题目：Kinematically distinct saccades are used in a context-dependent manner by larval zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39236716/

期刊：Current Biology

研究亮点

l 对数千次快速眼球运动进行运动学分析，揭示了五种扫视类型

l 共轭扫视具有至少四种可明确的视觉功能

l 会聚性扫视与身体运动相协调，以便将猎物目标聚焦于中央凹

l 独特的主序列关系意味着扫视类型特异性的神经控制

摘要

扫视是所有拥有良好视觉的物种都会使用的快速眼球运动。在本研究中，我们旨在全面表征斑马鱼幼体水平扫视的全部类型，以深入了解其在视觉引导行为中的作用及潜在的神经控制机制。我们识别出五种扫视类型，它们由运动学和双眼协调的系统性差异所定义，且在多种行为情境中呈现出差异化的表达特征。共轭扫视构成了一个大类，至少具备四种功能，包括视动性眼球震颤的快速相、静止个体的视觉扫描，以及配合身体转动调整注视方向。此外，我们还发现了一种此前未被报道的眼-身协调模式：在向前运动过程中，小型共轭扫视会部分抵消头部转动，从而维持注视稳定。会聚扫视则与身体运动相协调，用于在捕猎过程中使黄斑对准猎物目标。详细的运动学分析表明，共轭扫视与会聚扫视在眼球与身体的毫秒级协调上存在差异，且遵循不同的速度主序列关系。这一发现对“所有水平扫视均由同一脑干回路控制”的主流观点提出了挑战，同时也表明不同类型的扫视受到特异性的神经调控。

引言

扫视是一种短暂但速度极快的眼球运动，从螃蟹、乌贼到小鼠、灵长类等各类物种和门类中均能观察到。其作用是在注视点之间快速转移视线方向，并在代偿性眼球震颤（前庭眼反射和视动反射[OKRs]）过程中间歇性地使眼球重新居中。大多数物种会将扫视与头部转动相协调，但在有中央凹的动物中，扫视也可独立于头部运动，用于连续转移注视点，以对视觉环境进行高空间频率的采样。 关于扫视的运动学特征及其背后的神经生理学机制，人们已有大量研究。 尽管扫视的潜伏期、持续时间和速度会因头部活动状态（自由活动或被固定）环境明暗度、目标类型（可见目标或记忆目标）7而发生变化，但普遍认为所有扫视均遵循相同的运动学规则，且由同一脑干回路产生。有观点认为，扫视是一种最优的视觉采样策略，注视点的时间和位置反映了特定认知任务中注意力的分配情况。 此外，针对人类自然行为的研究表明，扫视受自上而下的控制，主要是将中央凹视线导向与任务相关的物体，这一过程由后天习得的世界内部模型塑造，旨在降低高优先级环境变量的不确定性。 因此，眼球扫视运动能够为某一物种的视动策略和认知过程提供重要见解。

斑马鱼幼鱼是神经科学研究中的重要模型，已被用于研究动眼行为的发育和神经调控。大多数关于扫视的研究聚焦于受束缚动物的自发性共轭扫视和眼反射快速相，这些研究揭示了控制自发性扫视时间和方向的神经活动同向扫视，研究人员通过光遗传学定位了将扫视生成定位于菱脑节，并描述了扫视活跃细胞中的单眼和双眼编码机制。此外，对捕食行为的研究表明，斑马鱼会以会聚扫视和高眼位启动捕猎行为随后在整个猎物追踪过程中保持会聚。 然而，这些研究涵盖眼球扫视运动多样性的程度尚不清楚，且针对扫视运动学的研究也很少。

本研究旨在通过测量被固定和自由游动的幼体斑马鱼在多种视觉运动行为中发生的快速眼球运动，来完整描述其扫视运动的全部类型。我们根据运动学和双眼协调的系统性差异，区分出了五种扫视类型，并发现这些类型在不同行为情境下的参与度存在差异。共轭扫视构成了一个大类，具有四种可明确的视觉功能，其中包括在转向和向前运动过程中与头部/身体旋转形成两种相反的协调模式。会聚扫视则与捕猎过程中，斑马鱼幼鱼会通过眼球转动做出目标导向的扫视移位，以将猎物聚焦于中央凹。高时间分辨率的记录显示，共轭扫视与会聚扫视在双眼眼球运动和眼体协调的毫秒级计时上存在差异，且值得注意的是，二者遵循不同的速度主序列关系，这表明它们由不同的神经活动模式调控。总体而言，本研究揭示了斑马鱼幼鱼所采用的视运动行为策略，并为扫视及眼体协调的神经环路控制机制提出了相关假说。

结果

斑马鱼幼鱼眼跳运动库的特征分析

为了估算斑马鱼幼鱼扫视眼动的全部运动模式，我们追踪了自由游动和被固定的幼鱼在多种行为中的活动情况。被固定的幼鱼（图1A）接受了包括全视野漂移光栅在内的视觉刺激，这类刺激可诱发视动性眼球震颤（OKN，其包含向特定方向的慢相转动）带有间歇性快速“重置”扫视的视觉运动调节以及视动游动，这类小型、类似猎物的移动斑点会引发包括会聚扫视在内的捕猎反应以及黑暗闪光和逼近刺激，这些刺激会引发大角度转向和躲避游动。 自由游动的幼体斑马鱼为允许其探索一个竞技场并捕食活的猎物。

我们描述了快速眼动的运动学特征，首先聚焦于来自附着式动物的数据集，在这些数据集上我们能获取极高质量的追踪数据（(= 152) 幼虫，受精后67天）。首先将推测的快速眼动检测为眼在头部的位置（以下简称眼位）时间序列与阶跃滤波器卷积过程中的峰值（图1B）。随后，针对每个事件，我们计算了九个位置和速度指标（图1C；STAR 方法）。我们指出，推测的扫视事件以双眼的运动为特征，以便评估双眼协调的不同模式。运动学指标包括每只眼运动的幅度和峰值速度、扫视后辐辏角度，以及一个描述推测扫视后眼位维持程度的指标（最大位置变化量与幅度的差值）。接下来，我们使用均匀流形逼近和投影（UMAP）将(n=213,462) 个事件嵌入二维空间（2D），并观察到嵌入空间中运动学数值呈现出平滑且系统性的变化（图1D和图S1A）。有多个区域彼此明显分离，且包含具有相似运动学分布的快速眼动。因此，我们对嵌入后的数据应用了基于密度的聚类流程，通过七个聚类标签对快速眼动进行分类（图1E）。各聚类具有独特且单峰的运动学分布（图S1B–S1D），表明该分类方案捕捉到了数据集中的主要变异模式。我们注意到，对未嵌入的数据（且未直接指定聚类数量）应用层次聚类后，得到了对扫视空间的相似描述。

这七个标签定义了五种扫视类型（其中两种被细分为向左和向右的簇），研究纳入了共轭和分离式眼球旋转两种类型，其中左眼和右眼分别向相同或相反方向运动（图1F）。共轭扫视被归为两个大簇（向左和向右的“共轭”），这些簇内的运动学特性存在连续变化（图1D和图S1）。双眼内旋的集合性扫视分为四个簇：规则集合性扫视（“集合”）和双相集合性扫视（向左和向右的“双相集合”）均会导致集合角大幅且持续升高（图S1D）；双相扫视的显著特征是一只眼睛先发生小幅颞侧旋转，随后反转方向并进行鼻侧旋转（图1F）。斑马鱼还会产生大量微型集合性扫视（“微型集合”），这类扫视仅使集合角出现小幅、短暂的升高并迅速衰减。最后，我们观察到少量发散性扫视 (("Div"))。不同扫视类型的眼球速度存在系统性差异，中位值范围从400度/秒到700度/秒以上（图1G）。

我们可以在自由游动的动物身上识别出相同的扫视类型。为了证明这一点，我们提取了相同的九项运动学数据，并将其转换至此前学习到的低维嵌入空间（8只动物的(n=9,367)事件）。尽管这一数据集规模较小，但自由游动幼体的眼球快速运动仍覆盖了整个嵌入空间，且可通过相同的七个标签进行分类（图S2A）。对眼球位置轨迹的观察证实，与束缚状态下的动物相比，这些扫视具有相似的特征，包括双眼协调模式（图S2B）。

图1.扫视检测和分类。星号（*）表示（A）系留行为跟踪的插图和扫视术语的关键。（B）来自示例60 s实验纪元的眼睛位置时间序列数据。向上偏转对应于两只眼睛的向右旋转（即左眼鼻和右眼颞叶）。下图显示了具有阶跃函数的眼睛位置的卷积；快速眼球运动被检测为该轨迹中的峰值，用虚线表示。在此纪元期间，漂移光栅呈现在动物面前以唤起视动力反应，如所示。（C）示例快速眼球运动的位置（顶部）和速度（底部）指标的子集（B中的灰色阴影表示该事件的时间）。括号中的字母表示左眼或右眼。有关详细信息，请参阅STAR方法。（D）嵌入2D UMAP空间并通过归一化动眼指标着色的快速眼球运动（来自152只动物的213,462个事件）。图S1中显示的其他指标。（E）由扫视类型标签着色的相同UMAP嵌入。双相会聚扫视期间眼速的逆转。（F）顶部：对于每种扫视类型，绘制500个眼睛位置轨迹，并以粗体覆盖中值。底部：单个示例扫视。（G）所有扫视类型的眼速。每只动物的平均值以中值（IQR）绘制的数据（((n=152))

扫视类型的使用具有情境依赖性

扫视眼动具有多种视觉功能。因此，我们接下来研究了幼体斑马鱼的扫视类型如何在不同行为情境下被利用。

共轭扫视是最常见的快速眼动类型（在束缚和自由游泳的动物中均占所有扫视的70%；图2A；表S1、S2和S3）。与所有扫视类型的情况一致，共轭扫视通常伴随一次游泳动作（图2B），但静止的动物也会产生这种扫视（图2C和2D）。当束缚或自由游泳的动物发生向左或向右转向（“游泳左/右”）时，我们观察到相同偏侧性的共轭扫视频率升高，这表明它们有助于协调眼体的注视转移，与此前的研究结果一致。当向斑马鱼幼鱼呈现漂移光栅以诱发视动反射时，幼鱼常产生与全场运动方向相反的共轭扫视，且不伴随游泳动作，这说明共轭扫视是使眼球在眼眶内重新居中的快速阶段（图2C）。

会聚性扫视是捕猎行为的一个标志性特征，且与以往研究一致，我们观察到，当斑马鱼幼鱼面对并朝向小型类猎物移动斑点时，常规会聚扫视和双相会聚扫视的发生频率均有所升高（图2C）。会聚扫视也会以较低的频率“自发”出现， 而且这类运动还相当频繁这种反应常由逼近的刺激引发，尤其是在扩张的光斑还较小时（((<30^{circ }))），且该光斑大概率被感知为类似猎物的刺激。在大多数情况下观察到微型收敛扫视（图2C和2D），使其作用相当不清楚。然而，它们很少在系留、静止的幼虫中观察到。发散性扫视不常见，但在对隐现刺激的反应中以较高的频率发生（>30），与组合在动物身后重定向凝视的作用相兼容与该刺激引发的大角度回避转向相关。它们也会出现在捕猎序列的末尾，以脱离高度会聚的凝视捕食模式；因此，我们观察到幼虫完成捕获攻击或终止猎物追踪后会出现发散性扫视（图2E）。

由于共轭（Conj）和会聚性（Conv 与 BConv）扫视的幅度范围相近，但在不同行为情境下的使用频率存在显著差异，因此本研究后续部分将聚焦于这两类扫视。具体而言，我们分析了这些扫视的相关特征与游泳动作相协调以产生注视转移，并对比它们的详细运动学特征，从而推断出潜在的神经环路活动。

图2. 扫视的情境性运用。(A)系留和自由游泳数据集下每种扫视类型的占比（(n=152) 系留样本与 (n=8) 自由游泳幼体的中位数和四分位距）。(B) 每种扫视类型下，扫视发生后200毫秒内出现游动的概率。(C) 系留幼体在指定情境下，对应每种类型的扫视占比。向前游动（Swim F）；右/左游动（Swim R/L，尾部弯曲绝对值 (angle ≥25^{circ} ))）；左/右向OKR光栅且无游动（OKR-L/R）；小型类猎物移动光斑（prey spot）；朝向类猎物刺激的首次定向转向（orient to spot）。(D) 自由游泳幼体在指定情境下，对应每种类型的扫视占比。向前游动（Swim F）；右/左游动（Swim R/L，朝向绝对值 (change ≥10^{circ})）。(E) 以发散性扫视收尾的捕猎序列示例，该发散性扫视同时伴随捕获游动（左图）或终止游动（右图）。另见表S1、表S2和表S3。

共轭扫视与游动协同，用于视线转移和视线维持

在许多物种中，有计划的视线转移是通过眼睛和头部的协同运动实现的，但在某些物种中，当头部/身体处于静止状态时，仅靠扫视就能重新调整视线。由于斑马鱼的共轭扫视既伴随游动也可独立发生，我们接下来探究了它们促成视线变化的具体方式。

斑马鱼在静止状态下会产生振幅最大的共轭扫视。无论是“自发性”共轭扫视还是视动快相（即不伴随尾部运动的扫视；图S1E-S1H），这一点都很明显。此外，通过同步游泳概率（定义为扫视开始后200毫秒内的游泳动作）编码的扫视振幅二维直方图显示，在被固定的斑马鱼中，振幅超过20度的共轭扫视几乎不会伴随身体运动（图3A）。在自由游泳状态下也观察到了这种关系（图S3A），只是频率较低，因为可以自由活动的幼鱼很少有静止的时间。这些观察结果表明，斑马鱼仅通过眼球扫视运动就能重新调整注视方向，并且在静止状态下，大振幅的共轭扫视使其能够维持视觉探索、扫描周围环境。

接下来，我们研究了与游动同步的扫视运动的运动学特征，并观察到眼睛与身体重新定向之间存在两种截然不同的关系。首先，我们发现向左和向右的转向通常伴随共轭扫视，使注视方向向同一方向偏移（图2）。为了更详细地研究这一现象，我们绘制了自由游动幼体的身体方位变化与扫视眼动产生的版本变化的关系（版本描述共轭眼位，是左眼和右眼位置的算术平均值）。结果显示，当身体方位变化超过10度时，大多数（86.2% [80.1%–88.5%]，中位数四分位距[IQR]，(n=5,869)）变化都伴随了相同偏侧性的共轭扫视（图3B）。尽管版本变化与身体旋转((Pearson's rho =0.09) (p=2.1 ×10^{-9})）存在弱相关性（图3B，右上和左下象限），也与整体注视偏移（(rho =0.20)，(p=2.2 ×10^{-37})）存在弱相关性（图S3C），但注视偏移后的眼位始终朝着运动方向位移（图3C）。具体而言，在88.7%（81.7%–92.2%）的注视偏移中，扫视后的版本与转向方向一致（这类偏移中身体方位的绝对变化均超过10度）。我们还通过将扫视后的版本按身体重新定向进行颜色编码（图3D）（或对束缚状态的动物按游动偏侧性编码；图S3B）来验证这一结果，发现终止于主眼位置右侧的向右共轭扫视与向右游动相关。总之，斑马鱼通过眼球和身体的协同运动来转移视线，并将其视野朝向自身移动的方向（图3E）。

我们还发现斑马鱼存在第二种出人意料的眼-身体协调模式，即共轭扫视与对侧偏侧的游动相配对。例如，向右的共轭扫视有时会与向左的身体运动同时发生。当身体朝向的变化幅度较小时——即处于可被视为“向前游动”的范围内(<10^{circ })（图3B右侧），这种现象尤为明显。这些眼球运动属于扫视而非由代偿性脊髓-眼球耦合产生的摆动，这一点既通过原始眼球追踪数据得到证实（图3F），也经速度主序列关系分析得到验证（见下文）。眼球旋转的变化幅度约为游动导致的身体朝向变化的一半(gradient =-0.43)、(R^{2}=0.39)（图3B右侧）。通过计算扫视-游动事件前后眼球发出的视线交点，我们估算出这些反向共轭扫视的作用是稳定距离斑马鱼17毫米（4个身体长度）的视觉平面（图3G和图S3E）。由此可见，斑马鱼似乎会利用小幅共轭扫视来补偿身体旋转，从而在向前游动过程中保持对附近物体的稳定视觉感知。

总之，斑马鱼幼鱼在四种情境下会使用共轭扫视（图3H）：（1）视动眼震的快速相用于重新调整眼球位置；（2）静止的斑马鱼幼鱼会产生大振幅扫视，这可能有助于视觉探索；（3）与身体同侧转向同步的扫视用于转移注视方向；（4）在向前运动过程中，与身体旋转方向相反的小幅扫视有助于维持注视。

图3. 静止的动物会产生共轭扫视，且扫视与游泳动作相协调，以转移或维持注视。（A）扫视幅度由伴随游泳的概率编码（数据来自152条系留幼体）。(B) 左图：眼位变化（左右眼振幅的平均值）与身体朝向变化的关系（来自8条自由游动鱼的5869次扫视）。虚线表示向前游动（((-10 ≤Delta ori ≤10^{circ}))）与转向的阈值。右图：放大区域，突出显示维持注视的共轭扫视。对身体朝向反向的扫视且满足(|Delta oril <10^{circ })条件的扫视进行线性拟合（(gradient =-0.43)、(R^{2}=0.39)、(n=820)次扫视，P值，t检验）。(C) 扫视后眼位（左右眼位置的平均值）与身体朝向变化的关系。

会聚性扫视使视线能精准转移至中央凹捕捉猎物

斑马鱼捕食行为的一个显著特征是，所有捕食动作均以一次会聚性扫视和一次高频率为开端散度角随后在整个猎物追踪过程中保持不变。有研究表明，扩大双眼视野的范围和贴近度，或许能支持一种简单的立体视觉机制，用于在捕食攻击即将发生的瞬间判断与猎物的距离。然而，当幼虫首次开始捕猎时，会聚性扫视往往会偏向一侧猎物，这增加了它们有助于双眼视觉的可能性从猎物追踪的最初阶段就确定目标。因此，我们研究了在朝向猎物的过程中，扫视是如何与身体动作协调配合的。

斑马鱼通过常规和双相会聚扫视启动捕猎程序（图4A）。常规当猎物位于前视野((mean azimuth =0.4^{circ})，平均绝对azi(muth =52.9^{circ})）时，使用收敛扫视，而对更偏心的猎物的反应涉及向左或向右的双相收敛扫视（平均(azimuth =1.8^{circ})，平均绝对(azimuth =88.2^{circ})）。通过增加收敛，收敛扫视使双眼视野的大小增加了一倍多（从19-47）（图4B）。此外，后扫视版本与身体重新定向平滑地配合变化，这样更大的转弯与更偏侧的自我中心凝视相关联（图4C）。因此，会聚性扫视同时具有增加双目视野范围和水平移位注视与身体运动合作的收敛和版本组件。

为了评估幼虫如何在目标导向的掠食性目光转移的背景下控制收敛的扫视和伴随的身体运动，我们分解了对猎物的第一个定向反应（来自六只动物的188个个体狩猎时期）。我们将猎物的位置（水平面中的角度）映射到凝视参考坐标系统（图4D，插图）并评估了身体旋转、身体平移以及眼球扫视运动对将视线重新对准目标的具体作用（图4D）。我们发现斑马鱼会根据猎物位置平稳调节这三个组成部分（图4E和4F）。身体旋转（偏航角）对以视线为参照的猎物位置变化贡献最大，其幅度约为初始猎物方位角的一半（(gain =0.54) [0.49–0.60]，中位数[四分位距]，(N=6) 条斑马鱼）。首次游动引发的头部平移（平移量）进一步使头部前轴与猎物目标对齐，增益为0.22（0.18–0.28）。最后，眼球扫视运动提供了额外的、以目标为导向的视线转移（会聚角，(gain =0.07) [0.04–0.11]）。最终，眼体联合运动使双眼视线朝着目标猎物移动，总增益达0.86（0.80–0.94）。

为了评估这三个组成部分如何影响定向反应的精度，我们评估了 prey 位置线性拟合的拟合优度（((R2))），同时依次纳入了个体重新定向的 pYaw、pTrans 和 pConv 组成部分（图4G）。pYaw 不仅增益最高，还是精度最高的运动组成部分，其中位数为 (R^{2}) 0.86（0.82–0.92）。pConv 和 pTrans 的精度较低，但并未对目标导向的视觉定向的整体精度产生显著影响（图4G）。

接下来，我们验证了定向反应的高增益足以在捕猎开始时通过双眼使猎物中央凹化这一假设。斑马鱼幼虫在腹侧颞侧视网膜中拥有一个类似中央凹的高敏区（HAA），该区域的紫外视锥细胞密度较高，被认为对可视化紫外散射至关重要散射的猎物。 通过将猎物位置投射到视网膜坐标中根据图S4A中的数据，我们估算出，在绝大多数捕猎阶段，首次定向移动会将猎物的影像移至至少一只眼睛的水平注视区域（HAA），占比为86.0%[78.6%–88.9%]，涉及6条鱼；此外，在一半的捕猎阶段中，这一首次动作足以让双眼对准猎物进行中央凹注视，占比为54.4%[41.4%–57.1%]（图4H）。

总之，会聚性扫视与身体动作相协调，以便在捕猎开始时将猎物锁定在中央凹区域。

图4.会聚扫视从狩猎开始就对猎物进行中央凹。（a）定义狩猎时代开始的收敛扫视时的猎物方位角（来自8条鱼的202 Conv和25 BConv）。（b）(n=8)鱼扫视前和扫视后的双目视野中值。红色表示动物间的中值。（c）后扫视版本与身体方向变化，最小二乘回归拟合（来自8条鱼的((n=1,178))扫视）（d）示意图说明如何计算pYaw、pTrans和pConv对猎物的定向反应。与灰色阴影区域显示的每个度量相对应的角度。右图：说明凝视参考猎物位置的示意图，定义为将眼睛之间的中点连接到（1）猎物目标和（2）双眼重叠的最近点的向量之间的角度。（e）pYaw、pTrans和pConv相对于一个示例鱼的28个狩猎时代的第一次定向反应的pYaw、pTrans和pConv。线性拟合，带有斜率和(R^{2})，显示为实线。最右边的面板显示综合眼-体定向反应（通过求和pYaw、pTrans和最后的pConv）；红色箭头表示从pYaw到完全反应的变化。在所有面板中(y=x)显示为虚线。（F和G）上：回归的斜率（F）和拟合优度（G）拟合到单个（箱线图）和累积（显示为中位数和IQR）猎物定向指标相对于扫视前猎物角度。较低：斜率（F）和拟合优度（G）的变化，加上pTrans，然后加上pConv。p值，符号秩测试。(n=6 fish.)（H）第一次定向反应之前（左）和之后（右）的鼻颞视网膜坐标中的猎物图像（来自6条鱼的188个狩猎序列）。假设每只眼睛的视场为163.30，高敏锐度区域跨越50的颞视网膜。31显示了一只或两只眼睛的HAA看到的猎物目标百分比。另见图S4。           

不同眼跳类型下双眼协调与眼体协调的独特计时规则

当眼睛和身体的协同运动重新调整视线方向时，扫视通常会比头部/身体旋转早几毫秒。然而，相对时间取决于多种因素，包括任务要求。 由于共轭扫视和会聚扫视是在不同情境下与游动行为协同进行的，我们通过分析运动时间来探究潜在神经指令的组织与协调是否存在差异。在本次分析中，我们使用了系留幼体的高时间分辨率（300赫兹）追踪数据，来估算眼间延迟和眼尾延迟（图5A及图S4B；STAR 方法）。

不同扫视类型下，眼球和尾部运动的精确时机存在差异（图5B）。对于无尾部运动伴随的共轭扫视（静止动物的扫描扫视以及OKR快速相），双眼运动之间的潜伏期较短（69.6% [60.0%–78.1%]的扫视满足该条件；以各动物个体的中位数[四分位距]计）。然而，当共轭扫视伴随游动时，眼间潜伏期显著延长，且鼻侧眼球运动先于颞侧眼球运动（眼间潜伏期为4[2-10]毫秒；(p=6.2 ×10^{-10})，与零值进行符号秩检验）。尾部运动与第一次眼球转动大致同时发生（眼尾潜伏期为2[4至0]毫秒；(p=6.6 times)、(10-4)）。对于向前运动时维持注视的扫视与配合转向转移注视的扫视，我们未观察到这些时间关系存在显著差异（图5B）。

双相会聚性扫视包含一个初始的共轭旋转，随后外展眼反转方向并向鼻侧移动（图5A示例中的右眼）。我们发现，初始共轭运动的眼间潜伏期为6（4-8）毫秒，与共轭移凝视扫视无显著差异（图5B）。随后的第二次鼻侧旋转则存在较长延迟（26[23-32]毫秒）。相比之下，常规会聚性扫视的眼间潜伏期和眼尾潜伏期均显著长于共轭扫视（眼间：11[9-13]毫秒；眼尾：10[8-12]毫秒）。

总之，斑马鱼幼体的扫视眼动在毫秒级时间尺度上与身体运动相协调。与其他物种一样，其反应潜伏期与感觉反馈不相符，这表明眼动和身体运动由共同的神经指令控制。不过，不同类型扫视的时间关系存在差异，这意味着存在不同的神经环路活动模式来协调双眼，尤其是在会聚扫视与共轭扫视中，分别协调双眼以及眼体之间的运动。

图5. 眼球与尾部运动的时间关系因扫视类型而异。(A)共轭、辐辏和双相辐辏扫视的眼与尾部运动起始时间（箭头头）示例。(B) 左图：不同扫视类型的眼-尾部潜伏期和眼间潜伏期分布。所有潜伏期均相对于首次鼻侧眼球旋转测量。数据以各(n=58)只动物的中位数（四分位距）比例呈现，并附带样条拟合曲线。中间和右图：每只动物的中位数眼-尾部潜伏期（中间）和眼间潜伏期（右）。红色点和柱形代表所有动物的总体中位数（四分位距）。ρ值来自采用Dunn-Sidak事后检验的Kruskal-Wallis检验。另见图S4。

速度分布和主序列关系表明不同的眼外运动神经元活动控制着不同的扫视类型

要产生扫视运动，眼外运动神经元会形成一种典型的脉冲-滑行-步阶放电模式：首先是一串高频脉冲放电（脉冲阶段）使眼球加速，随后放电率下降（滑行阶段），最终稳定在较低且持续的放电率（步阶阶段），以此对抗向心弹性力将眼球固定在新位置上。由于眼球运动系统的固有特性，运动神经元的活动特征可以从眼球运动的运动学。 因此，我们使用了高使用时间分辨率追踪数据评估共轭性与会聚性扫视的运动学特征，以判断它们是否可能由不同的脑干运动控制信号产生（(n=58) 系留幼虫）。

共轭扫视与辐合扫视具有不同的眼位和速度时程。对比两者共有的内收扫视眼动时，我们发现对于(amplitudes >15^{circ})，眼睛在辐合扫视时更快到达最终位置，而共轭扫视则需要更长时间才能达到最终眼位（图6A）。辐合内收扫视的速度曲线相当对称，且峰值速度随幅度逐渐增大（图6B）。相比之下，大振幅共轭扫视的峰值速度明显更低，且速度曲线呈现明显的不对称，伴有延长的尾部。这些特征表明共轭扫视存在欠动现象，表现出动态下冲，随后缓慢达到最终眼位。我们探究了这些差异是否可由眼眶初始眼位的系统性差异来解释；然而，当我们按起始位置对扫视进行分箱后，我们也观察到了共轭扫视的相同低幅度模式（图S5A）。从这些观察中我们可以推断，对于较大的共轭内收扫视，内直肌运动神经元上的“脉冲”与眼球位置所需的变化匹配度不足。

扫视眼动的一个特征性特征是“主序列”关系，即眼速随扫视幅度的增加而上升，随后达到饱和。为验证这一点，我们对单眼扫视的速度和幅度拟合了指数函数（图6C），随后计算了平均主序列关系（图6D）。结果显示，内收眼在共轭扫视与辐辏扫视中遵循不同的主序列关系（图6E；赤池信息准则[AIC]=98.1%[97.3%–98.8%]，(n=83 eyes)、(p=)、(2.7 ×10^{-14})组的中位数[四分位距]，符号秩检验）。具体而言，尽管小幅共轭扫视的速度快于幅度相近的辐辏扫视，但共轭扫视的速度会迅速饱和，在幅度超过10°时达到700°/秒的平台期。值得注意的是，维持注视型与转移注视型共轭扫视均遵循相同的主序列（图S5B），这支持了前者为真实扫视眼动、且所有共轭扫视均由神经环路活动的共同底层模式生成的观点。相比之下，辐辏扫视的速度随幅度的增加更呈线性关系（图6D）。这些结果揭示了两种扫视类型下内直肌运动神经元群体活动的不同模式。具体而言，脉冲成分在共轭扫视中达到饱和，导致峰值速度无法随幅度同步提升，而在会聚扫视中峰值速度则持续增加。

我们还分析了双相会聚扫视，以评估三种眼球运动成分是否均为真正的扫视，若是，则判断其是否由类似于会聚扫视或共轭扫视的神经控制信号所产生（图S5C-S5E）。我们观察到，第一次鼻侧眼球运动与常规会聚扫视遵循相同的主序列关系（图S5D，左）。相比之下，对侧眼的颞侧运动（幅度4.0[3.0-5.4]，中位数[四分位距]）的速度主序列与共轭扫视相当（图S5D，右）。扫视速度与幅度的线性（而非指数）拟合也支持了这一点，该拟合显示会聚扫视与双相扫视的第一次鼻侧成分具有相近的斜率（斜率45/秒），而第一次颞侧运动的斜率则大得多，相当于小幅度的共轭扫视（90/秒）（图S5E）。第二次鼻侧运动的主序列速度低于常规会聚扫视，这很可能是紧随其后的颞侧旋转导致的。综上，该分析表明，双相会聚扫视包含三个扫视性眼球运动很可能由单眼运动前指令控制的运动成分（见讨论部分）。

图6. 集合性与共轭性扫视的独特速度主序列关系以及共轭内收扫视。线条和（A和B）为不同幅度的集合性扫视与共轭性扫视的内收（鼻侧）扫视性眼球运动的眼球位置（A）和速度（B）时间序列。为58条鱼的(n=116)只眼睛的平均值±标准差。（C）单只示例眼睛的速度主序列关系及指数拟合。（D）58条鱼的(n=116)只眼睛经指数拟合后的平均速度主序列，阴影区域显示中位数（四分位距）。作为参考，数据点和线条表示每个幅度区间的眼球速度中位数（四分位距）。（E）扫视类型的拟合系数（中位数及四分位距）。另见图S5。 

讨论

通过分析自由游动和被束缚的斑马鱼幼体的数千次快速眼动，我们识别出五种扫视类型，它们在眼动运动学和双眼协调方面存在差异，且会根据环境以特定方式被调用。我们为共轭扫视定义了四种作用，包括在运动过程中分别与同侧或对侧游动行为相协调，以转移或维持注视方向。相比之下，会聚扫视在产生精准的注视转移方面发挥特殊作用，使斑马鱼从捕猎开始就能将猎物聚焦于中央凹。共轭扫视与会聚扫视在双眼及眼体协调的精确时机上存在差异，并遵循不同的速度与主序星的关系，这指向了潜在生理控制机制的差异。我们的研究与近期在自然行为中表征主动视觉的研究相契合，也补充了斑马鱼领域的最新研究——这些研究已全面界定了斑马鱼的运动行为库，并阐明了其在探索和捕猎过程中如何选择与编排游动动作。本研究通过揭示扫视用于重定向注视的时机与方式，为解析组织行为的视运动策略提供了见解，也将为探究眼球运动的神经环路控制、眼-体协调及视运动处理的实验提供指导。最后需指出，我们对斑马鱼扫视行为库的估算可能并不完整。我们仅检测了（视觉引导的）部分行为，并将分析局限于水平眼球运动。对更广泛行为的分析，以及对垂直和扭转眼球运动的追踪，或许能揭示扫视的其他类型或用途，可能还会结合俯仰/横滚姿势调整共同发挥作用。

共轭扫视与视觉探索

斑马鱼在静止时仅使用共轭扫视来重新定向视线，在视动性眼震期间则用共轭扫视来重置眼位（即快相）；在游动时，斑马鱼会协调扫视与游动动作，以改变或维持视线方向。在我们的分类中，共轭扫视的特征是双眼向同一方向转动，但左右眼运动的幅度未必相等。静止状态下斑马鱼的大幅共轭扫视中，双眼运动幅度差异十分明显，通常外展扫视的幅度更大。这类扫视会产生轻微的双眼分离，从而扩大视野，这与斑马鱼即使处于静止状态也能对周围广阔区域进行观察的功能定位相符。这些扫描扫视会减小动物视野中盲点的（时间平均）范围，且这可能是主动感知策略的一部分，例如用于采样亮度梯度。另一个并非相互排斥的假设是，这些扫视有助于克服视觉适应。无论如何，显然与其他鱼类物种类似，静止的斑马鱼仅通过扫视式眼球运动来重新调整注视方向。

共轭扫视在有中央凹和无中央凹的物种中均与头部/身体运动相协调（即“无中央凹扫视系统”），据此我们发现，幼体斑马鱼头部/身体超过10度的重新定向均与相同偏侧性的共轭扫视相伴发生。与灵长类动物不同，幅度逐渐增大的注视转移并非通过系统性改变眼睛与头部/身体的相对贡献来实现。相反，身体重新定向与整体注视转移呈线性比例关系，而眼球旋转角度的变化则具有相当大的变异性。不过，与其他物种一样，扫视后的眼球位置会向运动方向偏移。相比之下，向前游动则与相反偏侧性的共轭扫视同时发生。这一现象令人意外，因为据我们所知，此前尚未有报道描述过与头部/身体反向运动相伴随的扫视。我们认为这些是真正的扫视眼球运动，因为它们符合速度主序列规律，且先于游泳过程中补偿头部偏航的脊髓-眼球耦合反射。这些扫视通过对抗身体重新定向，有助于动物在向前运动时维持其视线方向，因此我们将其称为注视维持性扫视。乍看之下，约为身体重新定向幅度一半的扫视幅度似乎作用有限，但正如伊斯特尔等人所指出的，“完美”的补偿仅能使无限远的视觉平面保持稳定，而在浑浊的水生环境中，这可能并无实际意义。我们估算，注视维持性扫视平均能使动物前方约17毫米（4个身体长度）处的视觉平面保持稳定。此距离内的物体将呈现静止状态（更远的物体看似会随运动方向移动，更近的则反向移动），这既有助于维持稳定的视觉感知，也能在导航过程中提供运动视差线索。钙成像实验已发现菱节2和菱节3存在神经活动与尾部和眼部运动的方向相关， 但由于在这些实验中眼睛和身体的旋转高度相关，目前尚不清楚该脑区是控制其中一种还是两种运动输出。本文描述的扫视方向关联性转换清晰区分了向前游动和转向行为，为未来研究解析产生协调眼体运动程序的神经指令提供了切入点。

会聚性扫视、双眼视觉与猎物的中央凹注视

会聚性扫视是斑马鱼幼体捕食行为的一个标志性特征。规则型和双相型会聚性扫视的眼动速度均超过600度/秒；因此这类眼球运动与灵长类动物30度/秒的慢速融合辐辏运动截然不同，而更类似于灵长类动物的分离性扫视，后者用于快速调整斑马鱼会利用这些特殊的扫视式眼球运动，在捕猎时切换到捕食性注视模式，并在整个猎物追踪过程中保持高辐合角，直至完成最终的捕食攻击。就在发起攻击前，双眼会对称地达到最大辐合状态，使得双眼重叠视野的最近点直接位于幼鱼正前方，且距离双眼中点仅400微米。基于这些观察，我们提出眼球辐合可能支持一种简单的立体视觉机制，让幼鱼能够判断猎物位于自我中心空间的特定位置（即“攻击区”），并触发捕食游动；这一假设已得到精妙的晶状体摘除实验的支持。然而，由于会聚扫视在捕猎开始时出现，且朝向猎物一侧偏侧化，双眼视觉在整个猎物追踪过程中似乎还承担着其他额外作用。

本研究中，我们发现斑马鱼会根据视网膜拓扑对应的猎物方位角，平滑地控制会聚扫视的共轭（平动）分量。通过在与视觉感知相关的以注视为参考的坐标空间中分析猎物位置，我们发现眼球与身体的联合注视转移能以惊人的高增益（0.9）将双眼视野对准猎物。这种“视觉锁定”的作用是将猎物影像投射到视网膜的高分辨区（即“中央凹”），该区域的紫外视锥细胞密度更高，且具备检测紫外亮斑猎物的额外生理特化。这表明会聚扫视是实现低对比度猎物高信噪比检测的视动策略的一部分。

此外，在一半的捕猎序列中，首次定向动作就足以将猎物影像送至双眼的高分辨区。除了进一步提升检测灵敏度（最高可达2倍）外，双眼中央凹注视结合眼球位置的内部（传出副本）估算，似乎能让幼鱼通过类似三角测量的简单算法判断猎物距离。对此的佐证是，在猎物追踪过程中（距离小于4毫米时），游动力度会随猎物距离发生调节，说明幼鱼具备估算这一变量的能力。共轭扫视与尾部运动几乎同步发生，而会聚扫视则比尾部运动提前10毫秒。有研究认为，先移动眼球有助于补偿注视转移过程中视觉处理的迟缓性；若该功能成立，则意味着捕猎过程中维持猎物感知具有特殊重要性。

扫视类型特异性神经调控

本研究的一项关键发现是，共轭扫视与会聚扫视遵循不同的速度主序列关系，且在眼睛与尾部的毫秒级协调上存在差异，这共同表明二者的潜在神经控制机制存在区别。尽管这些观察结果是在被束缚的幼体身上获得的（获取高质量追踪数据的必要条件），且我们无法排除自由活动的动物体内特定运动学特征和/或协调模式可能存在差异的可能性，但它们似乎仍揭示了存在扫视类型特异性的神经回路。此前已有研究表明，扫视潜伏期和运动学特征会受到多种因素的调控文本， 以及速度主序列的斜率当眼跳伴随协调的动作时，其幅度会增加手臂伸展次，且随着任务时间延长或睡眠剥夺而减少。 此前已有研究针对自发性共轭扫视描述了速度主序列以及斑马鱼幼体的OKR快速相，将这些研究结果进一步推广可以发现，共轭扫视的所有亚型（包括与游动动作配对的视线转移型和视线保持型扫视）均符合相同的主序列关系。这一结论反过来表明，所有共轭扫视均由同一套外周回路控制，这与已有的研究结论相符关于扫视产生的既定观点。这种速度主序列在10处出现一个拐点，这与金鱼和人类等其他物种的次扫视相似。在更大的幅度下，眼球峰值速度几乎不再进一步增加，这表明眼外运动神经元活动的相位脉冲成分达到了上限，无法再随注视位移幅度的变化而成比例调整。这与我们在速度时程中观察到的显著不对称性一致，即在初始快速加速后，测量不足的共轭扫视以慢得多的“滑移式”眼球运动达到最终眼球位置，这一过程很可能发生在运动神经元放电的滑动和/或步进阶段。在此，值得注意的是，近期研究揭示眼外运动神经元活动存在极宽的时间常数范围，与之匹配的是眼动装置中同样宽泛的粘弹性时间常数范围。未来，将这些模型应用于我们描述的各类扫视眼球运动，以更准确地评估其潜在神经活动，将是一项有趣的研究。值得注意的是，会聚内收扫视具有明显不同的速度特征和主序列关系。尽管小幅度（((<10^{circ}))）的扫视比同等幅度的共轭扫视速度更慢，但峰值速度在整个幅度的全动态范围内持续增加（35），这表明内直肌运动神经元上的脉冲与眼球位置所需的变化相匹配。

这些运动学差异可能存在何种生理学基础？一种可能性是，存在一类独特（或额外）的内直肌运动神经元，负责会聚扫视期间的鼻侧眼球旋转。然而，尽管这一问题长期存在争议，但目前几乎没有证据表明运动神经元在特定类型的眼球运动中具有专门的作用，更不用说针对扫视的特定亚型了。虽然眼外肌运动神经元存在两种主要类型，它们具有不同的分子特性、传入输入模式以及在眼外肌纤维上的突触终止方式，但生理学数据显示其功能特性呈现平滑的连续分布，且普遍认为所有眼外肌运动神经元都参与所有类型的眼球运动。尽管如此，眼外肌运动神经元在募集阈值、位置以及速度敏感性方面确实存在显著差异。因此，传入输入的差异可能会导致募集模式的不同，从而产生具有特定类型运动学特征的扫视眼球运动。未来，斑马鱼脑干中的神经活动记录将成为一种有力工具，可用于发现扫视类型特异性的神经元群体，并评估运动神经元活动随扫视类型和运动学变化的规律。

双相会聚性扫视

最后，双相会聚扫视的特殊特性值得特别提及。这些特性包含三个紧密相关的协同性扫视运动：首先是双眼共轭性眼球转动，随后被外展的眼球很快发生反转。人类中已观察到间隔极短的扫视现象，而双相集合性扫视中的反转现象，最容易让人联想到动态超调——这是一种常见现象，即主扫视之后会立即跟随一个方向相反的小幅次级扫视。动态超调同样属于单眼现象，通常出现在外展的眼球上，且眼球的回位运动具有扫视速度。有研究认为，神经活动的制动脉冲通常负责在扫视结束时让眼球停止，当该脉冲过大时就可能出现动态超调。同理，双相集合性扫视的产生，可能是由于正常控制（常规）集合性扫视的多个扫视指令在幅度和/或时机上出现了误差。控制双眼眼球运动的运动前指令的性质一直存在争议：赫林定律认为双眼接收相同的（共轭性和集合性）神经指令，而亥姆霍兹则主张对每只眼球进行独立控制。双相集合性扫视中，首先发生的鼻侧眼运动与颞侧眼运动遵循不同的主序列关系（分别对应集合性扫视和共轭性扫视的特征），这一事实与支持单眼控制框架的新出现的证据相吻合。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。