，斑马鱼早期暴露于STX会引发与电压门钠通道（VGSC）系统相关基因的转录变化。研究发现，这些转录变化的程度取决于处理的浓度和时间。暴露情况以及所检测的特定同工型。

图4. 暴露于不同初始浓度的石房蛤毒素时斑马鱼早期发育过程中编码电压门钠通道成孔α亚基的基因的绝对mRNA水平。A) scn8aa基因。B) scn8ab基因。C) scnILaa基因。D) scnILab基因。误差线表示三次重复的平均值±标准差 ((n=10)) 采用Tukey HSD事后检验的双因素方差分析：(p<0.05^{*})、(p<0.01^{* *})、(p<0.001^{* * *}) 

低剂量石房蛤毒素亚慢性暴露改变胆碱能和γ-氨基丁酸能通路的转录活性

为了探究STX如何调控神经传递，我们分析了斑马鱼早期发育过程中与胆碱能和γ-氨基丁酸（GABA能）通路神经传递相关的基因表达谱。有趣的是，我们的分析研究揭示了响应不同浓度STX的差异基因表达模式。在低浓度STX处理（1 μg/L）条件下，与对照组相比，我们观察到在120小时和168小时时，chat和gabra1转录本的表达量显著升高。此外，研究发现ache mRNA水平在168小时时升高，而在72小时和96小时时降低，同时gat1的表达基本保持不变（图5A-D）。当将STX处理浓度提升至10 μg/L时，在所有时间点，chat mRNA的丰度与对照组相比均无显著差异。尽管如此，ache mRNA的表达呈现出双相反应，在暴露72小时和96小时时出现下调，而在144小时时上调（图5A和B）。相比之下，gabra1转录本在168小时时表现出显著的过表达，而gat1的水平在96小时时显著降低（图5C和D）。在暴露于最高浓度STX（100 μg/L）后，chat mRNA的丰度在暴露96小时时显著下降。与对照组相比，ache mRNA水平在144小时时升高。值得注意的是，与对照组相比，gabra1和gat1转录本的表达未出现显著变化（图5A-D）。本研究进一步发现，在168小时这一特定时间点，相较于初始1 μg/L STX处理，chat、ache和gabra1的表达水平存在显著差异，而gat1的水平未发生显著改变（图5A-D）。在暴露期间，不同STX处理组之间，chat、ache、gabra1和gat1的mRNA水平也存在显著差异（见表S4）。总体而言，这些基因表达模式表明，亚致死浓度的STX能够在早期发育阶段差异性调控胆碱能和GABA能通路关键基因的表达。有趣的是，这些调控的程度和方向似乎高度依赖于STX的处理浓度。

图5. 暴露于不同初始浓度的石房蛤毒素的斑马鱼早期发育过程中，胆碱能和γ-氨基丁酸能通路相关基因的绝对mRNA水平。A) 胆碱能途径chat基因。B) 胆碱能途径ache基因。C) γ-氨基丁酸能途径gabra1基因。D) γ-氨基丁酸能途径garl基因。误差线表示三次重复的平均值±标准差 ((n=10))。采用Tukey事后检验的方差分析：(p<0.05^{*})、(p<0.01^{* *})、(p<0.001^{* * *})。

 低剂量的STX会抑制神经递质GABA的水平，而不影响胆碱乙酰转移酶（ChAT）

作为探究低剂量STX如何调节胆碱能和GABA通路的初步方法，我们通过免疫组织化学分析，在斑马鱼幼虫的躯干-尾部区域（我们在此评估感觉运动反应的区域）检测了神经递质GABA和胆碱乙酰转移酶（ChAT）的水平。研究结果显示，暴露于1微克/升STX的斑马鱼，在暴露120小时后，其GABA水平的荧光强度显著降低（图6A和B）。这一发现与STX暴露后GABA能神经传递可能减弱的结论一致。相比之下，神经肌肉接头处与ChAT水平相关的荧光强度未出现明显变化（图7）。这表明，在此剂量和时间点下，STX处理对ChAT活性以及胆碱能神经传递基本无影响。综合来看，这些结果表明，在斑马鱼发育早期，低剂量STX暴露可能会影响翻译过程，尤其是与GABA能通路相关的翻译过程。该数据更清晰地揭示了STX对关键神经传递通路的特定影响。

图6. 1微克/升的石房蛤毒素暴露会降低斑马鱼幼鱼在120小时时尾部躯干中神经递质γ-氨基丁酸的荧光强度。A) 对照组和石房蛤毒素处理组幼鱼中4',6-二脒基-2-苯基吲哚与γ-氨基丁酸抗体的共标记结果。B) 对照组与石房蛤毒素处理组个体躯干尾部的荧光强度定量分析。Y轴代表校正总细胞荧光（校正总细胞荧光），单位为任意单位。黑色矩形表示研究区域。采用t检验进行统计分析((p<0.05))。比例尺为100皮米。

图7. 暴露于1微克/升的石房蛤毒素不会改变120小时时神经肌肉关节肌节中胆碱乙酰转移酶荧光的荧光强度。A) 对照组和石房蛤毒素处理的幼虫中4',6-二脒基-2-苯基吲哚与胆碱乙酰转移酶抗体的共标记。B) 对照组与石房蛤毒素处理个体之间三个肌节的荧光定量分析。Y轴代表以任意单位表示的校正总细胞荧光（校正总细胞荧光值）。黑色矩形表示研究区域，黄色矩形表示选定的肌节。统计分析采用Student's t检验((p<0.05))。比例尺为50皮米。

讨论

石房蛤毒素在水生环境中的存在会产生深远的生态影响，对从水生生物到哺乳动物（包括人类）的多种物种造成影响。值得注意的是，即使浓度符合或低于世界卫生组织的指导标准，也可能产生危害。长期接触这些“安全”浓度可能引发不良影响]。因此，仅满足石房蛤毒素的指导标准并不意味着绝对安全，这引发了人们对环境保护、公共卫生和生物保护的担忧。故而，必须警惕石房蛤毒素带来的潜在威胁，以最终制定有效的应对措施。

多项体外和体内研究已对这种强效神经毒素的毒性展开探索，阐明了其在生理、形态及致死性等方面的影响。在评估其对水生物种的毒性时，至关重要的是要同时考虑石房蛤毒素（STX）的浓度与暴露时长。以往研究表明，当石房蛤毒素浓度达到10微克/升或更高时，会导致斑马鱼孵化延迟、出现解剖学缺陷并提高死亡率（Oberemm 等人，1999年）。此外，暴露于更高浓度石房蛤毒素（((>100 mu g / L))）且暴露时间更长的斑马鱼幼体，死亡率也有所上升。本研究的结果与这些发现相符，因为我们成功在水生模型中确定了石房蛤毒素的亚致死浓度。

在本研究中，早期发育阶段经STX处理的斑马鱼幼鱼出现了暂时性的感觉运动异常，其严重程度与STX暴露浓度直接相关。常用于毒性评估的行为学评价进一步证实了STX的有害影响。我们观察到，斑马鱼幼鱼对外界刺激的反应随STX剂量增加而降低，所有实验组在144小时时均出现最显著的紊乱。这一结果与该毒素已知的药效学特性相符，正如勒菲弗尔等人[9]所强调的，该毒素主要引发麻痹现象。值得注意的是，大多数案例显示，STX暴露后第6天或第7天，幼鱼的运动活性得以恢复。类似地，桡足类动物暴露于STX后，游泳速度也出现短暂下降，随后恢复至正常运动能力。

我们的研究结果强调了STX对斑马鱼幼鱼感觉运动功能的剂量依赖性影响。低浓度下，机械感觉运动分析表明，STX似乎会在神经元层面引发紊乱。有趣的是，STX暴露还导致了电压门控钠通道（VGSC）以及胆碱能和GABA能系统中关键基因的表达谱发生改变。具体而言，STX处理后，电压门控钠通道成孔α亚基的四种同工型（scn8aa/ab和scn1Laa/ab）大多呈现上调表达。电压门控钠通道mRNA水平的这种调节可能源于可兴奋细胞内钠离子动态的改变，促使神经元响应触觉刺激重新校准其通道密度。Scheinman等人在大鼠中报道了类似的观察结果，即电压门控钠通道α亚基的增加与大脑中钠通道的过度产生相关。正如Sashihara等人所描述的，这种通道过度产生在时间上与STX暴露后行为改变的发生相一致。值得注意的是，接触苯妥英（一种电压门控钠通道活性抑制剂）也会诱导上调表达VGSC mRNA 水平的研究结果也与我们的结果相似。在类似的研究背景下，日本哲水蚤暴露于石房蛤毒素（STX）后，与神经元动作电位和孔形成相关的基因出现上调。与本研究结果一致，这些研究强调了电压门控钠通道（VGSC）α亚基（scn8aa/ab 和 scn1Laa/ab）在神经元响应石房蛤毒素（如 STX）的动作电位过程中介导膜去极化的关键作用。因此，本研究结果揭示了石房蛤毒素（STX）与神经元功能失调之间存在潜在关联，这一关联可能也适用于神经系统疾病。

我们还探究了石房蛤毒素（STX）暴露对斑马鱼胚胎胆碱能信号传导的影响。在STX暴露后，我们发现乙酰胆碱酯酶（ache）的mRNA水平显著升高。尽管在10微克/升STX处理下，胆碱乙酰转移酶（chat）呈现出轻微的上调趋势，但这一结果未达到统计学显著性。这些发现可能与斑马鱼对外界刺激的反应性降低有关，而反应性降低可能会增加电压门控钠通道（VGSC）的可利用性，进而提高细胞兴奋性。这反过来又可能通过胆碱乙酰转移酶（chat）促进乙酰胆碱的合成。然而，在100微克/升STX暴露条件下，胆碱乙酰转移酶（chat）出现下调，这可能是由于系统饱和所致，而系统饱和可能会阻碍最佳的生理反馈机制。

本研究结果还揭示了石房蛤毒素（STX）暴露后斑马鱼胆碱能系统的动态变化：在10和100微克/升的STX暴露144小时时，乙酰胆碱酯酶（ache）mRNA水平均出现上升，而1微克/升的STX仅在暴露168小时时出现该现象。这一趋势与相关文献一致，即ache与胆碱乙酰转移酶（chat）动态失衡会导致乙酰胆碱（ACh）神经递质浓度升高，进而产生潜在的遗传毒性效应[39]。进一步研究还表明，长时间暴露于STX会增加斑马鱼幼虫体内的丙二醛水平，并引发脂质过氧化反应。脂质过氧化会诱导氧化应激，最终导致鱼脑组织出现DNA损伤。本研究结果提示，微量STX暴露可干扰胆碱能系统，产生遗传毒性结果，同时凸显了水生生物对这类毒素的易感性。

此外，本研究结果还显示了STX对γ-氨基丁酸能（GABAergic）系统的调控作用。在144小时时，在所测试的STX浓度范围内，γ-氨基丁酸A受体α1亚基（gabra1）和γ-氨基丁酸转运体1（gat1）的mRNA表达均未出现明显变化。然而，1和10微克/升的STX暴露分别在120小时和168小时时，引起了gabra1基因表达及翻译动态的改变，这表明STX可能参与了抑制性突触传递的调控[40]。本研究数据表明，STX的神经毒性效应取决于其浓度和暴露时长，其作用机制涉及兴奋性与抑制性分子反应之间的平衡。

总而言之，本研究强调，即便石房蛤毒素（STX）浓度极低，也能干扰可兴奋细胞的神经信号传导，其潜在机制可能是抑制了对动作电位传导至关重要的关键钠通道。我们已阐明了STX对电压门控钠通道（VGSCs）mRNA水平以及胆碱能和γ-氨基丁酸能系统功能的影响。随着环境变化导致有毒藻华愈发普遍，生态系统中STX含量的升高正带来日益严峻的健康风险。阐明发育过程中STX依赖性神经毒性的作用机制，对于制定有效的风险评估和管理策略具有关键意义。进一步开展全面的功能分析，对于深化我们当前的认知不可或缺。本研究存在以下潜在局限性：a) 浓度-效应关系：本研究虽观察到STX对感觉运动功能的剂量依赖性影响，但对浓度-效应关系进行更细致的探究，可深入揭示毒性动态变化的细微机制；b) 机制阐释：尽管本研究指出了基因表达谱的改变，但仍需开展进一步的功能研究，以全面理解STX诱导神经毒性所涉及的复杂分子通路；c) 单一物种模型：斑马鱼虽具有研究价值，但仅代表单一物种。将本研究结果外推至更广泛的生态系统时需谨慎，针对不同水生生物的额外研究将提升本研究结果的普适性；d) 短期暴露：本研究主要聚焦于早期发育阶段。评估STX暴露的长期影响，尤其是在不同生命阶段的影响，可更全面地了解其随时间变化的效应；e) 环境复杂性：本研究虽为受控实验，但简化了自然栖息地中复杂的环境条件。现实场景中存在多种相互作用的因素，这些因素可能会影响STX的毒性；f) 毒素相互作用：本研究主要聚焦于STX，而自然环境中往往存在多种毒素。理解STX与其他毒素的潜在相互作用，对于开展全面的风险评估至关重要。综上，本研究为理解STX对水生生物的神经毒性效应做出了重要贡献。然而，要应对有害藻华及STX这类神经毒素带来的复杂挑战，还需持续开展相关研究。尽管存在上述局限性，本研究结果仍凸显了在日益严峻的环境挑战下，开展全面风险评估和制定管理策略的紧迫性，以保护水生生态系统和公众健康。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。