标题：Voltage imaging identifies spinal circuits that modulate locomotor adaptation in zebrafish

期刊：Neuron

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.01.001

摘要

运动系统必须持续调整其输出以维持期望的轨迹。尽管节律性运动背后的脊髓回路已得到充分描述，但人们对该网络如何调节其输出强度知之甚少。一个主要挑战是难以在动物行为过程中对脊髓神经元进行记录。本研究利用电压成像技术，在虚拟环境中模拟游动时，对斑马鱼幼鱼整个脊髓内大量谷氨酸能神经元的膜电位进行成像测绘。我们鉴定出了一个此前未被报道的强直放电腹侧V3神经元亚群，其放电频率与游动强度和运动回合长度相关。光遗传学激活V3神经元会使游动强度增强、运动回合延长，但不会影响尾鳍拍打频率。对V3神经元进行基因敲除会导致运动适应能力下降。电压成像技术的优势使我们能够确定V3神经元是斑马鱼运动适应的关键驱动因子。

引言

动态调整运动输出是脊椎动物运动控制的一项核心功能。动物必须调节肌肉力量以改变速度，或应对内外部力量的变化。在众多模式系统中，产生运动所必需的节律性活动的核心网络已得到广泛研究（格里德纳和马尼拉，2015）。而关于这些网络如何被动态调节的研究则少得多。其中一个技术难题是在动物行为过程中难以对脊髓进行记录。在体内，啮齿动物的脊髓很难通过光学或电学手段进行观测；而非洲爪蟾蝌蚪、斑马鱼幼鱼等更适合光学方法研究的生物，其神经活动动态变化速度超过了(Ca^{2+})成像技术的时间分辨率。因此，迄今为止，只有利用电压敏感染料在无脊椎动物标本中实现了运动回路中全群体膜电位的群体水平测量（布鲁诺等人，2015；托米纳和瓦格纳，2017）。

利用基因编码电压指示剂（GEVIs）进行电压成像是克服这些局限性的潜在方法。传感器（Abdelfattah 等人，2019；Adam 等人，2019；Chien 等人，2021；Gong 等人，2015；Piatkevich 等人，2019；Villette 等人，2019）、光学技术（Fan 等人，2020）和分析工具（Cai 等人，2021；Xie 等人，2021）的最新进展已使相关研究成为可能在体内记录多个细胞的阈下活动和锋电位活动。这些进展为绘制群体神经元的电压动态图谱以及以无偏方式表征其活动提供了可能。

受精后5天（dpf），斑马鱼幼鱼表现出多种行为，包括快速和慢速向前游动、转向、逃逸反应以及捕食（Budick和O'Malley，2000；Marques等人，2018）。慢速向前游动以“拍打-滑行”模式进行，该模式包含短暂的游动回合（200-400毫秒，尾拍频率20-70赫兹），回合之间为长度可变的滑行间隔期（400毫秒至数秒）（Buss和Drapeau，2001）。平均游动速度的变化可通过尾拍频率的改变、摆动幅度或力量的改变，或游动回合相对于滑行间隔期占空比的改变来实现（Ahrens等人，2012；Kawashima等人，2016；Portugues和Engert，2011；Severi等人，2014）。已有研究表明，不同的运动前兴奋性中间神经元群会在不同的尾拍频率下被募集（Ljunggren等人，2014；McLean等人，2007，2008；Wahlstrom-Helgren等人，2019），但游动力量和回合时长适应的脊髓机制目前尚不清楚。

本研究利用光片电压成像技术，绘制了斑马鱼在虚拟环境中缓慢向前游动时脊髓的神经活动图谱。我们详细表征了相关的活动模式所有谷氨酸能亚型的网络活动及亚细胞动作电位传播。在一种此前未被鉴定的细胞类型——脊髓V3中间神经元中，我们发现其活动与游泳行为相关，但呈现非节律性模式。V3神经元以表达sim1为特征，在小鼠体内，V3神经元与同侧和对侧的运动神经元均存在连接（Chopek等人，2018；Zhang等人，2008）。对小鼠开展的功能缺失实验和光遗传学实验表明，V3神经元在运动活动的左右协调及稳定性中发挥作用（Danner等人，2019；Zhang等人，2008）。

我们发现，斑马鱼幼鱼游动时V3神经元的活动与每次游动的强度和持续时间相关。我们通过光遗传激活和基因靶向消融V3神经元，来探究V3神经元在斑马鱼幼鱼体内的功能作用，结果表明V3神经元是游动行为的调节因子，其作用主要体现在影响游动强度和游动时长。这些研究发现揭示了脊髓网络调控运动行为的新机制，也证明了电压成像技术在揭示此前难以探究的神经动力学方面的重要价值。

结果

兴奋性脊髓神经元的不同振荡与非振荡亚群

为了在不动的鱼体内诱发与自然游泳相关的神经活动模式，我们在定制的光片显微镜中实现了虚拟现实（VR）反馈（Ahrens 等人，2013；Vladimirov 等人，2014）（图1A和图S1）。用1毫克/毫升的α-银环蛇毒素使鱼麻痹，并将其放置在记录腔中。实时处理鱼体一侧腹神经根（VNR）的电记录，以计算虚拟游泳强度，该强度取决于腹神经根的振幅和频率（STAR 方法）。为诱发稳定的游泳反应，我们构建了虚拟现实环境，并模拟了动物被恒定水流向后冲的状态。具体而言，虚拟游泳强度通过用户选定的反馈增益进行缩放，以得到虚拟游泳速度，随后从下方投射的漂移光栅的运动中减去该速度。该装置可独立控制基线光栅漂移速度和反馈增益，有助于引发穿插着静止期的稳定虚拟游泳发作。虚拟游泳每次发作的平均周期频率为23±4赫兹（平均值±标准差，共452次发作，9条鱼），平均发作时长为0.4±0.4秒，平均发作间隔为0.8±0.8秒。

为了可视化鱼类进行模拟游泳时的神经动力学，我们构建了转基因品系 Tg(UAS:zArchon1-GFP)，以表达电压传感器 zArchon1（Piatkevich 等人，2018）。随后，我们使用 Tg(vGlut2a:Gal4) 驱动品系（Satou 等人，2013）在 5–6 天龄（dpf）斑马鱼的谷氨酸能脊髓神经元中驱动 zArchon1 的表达。该转基因品系中传感器的表达展现出优异的膜定位特性，与此前瞬时表达的研究结果高度一致（Piatkevich 等人，2018）（图1B）。我们采用宽场光片成像技术，以 1kHz 的帧频记录谷氨酸能神经元的膜电压，同时观察幼鱼进行模拟向前游泳的行为。我们通常会同时记录 (from >10) 个神经元（每个视野中平均有 11±7 个活跃细胞，均值±标准差，最大值29；共 (n=339) 个细胞，9 条鱼）（图1C）。

电压波形大致分为两类：在部分神经元中，游泳过程中膜电位相对于VNR信号以恒定相位发生振荡（视频S1）；在另一些神经元中，膜电位出现明显的尖峰但并无振荡（图1C；视频S2）。为了对神经元进行分类并量化阈下振荡的幅度和相位，我们以VNR信号为时间基准，计算了一个游泳周期内由VNR触发的平均膜电压（图1D）。具有阈下电压振荡的神经元沿背腹轴分布在脊髓中部、中央管上方（图1E）。振荡神经元的相位分为两组，彼此相位相差180度，分别定位于脊髓的左半侧和右半侧（图1F和1G）。

对脊髓480毫米长区段内多个神经元的同步电压成像显示，存在位置依赖性的相位延迟，平均斜率为0.51皮弧度/毫米（在平均周期频率22.6赫兹下对应0.087米/秒），相应的波长为3.9毫米（图1H）。在受精后5-6天，我们测得的肌节大小为93±8毫米（平均值±标准差），意味着每个肌节的相位延迟为2.4%±0.2%。此前发表的腹侧神经根（VNR）记录显示运动输出的相位延迟与之相近（每个肌节2.6%±1.7%）（Masino和Fetcho，2005）。振荡神经元的位置和动态特征表明，这些神经元主要为V0v型（MCoD）和V2a型（CiD）运动前兴奋性中间神经元，已有研究报道这类神经元的振荡动态与我们的观察结果相似（McLean等人，2008）。这些神经元的锋电位宽度约为1毫秒（McLean等人，2008），低于我们记录的奈奎斯特频率。因此，锋电位仅能在表达量最高的细胞中被检测到（图S2）。

第二类神经元为特征性无振荡神经元。该类神经元包含一个聚集在脊髓腹侧边缘的亚群，以及一个分布在背侧边缘、更为分散的亚群（图1E和图S3）。我们根据这些神经元在游泳过程中还是游泳间歇期的放电率更高，对无振荡神经元进行了进一步细分（STAR方法；图S3）。腹侧亚群的大多数神经元在游泳过程中放电更为频繁，而背侧亚群中在游泳间歇期放电更为频繁的神经元占比相对更高（图1E）。鉴于其明确的解剖定位和独特的放电模式，我们将后续研究聚焦于腹侧亚群。

腹侧触突活性神经元在脊髓中的位置及其谷氨酸能表型表明，它们为V3（VeMe）神经元。V3神经元在形态学上被描述为具有下行轴突的腹侧谷氨酸能神经元，在分子层面则以转录因子sim1a的表达为特征（Hale等人，2001；Higashijima等人，2004）。这些细胞被认为是哺乳动物V3中间神经元的同源物（Goulding，2009）。我们将vGlut2a:GFP品系与Tg(sim1a:loxPDsRed-loxP-DTA)品系进行杂交，以标记谷氨酸能神经元为绿色、V3神经元为红色（无需Cre表达，Cre表达会激活白喉毒素A并消融表达该毒素的细胞）。在中央管下方的谷氨酸能神经元中，76%（174个神经元中的133个，图S4中的(N=3 fish)）同时也呈DsRed阳性。这一结果表明，至少76%的腹侧谷氨酸能神经元为V3神经元，这与以往的研究报道一致（Wiggin等人，2021；Yang等人，2010）。剩余24%的神经元可能反映了一个次要的非V3腹侧谷氨酸能亚群，也可能反映了测量时部分细胞中sim1a标记的部分沉默。由于我们未根据放电模式观察到腹侧神经元的不同亚类，因此我们将腹侧谷氨酸能神经元称为V3。

图1. 虚拟游泳过程中脊髓神经元的电压成像。(A) 光片显微镜、腹侧神经根记录和闭环视觉反馈的示意图。(B) Tg(vGlut2a:Gal4; UAS:zArchon1-GFP)转基因品系中zArchon1-GFP的表达。上图：GFP表达标记的双光子图像；下图：同一焦平面下zArchon1荧光的光片图像。比例尺，10毫米。(C) 荧光轨迹显示同时记录的神经元((n = 13))被分为振荡（红色）和非振荡（紫色）两种活动模式。下图：处理后的腹侧神经根信号及衍生的游泳强度。(D) 左图：同时记录的两个振荡细胞的腹侧神经根信号和荧光。右图：腹侧神经根周期触发平均值。(E) (n=344)神经元的周期触发振幅与背腹位置的关系，共9条斑马鱼。饼图显示背侧和腹侧亚群中活动类型的分布。(F) 同时记录的振荡神经元的相位图。神经元胞体根据其相对于腹侧神经根信号的相位着色。比例尺，50毫米。(G) 俯视图显示振荡神经元的胞体位置，颜色根据相对于腹侧神经根的相位编码。非振荡细胞为灰色；虚线表示外侧神经纤维网区域和中央管的位置。(H) 平均相位与沿吻尾轴的胞体位置的关系。两个群体分别表示脊髓左侧和右侧的胞体。斜率表示沿尾部的相位延迟。(Slope =-0.51 pm 0.06;)弧度/毫米（平均值±标准误均值），(r^{2}=0.96)。另见图S1-S3。

V3神经元的放电、阈下活动及形态

我们利用庞大的膜电位记录数据集，进一步对V3神经元的行为特征进行了分析。在一次游泳动作开始时，V3 神经元迅速去极化，且在第一个游泳周期内放电频率呈上升趋势（放电起始的时间常数：(tau_{on }=65 pm 4) 毫秒）（图2A）。游泳动作结束时，VNR 信号突然终止，但 V3 神经元的平均放电频率在游泳动作结束前就开始逐渐下降，在游泳结束时没有出现明显的突变（((tau_{off }=137 pm) 18毫秒）。阈下电压在游泳动作开始时也表现出快速去极化，在结束时则逐渐复极化（图2A）。与呈振荡状态的背侧神经元群不同，在游泳过程中，V3 神经元的阈下电压（图1E）和放电频率（图2B）均未与 VNR 同步发生振荡。

我们分析了V3神经元的阈下动力学，以确定其是由单一来源驱动，还是由不同的亚群组成。在数字去除锋电位后，我们发现剩余的阈下动力学在不同细胞间存在强烈相关性（图S5A）。对同时记录的V3细胞(( n=22 cells))进行主成分分析，结果显示数据集86%的方差可由第一主成分解释（图S5B和S5C）。这些结果表明，V3群体主要由一维输入驱动。

图2. V3神经元的电压成像表征。(A) 上图：示例V3记录以及所有V3神经元的放电率，已对齐至游泳动作的起始和结束时刻。每个神经元的放电率基于5至25次动作取平均值。神经元按动作活动指数（I）排序（STAR方法）。中图：所有神经元的总平均放电率，以及经计算去除尖峰后的阈下荧光信号。下图：对应于游泳动作起始和结束时刻的平均VNR信号。阴影区域表示均值标准误（((n =189 bouts))） (B) 左图：单个V3神经元在80个游泳周期内的尖峰光栅图。尖峰在整个VNR阶段均匀分布。右图：VNR触发的V3神经元总平均放电率，显示放电率无相位依赖性调制。阴影区域表示均值标准误（n (= 87 cells))） (C) 游泳动作期间，脊髓左侧（红色）和右侧（蓝色）的两个V3神经元被快速抑制。 (D) 上图：动作中期抑制事件期间的平均荧光瞬变，相对于之前的VNR峰值对齐，并根据细胞体在左右轴上的位置进行颜色编码（(= 16 cells)，每个细胞5-18次事件）。中图：对应的平均VNR信号。下图：阈值穿越直方图，显示呈双峰分布，两个峰值间隔半个VNR周期。另见图S4和图S5。

然而，对单个轨迹的更细致观察揭示了细胞亚群中一些独特的动态变化。V3记录显示，在游泳过程中偶尔会出现快速膜超极化现象，这表明V3神经元受到抑制性输入（图2C）。尽管V3的放电活动和大部分阈下活动并未与运动节律锁相，但我们注意到，每个细胞的超极化现象均与VNR信号存在确定的相位关系，且这种关系在多个事件中保持恒定。此外，在细胞间对比时发现，超极化事件的相位可分为两个簇，两个簇之间的相位差为半个VNR周期。这两个簇分别对应脊髓左右两侧的V3细胞体位置（图2D）。综上，这些观察结果表明，V3神经元接收来自一个抑制性神经元群体的输入，该群体与VNR信号锁相，且呈现出偶发的（注：原文末尾“sporad”为不完整拼写，结合语境推测为“sporadic”，意为偶发的）特性。在一个或两个游泳周期内表现出动态活动，并以偏侧化的模式形成突触。

高速成像实现了单个V3神经元内动作电位传播的图谱绘制。我们采用了亚奈奎斯特动作电位计时（SNAPT）技术，该技术此前已被用于绘制培养神经元中的动作电位传播图谱（Hochbaum等人，2014）（见STAR方法）。针对每个神经元，我们从胞体的荧光波形中提取了锋电位时间。我们计算了锋电位触发的平均成像，通常从25秒的记录中提取100至300个锋电位进行平均，随后沿轴突和树突对荧光轨迹拟合平滑样条曲线。这种插值后的时间轨迹使我们能够以亚帧频精度确定锋电位峰值的平均时滞（图3A）。在信噪比高且神经突与焦平面对齐的记录中，该分析清晰显示动作电位在胞体处或胞体附近启动并向外传播（视频S3）。平均传导速度为0.19±0.07米/秒（平均值±标准误均值，共48个神经元，对应标识符(n=7)）（图3B和3C），约为背侧更靠上的振荡群体中传播波速度的两倍（图1H），且与近期报道的I型V2a神经元的传导速度相近（Menelaou和McLean，2019）。

随后我们利用不同神经元很少同时放电这一现象（图S5D和S5E）来解析这些信号来自密集重叠的神经突。每个细胞的峰触发平均电影清晰显示了细胞体和附近轴树突分支的电激活，几乎不受其他细胞的污染。我们计算了逐像素的互相关每个细胞的平均锋电位波形与该细胞的锋电位触发平均电影。该图谱揭示了细胞体周围神经突的形态（图3D）。我们通过计算提取了每个神经元的形态随后重建出一张标注出单个神经元的合成图像（图3E）。

为了探究功能解混范围之外的腹侧谷氨酸能神经元形态，我们使用光可转换荧光蛋白标记了单个细胞的树突分支。我们通过在 Tg(vGlut2a:Gal4) 品系中驱动 Tg(UAS:Kaede) 表达，使谷氨酸能神经元表达 Kaede 蛋白。用聚焦激光束（405 纳米）照射单个细胞后，让光转换产物在树突分支中扩散 24 小时。细胞体周围树突的形态与功能成像数据测得的形态高度相似（图 3F），验证了基于活动的形态重建的有效性。

图3. 动作电位传导与V3形态。(A) (i) 一个V3神经元的空间足迹，其中一条神经突用红色标记。(ii) 在1毫秒的离散相机帧（阶梯状）下采样的锋电位触发平均动作电位波形，以及从(i)中标记的神经突近端（棕色）和远端（绿色）末端得到的插值平滑波形。(iii) 动作电位沿(i)中标记的神经突传播。颜色表示归一化的荧光强度。黑线表示低于奈奎斯特频率的插值峰值时间。(B) 动作电位沿两个神经元的传播。颜色表示时间延迟；比例尺，20微米。动作电位起始位点（黑色星号）与轴突起始段的动作电位起始一致。(C) 七个神经元动作电位传播的线性拟合（灰色线）和平均拟合（黑线）。相同颜色的点来自同一个神经元，每个点代表18微米或神经突长度上的分箱值。平均传导速度为0.19±0.07米/秒（平均值±标准误均值）。(D) 基于活性的分割示意图。测量胞体的电压轨迹以计算平均锋电位触发电影和锋电位波形。锋电位波形与视频的逐像素相关性揭示了神经元形态（STAR方法）。比例尺，10微米。(E) 上图：电压成像视频（25000帧）中的平均zArchon1荧光。中图：记录中每个神经元的锋电位触发平均荧光振幅图。下图：复合图像，每个功能鉴定的细胞用不同颜色表示。比例尺，20微米。(F) Tg(vGlut2a:Gal4; UAS:Kaede)品系中光转化V3神经元的追踪。红线显示轴突的范围。插图显示胞体附近的形态。比例尺，10微米。(G) 上图：光转化V3神经元的形态。胞体沿吻尾轴相互对齐，并沿背腹轴相对于脊髓腹侧边缘对齐。下图：放大区域。为了更好地可视化，位置沿吻尾轴进行了偏移。(i) 具有分叉轴突的V3神经元。(ii) 具有下行轴突的V3神经元。另见图S5。

我们观察到腹侧谷氨酸能神经元存在两种形态学类型，一种具有长的下行轴突（8个细胞中的3个），另一种具有分叉轴突（8个细胞中的5个）（图3A）。由于细胞体沿左右轴呈连续分布，无法明确判断其投射主要为同侧还是对侧。轴突的平均跨度为1.7±0.5毫米（平均值±标准差，n=8个神经元），其中分叉轴突的下行和上行部分长度均等（上行：0.6±0.4毫米，下行：0.5±0.2毫米）。在整个延伸过程中，轴突始终位于脊髓的腹侧边缘（图3B）。具有下行轴突的这类神经元此前被称为VeMe细胞（Hale等人，2001年）。分叉神经元则是此前未被描述过的形态类型。考虑到分叉形态神经元的占比（8个细胞中的5个），这些神经元不太可能完全来自非V3亚群。V3轴突的一个潜在靶标是参与慢速游动的次级运动神经元（Menelaou和McLean，2012年），这表明V3神经元可能在调控慢速游动过程中发挥作用。

V3神经元活性调节慢速游泳过程中幼体的游泳动作

由于V3神经元的放电不具节律性，它们不太可能参与产生游泳振荡的中枢模式发生器（CPG），但它们在游泳发作期间的独特放电模式表明其与运动存在密切关联。我们假设V3神经元可能会调节运动输出。

为了验证V3活性是否与运动输出的变化相关，我们在改变虚拟现实（VR）装置中的反馈增益和光流速度时，记录了V3神经元的锋电位发放活动。这种调控使得V3神经元在部分游动回合中产生锋电位，而在另一些回合中则不产生（图4A）。我们根据V3活性的变化，测定了虚拟游动强度的平均值（STAR 方法）。与V3活性低的回合相比，斑马鱼在V3活性高的回合中（以视野内(>50%)比例的神经元在该回合内产生锋电位为判定标准）游动强度提升了38%（游动强度分别为1.07±0.04任意单位和0.81±0.05任意单位；平均值±标准误；(p=0.0041)，配对t检验；(N=9)，来自7条斑马鱼的视野）（图4B）。我们还发现，V3活性高的回合相较于V3活性低的回合，游动持续时间增加了50%（430±48毫秒 vs 286±31毫秒；(p=0.0135)）。值得注意的是，V3神经元活性高与活性低的回合之间，振荡频率并无差异（22.6±0.8赫兹 vs 22.9±0.9赫兹，平均值±标准误；(p=0.4)，配对t检验）（图4B）。这一发现与许多其他脊髓中间神经元的活性特征不同——这类神经元的放电频率与尾鳍摆动频率相关（Ampatzis等人，2014；Kimura & Higashijima，2019；McLean等人，2007，2008），这表明V3神经元发挥着独特的作用。

图4. V3区的活动与游泳强度的增加相关视野。红线表示平均值±均值标准误。V3 活性被定义为视野中超过 50% 的 V3 神经元在单次运动期间至少产生一次锋电位。(N=9) (B) V3 活性与游泳强度和运动时长相关，但与周期频率无关。每个点代表 7 条鱼各类别下所有单次运动的平均值。(A) 8 个同时记录的 V3 神经元在不同强度的游泳过程中的活动情况。所有神经元在更强的游泳运动中放电频率均增加。显著性阈值经 Bonferroni 校正后为 (alpha=0.017)，采用配对 t 检验。

接下来，我们试图通过光遗传激活V3神经元并测量其对尾部运动的影响，来确定V3神经元放电与游泳强度之间的相关性是否具有因果关系。为此，我们构建了一个条件表达通道视紫红质（ChR）的转基因品系(Wang等人, 2009)在谷氨酸能神经元(Tg(vglut2a:loxPDsRed-loxP-ChR-GFP))中进行了标记，同时构建了第二个品系，该品系在腹侧p3区域表达Cre重组酶(Tg(nkx2.2b-Cre))。这使我们能够仅在V3神经元中表达ChR(图5A)。为了避免光刺激过程中可能出现的视觉伪影，并将脊髓回路与上游脑区解耦联，我们对5–6天龄(day post-fertilization, dpf)的幼鱼进行了脊髓切断处理，并向培养液中加入NMDA(图5B和5C)。已有研究表明，该方法可诱导幼鱼产生节律性的游泳动作和休息状态，尽管其尾部摆动频率低于完整鱼体游泳时的频率(Callahan等人, 2019; McDearmid和Drapeau, 2006)。sim1a启动子（Tg(sim1a:loxPDsRed-loxP-DTA)）是V3神经元的标志物（Borowska等人，2013年）。为了仅特异性消融脊髓中的V3神经元，我们将Tg(sim1a:loxP-DsRed-loxP-DTA)与脊髓特异性Cre驱动系Tg(hox4a/9a:Cre)进行杂交（Kimura和Higashijima，2019年）。我们通过将这些鱼与Tg(vGlut2a:GFP)回交来验证消融效果，结果显示5-6天post-fertilization（dpf）的幼鱼脊髓中腹侧谷氨酸能神经元减少了85%（图6A），这与我们之前的发现一致，即大多数腹侧谷氨酸能神经元为V3神经元。为了诱导不同的游泳速度，我们将幼鱼置于76.2×15.7毫米的实验容器中，通过以不同速度呈现移动光栅来引发视动反射（OMR），同时用高速摄像机监测其行为（图6B）。

图5. V3神经元的光遗传激活幼体神经元可增强脊髓化斑马鱼的游泳能力。（A）脊髓节段的侧面观。（B）实验装置示意图。（C）自发的和光遗传诱发的尾部摆动神经元。实验在100毫摩尔NMDA条件下进行。关于摆动持续时间和游泳强度，而非搏动频率。（E）光遗传刺激延长了摆动持续时间，阴影区域代表均值标准误差。（蓝色）(N=10 fish)，经20次重复取平均值，在通道视紫红质（ChR）刺激期间不同浓度的NMDA条件下（D）随着NMDA浓度升高，摆动概率的平均值；统计模型详见补充表S1。箭头表示通道视紫红质（ChR）刺激。100毫摩尔NMDA存在下的振荡。蓝色。Tg(vGlut2a:loxP-DsRed-loxP-ChR-GFP; nkx2.2:Cre)幼体在V3神经元中表达通道视紫红质-绿色荧光蛋白（ChR-GFP）比例尺，20微米。

被消融V3神经元的幼虫未表现出任何明显的形态或行为缺陷，且与对照组幼虫相比，其游动启动频率略有升高（消融组：0.78±0.03赫兹，对照组：0.63±0.03赫兹；均值±标准误；(N=28) 为消融组样本编号，40个对照组样本，(p=0.003) 为对照组样本编号，双样本t检验）。因此，我们试图通过分析多项运动学参数，探究其游动行为或运动学特征是否存在细微差异（图S6）。为了将自由游动行为与电压成像和光遗传激活的实验结果进行对比，我们测量了不同光栅速度下每次游动的速度和持续时间。结果发现，对照组幼虫的游动速度随光动反射光栅速度的增加而持续提高（斜率：0.51±0.06，均值±标准误），而V3神经元消融组的幼虫，其游动速度对光动反射速度的依赖性显著降低（斜率：0.17±0.09，(p=0.0001)）（线性回归模型的详细说明见《STAR方法学》）。这一结果表明，与对照组相比，V3神经元消融的幼虫调节自身游动速度的能力更弱。V3神经元的消融对游动持续时间无显著影响（野生型：175±3毫秒，敲除型：180±4毫秒），对尾鳍摆动频率的影响也极小（野生型：21.1±0.1赫兹，敲除型：21.6±0.3赫兹）（图6C）。

图6. V3神经元是游泳速度适应所必需的。(A) 未表达Tg(hox4a/9a:Cre)（左图）和表达Tg(hox4a/9a:Cre)（右图）的Tg(vGlut2aGFP; sim1a:loxP-DsRed-loxP-DTA)斑马鱼脊髓侧视图。从腹侧脊髓中未检测到表达DsRed的细胞可看出，Cre的表达导致大多数V3神经元消失。比例尺为20毫米。(B) 行为测试装置示意图。自由游动的幼体从下方接收移动光栅刺激，从上方进行记录。(C) V3神经元被消融的幼体在响应OMR光栅速度变化时，其游动爆发速度的调节能力降低，但尾拍频率和游动爆发时长无差异。每个点代表一条斑马鱼的中位数；直线代表所有斑马鱼的平均值；误差棒代表均值标准误。实验包含48条被消融的斑马鱼（编号(N=28)）和40条对照斑马鱼。另见图S6。统计模型参见表S2。

讨论

用于绘制斑马鱼脊髓神经动态的电压成像

在动物行为过程中对大量神经元进行同步电压成像是一种强大的方法，可用于表征神经元的全部功能活动模式神经动力学并推断可能的环路机制，但将其用于解析环路机制的相关应用仍较为稀少（Fan 等人，2020）。通过结合光片电压成像与虚拟现实环境中的虚拟行为，我们在斑马鱼脊髓中鉴定并表征了不同的功能亚群。电压成像是本研究中的关键工具因为基础行为（尾部振荡）的速度远快于 (Ca^{2+}) 的成像动力学，且阈下电位是分析的关键组成部分。

斑马鱼脊髓非常适合通过电压成像进行分析，因为其细长的形态与高速成像所需的狭长相机视场相契合；此外，光片显微镜可在体内实现光学切片，具备高灵敏度和良好的背景抑制效果。此外，电压噪声比（VNR）记录和闭环虚拟现实（VR）环境使得研究人员能够在运动伪影极少且仍能诱发自然行为的实验样本中，探究自然状态下的神经动力学。电压噪声比（VNR）记录为同步不同焦平面、不同视场以及不同实验动物所测得的神经活动提供了方法。

我们研究方法的主要局限性在于，即便采用1千赫兹的记录速率，背侧振荡神经元的快速锋电位也仅在表达量最高的神经元中能在噪声之上被检测到。要可靠地研究这类神经元的锋电位活动，还需进一步提升传感器的速度、亮度、灵敏度与表达效率，并改进高速成像系统。理论上，光片电压成像可覆盖斑马鱼整个脊髓（我们当前的视场主要受限于可用激光功率），且随着光学技术的发展，有望同时记录相当一部分神经元的活动（尹等，2020；张等，2021b）。

斑马鱼脊髓中的兴奋性活动

我们鉴定出了在慢速向前游动过程中具有活性的三类主要谷氨酸能神经元：振荡神经元、背侧非振荡神经元和腹侧非振荡神经元。振荡神经元极有可能是V0v和V2a神经元，已有研究表明它们是驱动斑马鱼幼鱼中枢模式发生器（CPG）的主要兴奋性来源（Ljunggren等人，2014；McLean等人，2007，2008）。研究证实V0v和V2a神经元的募集具有频率依赖性，且V0v神经元在较高游泳频率下会被抑制。由于本实验主要诱导的是低频游泳，因此我们在分析中未对这两类神经元进行区分。

通过测量阈下膜电位，我们绘制了整个脊髓及沿脊髓方向上振荡亚群的相位。波动式运动由运动活动和肌肉收缩沿脊髓呈线性相位梯度产生（格里德纳等人，1993年；马西诺与费奇科，2005年）。我们的记录显示，在兴奋性运动前中间神经元层面，也存在类似的相位梯度和活动传播。

一部分非振荡背侧神经元在游泳间隔期产生锋电位，而在游泳过程中保持沉默（图S3）。感觉输入通常在脊髓的背侧部分接收。感觉门控已在多种感觉系统中被报道，包括斑马鱼的皮肤触觉输入（克诺勒、德拉波，2014）。我们推测，这些间隔期活跃的神经元可能接收在运动过程中被分流的感觉输入。本研究数据集为探究感觉输入在脊髓中间神经元中的作用及其在行为过程中的门控机制提供了基础。

腹侧非振荡群体主要由V3神经元组成，根据共表达数据，这一比例至少为76%实验（图S4）中，且在基因敲除实验中至少达到85%（图6A）。据我们所知，V3神经元是首个被鉴定出的运动相关脊髓神经元群体，其以紧张性放电模式活动，而非与中枢模式发生器（CPG）相位锁定。非振荡性活动可能源自脑干传来的紧张性输入，也可能源于接收脊髓双侧的局部异相兴奋。我们在V3神经元中观察到的偶发性相位锁定抑制现象表明，它们可被具有周期计时精度的信号调控。这种抑制在执行快速校正运动或在运动过程中切换至高频游泳模块时可能是必需的，这需要慢速游泳神经回路的协同失活。已有研究证实，V1抑制性神经元可在高频下通过同相抑制使慢运动神经元沉默，且可能是V3神经元相位锁定抑制的来源（木村及东岛，2019；森古普塔等，2021）。形态学重建显示，腹侧谷氨酸能神经元至少可分为两类，可通过其下行轴突或分叉轴突加以区分研究还在小鼠脊髓中发现了不同的形态亚型，其中存在种类更多的V3神经元（布莱克洛斯等人，2015；乔佩克等人，2018；张等人，2008）。有趣的是，成年小鼠的V3神经元主要为连合神经元，而在胚胎发育阶段，大部分V3神经元为同侧下行神经元（布莱克洛斯等人，2015）。这类神经元与斑马鱼幼体中的下行神经元更为相似，目前尚不清楚成年斑马鱼体内是否会出现更多类型的连合神经元。

V3 神经元作为游泳强度的调节因子

我们在自由游动的斑马鱼身上开展的实验表明，V3神经元是斑马鱼追踪光流光栅速度变化所必需的。总体而言，V3神经元消融对幼鱼游动行为的影响相当轻微，且与光遗传激活实验的效果并非完全相反。基因敲除动物或许能通过两种方式弥补V3神经元活性的缺失：一是在游动过程中调整运动指令，二是在发育阶段改变神经环路的特性。而在脊髓离断的光遗传激活实验模型中，这两种机制均无法发挥作用。鉴于慢性操作与急性操作之间存在多种镜像效应的案例（例如Cregg等人，2020年；Dougherty等人，2013年，但也可参考Otchy等人，2015年），我们认为运动信号的直接代偿是导致敲除表型轻微的最可能原因，不过这一假设仍有待验证。我们也无法排除少量非V3神经元参与光遗传激活效应的可能性。

我们的电压成像和光遗传实验表明，V3 神经元的功能并非沿经典的频率-速度轴发挥作用（Callahan 等人，2019；Müller 和 van Leeuwen，2004；Severi 等人，2014），而是通过调节游泳强度来实现功能。近期一项利用激光消融 V3 神经元的研究也提出，V3 神经元活动对运动神经元存在非频率依赖性的影响（Wiggin 等人，2021），这提示 V3 神经元可能通过调控运动神经元的募集来调节游泳强度。这一发现表明中枢模式发生器（CPG）存在互补的调节模式，大致分别对应频率调制和幅度调制，二者与独立的模式与节律生成这一理念已被提出。哺乳动物的振幅调制被认为由最后运动神经元介导（基恩，2006年），这一研究提出了相关假说：斑马鱼中的V3神经元可能直接与运动神经元相接触，这与在小鼠中得到的研究结论相似（乔佩克等人，2018年；张等人，2008年）。在斑马鱼中，研究还发现慢泳阶段运动神经元会受到多巴胺能的直接作用，从而实现频率非依赖性振幅调制（贾和蒂鲁马拉伊，2020年）；而在更高的周期频率下，V2a中间神经元的亚群也参与了这一过程（梅内劳和麦克莱恩，2019年）。综合来看，这些研究结果表明振幅调制是一种普遍的调控模式，其实现机制可能存在多种不同的途径。

尽管我们的光遗传实验表明，V3神经元的激活足以触发游泳动作（在存在NMDA的情况下），但虚拟游泳和消融实验显示，V3神经元的活动并非游泳所必需的。具体而言，在虚拟游泳实验中，低强度的游泳动作往往在视野内没有任何V3神经元放电的情况下发生（图3）；而在缺失V3神经元的自由游泳鱼体中，动作启动的速率实际上略高于同系对照组。这些观察结果表明，V3神经元并非生理条件下动作启动的主要驱动因素，而是在动作启动后用于调节其强度，或许还用于维持持续的游泳动作。

对成年小鼠的实验和建模研究表明，V3 神经元对于协调左右两侧的神经活动具有重要作用（Danner 等人，2019；Zhang 等人，2021a、2008）。V3 神经元还参与将腰部和颈部节律发生器切换至更高速度的调控通路；V3 功能受损会导致运动速度变慢（Danner 等人，2019；Zhang 等人，2008、2021a）。这一结果与我们的数据在定性上一致，即 V3 基因敲除的斑马鱼难以在更高速度下游泳，不过由于斑马鱼中不存在类似的速度调控通路变化，直接进行对比存在一定难度。

尽管目前尚不清楚小鼠体内V3神经元的体内募集模式，但V3神经元活动的模型假定其存在节律性活动，且该活动与脊髓节律发生器保持相位锁定（Danner等人，2019；Zhang等人，2021a）。我们的研究数据表明，在斑马鱼幼体中，V3神经元并不具有节律性活动，因此其在小鼠中所提出的直接参与同步化的作用不太可能成立。V3神经元在四足动物与轴向运动中可能发挥不同的作用，因此在不同物种中的募集方式也存在差异。此外，其募集模式可能会在发育过程中发生变化，而斑马鱼是研究这一可能性的理想模型。

斑马鱼幼鱼可在多次运动中表现出运动学习能力，以调整运动输出以适应不断变化的环境条件（Ahrens 等人，2012；Kawashima 等人，2016）。运动学习的记忆成分依赖于中缝背核的5-羟色胺能活动，但5-羟色胺能调制的靶标尚不清楚。我们的研究数据提出了这样一个假说：5-羟色胺可能通过作用于V3神经元（直接或间接）来调节脊髓的增益。

本文所述的工具和方法为研究（虚拟）行为过程中的脊髓环路动态提供了独特视角。体内测量对于识别自然放电模式至关重要。这些方法有望推广应用于其他脊髓感觉和运动神经元群体。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。