题目：Macrophages trigger cardiomyocyte proliferation by increasing epicardial vegfaa expression during larval zebrafish heart regeneration

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35688158/

期刊：Developmental Cell

研究亮点

l 斑马鱼幼鱼心脏再生的特征得到了详细解析

l 巨噬细胞消融会阻断心脏损伤后心肌细胞的增殖

l 巨噬细胞与心外膜细胞形成突触并促进其增殖

l 心外膜Vegfaa驱动心脏再生过程中心肌细胞的增殖

摘要

心脏损伤会导致心肌细胞丢失，在斑马鱼中，存活细胞的增殖会快速替代丢失的心肌细胞，但哺乳动物却无法做到这一点。无论是具有再生能力的斑马鱼还是无再生能力的哺乳动物，心脏损伤都会引发持续的巨噬细胞反应。在斑马鱼心脏再生过程中，巨噬细胞是心肌细胞增殖所必需的，但巨噬细胞促进这一关键过程的机制从根本上来说仍不明确。本研究利用斑马鱼幼虫心脏损伤模型中心跳同步的活体成像技术、RNA测序以及巨噬细胞缺失基因型，对巨噬细胞的功能进行了表征，并发现这些细胞会激活心外膜，进而诱导心肌细胞增殖。从机制上来看，巨噬细胞被特异性募集至心外膜-心肌微环境，触发心外膜的扩张，而心外膜会上调vegfaa的表达，从而诱导心肌细胞增殖。研究数据表明，心外膜的Vegfaa通过增强心内膜的Notch信号通路，来促进心脏发育过程中的生长途径。这一巨噬细胞依赖性心脏再生机制的发现，提示免疫调节可能是增强哺乳动物心脏修复能力的一种潜在策略。

图形摘要

引言

斑马鱼具有极强的再生能力，在组织受损后能够恢复其完整的结构与功能。心脏损伤便是典型例子之一：成年哺乳动物仅能进行病理性修复，而斑马鱼却能实现组织的完全再生。在人类中，最常见且最严重的心脏损伤类型是心肌梗死（MI），冠状动脉闭塞会引发心肌缺血性损伤，导致约 10 亿个心肌细胞丢失。成年哺乳动物的心肌细胞大多被认为是有丝分裂后细胞，在出生后不久便转向肥大性生长，因此无法修复丢失的心肌组织，该区域反而会被无收缩功能的瘢痕组织替代。由此，心肌梗死患者会出现病理性重构的后遗症，进而导致左心室扩张和瘢痕变薄，进一步降低心脏功能。因此，需要能够逆转或阻止这一过程的医疗创新。

与哺乳动物心肌梗死（MI）模型不同，斑马鱼可通过存活心肌细胞的去分化和增殖实现受损心肌的完全再生。心脏再生过程较为复杂，斑马鱼心脏会先清除坏死心肌，随后经历短暂纤维化、血管再生，最终完成心肌细胞的替代再生。研究表明，无论是在斑马鱼中，还是在美西钝口螈、新生小鼠等其他具有再生能力的物种中，炎症反应对上述每一个关键事件都至关重要。其中，巨噬细胞已被证实是组织再生的重要细胞调控因子。事实上，巨噬细胞的消融已被证明会阻碍多个器官和生物体的再生过程，包括成年斑马鱼心脏。然而，巨噬细胞在心脏修复中的具体作用仍有待进一步阐明情况因相互矛盾的报告而变得复杂，这些报告既指出了有益影响，也指出了有害影响。

斑马鱼幼鱼心脏再生模型为详细研究巨噬细胞功能提供了一个易操作的系统。斑马鱼幼鱼的再生速度比成鱼更快，3日龄幼鱼在心脏激光损伤后仅需48小时即可完成再生。结合其活体成像的适用性和遗传可操作性，该模型成为一个强大的工具，可用于深入探究巨噬细胞如何支持心脏再生的多个方面。

本研究对斑马鱼幼鱼心脏再生过程中的巨噬细胞反应及多个关键再生过程进行了深入表征，发现幼鱼与成鱼的心脏再生程序具有高度保守性。消除巨噬细胞反应后，这些细胞在清除凋亡细胞、心外膜激活以及心肌细胞增殖过程中的必要性得以显现。研究还揭示了巨噬细胞通过心外膜 Vegfaa 及下游心内膜 Notch 信号通路发挥促增殖作用的机制。本研究表明，巨噬细胞会侵入心外膜-心肌微环境，诱导心外膜细胞数量扩增，进而提升心外膜 vegfaa 的表达水平，导致心内膜 Notch 信号通路上调，最终激活心脏发育生长通路。

结果

心脏损伤后巨噬细胞表现出细胞异质性

我们首先评估了幼虫心脏损伤后巨噬细胞的异质性和募集动态。我们将斑马鱼泛巨噬细胞报告基因系 Tg(mpeg1:GFP) 与 Tg(csf1ra:gal4;UAS:mCherry-NfsB)（本文中简称为 csf1ra:mCherry）进行杂交。Csf1ra（集落刺激因子 1 受体）是一种巨噬细胞发育所必需的细胞因子，在哺乳动物中被用作巨噬细胞报告基因启动子。

受精后72小时（hpf）对幼虫心脏的心室尖进行激光处理，并在损伤后2、6、24和48小时（hpi）进行成像。巨噬细胞在2小时内迁移至受损的心室尖，在6小时达到峰值，并在48小时内持续维持较高数量。我们发现并非所有募集的巨噬细胞都同时表达两种转基因，由此形成三个亚群：（1）mpeg1+csf1ra⁻（19.3% ± 5.1%）、（2）mpeg1⁻csf1ra⁺（2.8% ± 2.1%）和（3）mpeg1+csf1ra⁺（77.9% ± 5.7%）。亚群1和亚群3表现出相似的动态变化，但由于mpeg1⁻csf1ra⁺亚群数量极少，无法确定其动态变化是否也具有相似性。这两个亚群均呈现出多种形态，且之间无明显差异，各组。值得注意的是，我们的数据表明，募集至心脏损伤部位的幼体巨噬细胞在标志物表达上具有异质性，这与成年斑马鱼的情况相似，并提示该幼体模型中的巨噬细胞反应相对更为复杂。

图1. 心脏巨噬细胞在损伤后表现出异质性和可塑性。(A)示意图展示心脏激光损伤模型，左侧标注了成像时间点，右侧标注了3天胚胎期（dpf）幼虫心脏心尖处的损伤部位（品红色圆圈）。(B) Tg(mpeg1:GFP;csf1ra:gal4:UAS:NfsBmCherry)品系（所有图中均简写为mpeg1:GFP;csf1ra:mCherry）中未损伤和损伤心脏在标准时间点的代表性侧视落射荧光图像，展示了巨噬细胞异质性；白色箭头指示心尖，虚线为心脏轮廓。(C) 未损伤和损伤幼虫在标准时间点心室上csf1ra+mpeg1+、csf1ra-mpeg1+和csf1ra+mpeg1+巨噬细胞数量的定量分析，(n=10-12)。(D) 不同形态csf1ra-mpeg1+和csf1ra+mpeg1+巨噬细胞的光片荧光显微镜（LSFM）代表性图像。(E) tnfa+mpeg1+和tnfa-mpeg1+巨噬细胞的光片荧光显微镜（LSFM）代表性图像。

心脏损伤后巨噬细胞表现出细胞可塑性

为了探究巨噬细胞在斑马鱼幼虫心脏损伤模型中是否具有可塑性并转化为促炎表型，我们对 Tg(tnfa:GFP;mpeg1:mCherry) 幼虫进行了心脏激光损伤实验。对 tnfa+ 巨噬细胞数量的定量分析显示存在一个短暂的 tnfa+ 亚群（占 mpeg1+ 巨噬细胞的 19.3% ± 4.9%，19.3% ± 4.9% of mpeg1+ macrophages, (n=24)），该亚群仅在损伤后24小时（24 hpi）出现，在未损伤的幼虫中极少存在。值得注意的是，csf1ra+ 巨噬细胞也会表达 tnfa，且比例更高（占巨噬细胞的 30.8% ± 8.1%）。我们还观察到，从损伤后24小时开始，巨噬细胞会收回伪足并变为球形，这进一步表明其表型发生了转变。

我们推断，如果 tnfa⁺ 巨噬细胞确实是炎性巨噬细胞，那么施加 M1 极化细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）会增加其丰度。在心脏损伤前立即单次静脉注射斑马鱼重组蛋白 IFN-γ-rel，可将 tnfa⁺mpeg1⁺ 巨噬细胞的比例从 PBS 注射对照组的 26.4%±11.0% 提升至 78.8%±9.5%，这支持了这些细胞为炎性巨噬细胞的结论。

此外，对跳动心脏进行的活体体内成像显示，募集的巨噬细胞到达受损心室后会转化为 tnfa:GFP+ 阳性细胞，这证实了这代表了真实的原位转化。综合来看，这些数据表明，与成体中一样，巨噬细胞具有可塑性，并会响应幼体心脏损伤而转变为炎症型细胞。

斑马鱼幼鱼心脏激光损伤的结构与成年斑马鱼冷冻损伤相似

为验证幼虫损伤模型中巨噬细胞功能的分析结果，我们接下来旨在确定激光损伤是否与成年斑马鱼冷冻损伤及哺乳动物心肌梗死具有可比性。我们使用了品系 Tg(myl7:mKateCAAX;myl7:h2b-GFP)，该品系可分别标记心肌细胞膜和染色质。观察发现，损伤发生后，形成了一圈具有固缩核的心肌细胞。这些固缩核在损伤后6小时（hpi）呈TUNEL阳性，证实了细胞凋亡的发生，且它们环绕在绿色荧光蛋白（GFP）阴性的损伤区域周围。心跳同步光片荧光显微镜（LSFM）成像显示，细胞核浓缩发生得极快，在损伤后1.5小时即可被识别。

我们推测激光损伤的GFP中心区域可能包含损伤后立即发生坏死的细胞。为验证这一假设，我们在损伤后立即通过静脉注射碘化丙啶（PI）对坏死细胞进行标记（((<0.5 hpi))）。我们发现GFP区域确实存在PI阳性细胞，且损伤后1小时（1 hpi），PI阳性的细胞碎片已分散在近端心肌组织中。对注射PI的损伤型Tg(mpeg1:GFP;myl7:h2b-GFP;myl7:mKateCAAX)心脏进行延时成像显示，坏死细胞在损伤后0至2小时内被快速清除。坏死细胞要么自行解体，要么被挤出心肌进入心包腔，这一过程不依赖巨噬细胞的接触。总体而言，该特征验证了激光损伤的结构与成年斑马鱼冷冻损伤及哺乳动物心肌梗死中观察到的坏死梗死灶和凋亡边缘区一致。

图2. 巨噬细胞对于及时清除凋亡心肌细胞是必需的。（A-C）（A）未损伤和损伤的 Tg(myl7:h2b-GFP;myl7:mKateCAAX) 心室图像。青色框选的放大区域突出显示浓缩的细胞核（白色箭头）。（B）Tg(myl7:h2b-GFP) 和（C）Tg(myl7:GFP) 幼虫在损伤后6小时（hpi）经 TUNEL 染色的心脏图像。白色箭头头指向凋亡的心肌细胞/心肌组织。（D）损伤后1小时（hpi）经碘化丙啶（PI）染色的 Tg(myl7:h2b-GFP) 心脏图像。白色箭头头指向坏死碎片。（E）未损伤和损伤的 (irf8 ^{+/+}) 及 (irf8 ^{-1-}) 品系 Tg(myl7:h2b-GFP) 心室在损伤后24小时（hpi）经 TUNEL 染色的图像。白色箭头头指向 TUNEL 阳性细胞。（F）不同巨噬细胞消融模型损伤组下，未损伤和损伤的 Tg(myl7:h2b-GFP;csfr1a:NfsB-mCherry) 心室在损伤后24小时（hpi）经 TUNEL 染色的图像。青色箭头头指向巨噬细胞；白色箭头头指向 TUNEL 阳性细胞。（G）未损伤和损伤的 (irf8 ^{+/+}) 及 (irt8) 品系 Tg(myl7:h2b-GFP) 心室中的 TUNEL 阳性心肌细胞；（H）不同巨噬细胞消融组下，未损伤和损伤的 Tg(myl7:h2b-GFP;csfr1a:NfsB-mCherry) 心室中的 TUNEL 阳性心肌细胞，样本量 n=10-12。（I）光片荧光显微镜（LSFM）采集的 z 堆栈在损伤后9小时（hpi）的 z 层图像，显示 Tg(myl7:GFP;mpeg1:mCherry) 幼虫巨噬细胞内的心肌碎片（白色箭头头），V 代表心室表面。（A）-（F）的比例尺为50微米，（I）的比例尺为10微米。除非另有说明，所有代表性图像均为3D LSFM 采集的最大强度投影图。* p (^{*} p ≤0.05)；(^{*} p ≤0.01)；(^{* *} p ≤0.001) <0.001。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）后进行 Holm-Sidak 事后检验。数据以平均值±标准误均值（mean ± SEM）表示。

图3. 巨噬细胞并非心脏结构或功能恢复所必需。(A)Tg(myl7:GFP;csfr1a:NfsB-mCherry) 幼虫损伤心室的 LSFM z 堆栈代表性 GFP 表面渲染图，巨噬细胞消融组如图中所示。损伤后6小时（hpi）显示无腔面心肌表面（左图），再生后48小时（hpi）分别显示无腔面和腔面心肌表面（中图和右图）。白色箭头头指示激光损伤位点。(B) 每个巨噬细胞消融组中受伤的 Tg(myl7:GFP;csfr1a:NfsB-mCherry) 幼虫平均病变大小的定量分析，(n=11-22)(C) 未损伤和损伤的 Tg(myl7:GFP;csfr1a:NisB-mChemy) 幼虫在每个巨噬细胞消融组中心室射血分数的定量，(n=10-12)(D) 来自(irf8+/+)和(irt8-i-)品系Tg(myl7:GFP)斑马鱼幼虫损伤心室的LSFM采集z-stack的代表性GFP表面渲染图。损伤后6小时（左图）显示心肌外表面，再生后48小时（中图和右图）分别显示心肌外表面和内表面。白色箭头头指示激光损伤部位。(E) 对受伤的 (irf8+/+) 和 (irf8) Tg(myl7:GFP) 幼虫的平均病变大小进行定量分析，(n=15)(F) 未损伤和损伤的 (irf 8^{+/+}) 及 (irt8) Tg(my7:GFP) 幼虫中心室射血分数的定量分析 (n=15-20)(G) 从损伤后6小时开始，Tg(myl7:GFP)心室经GFP表面渲染后的延时成像时间点。白色方框为放大区域；白色箭头头指示心肌芽；青色箭头头指示心肌桥。* p (^{*} p ≤0.05) (^{* *} p ≤0.001) 0.001。采用双因素方差分析，随后进行Holm-Sidak事后检验。比例尺为50毫米。数据以平均值±标准误表示。 

巨噬细胞参与损伤后凋亡心肌细胞的清除

接下来，我们旨在探究巨噬细胞在幼虫心脏再生过程中所起的作用——这种再生仅在初次损伤后的48小时内发生。我们采用两种不同的方法构建无巨噬细胞的心脏模型。首先，我们使用Tg(csf1ra:gal4;UAS:mCherry-NfsB)品系（下文简称为csf1ra:NfsB-mCherry），该品系的巨噬细胞中表达硝基还原酶NfsB，当暴露于前药甲硝唑时，可诱导细胞特异性凋亡。巨噬细胞的消融仅发生在表达硝基还原酶（NTR）且存在甲硝唑（NTR+met+）的幼虫体内。因此，仅表达硝基还原酶（NTR+met）或仅存在甲硝唑（NTR-met+）的幼虫被用作巨噬细胞充足的对照组。第二种方法是使用巨噬细胞缺失的(irf8 ^{-1-})突变体，其中IRF8是巨噬细胞发育所需的转录因子。

为了确定巨噬细胞是否是清除凋亡细胞所必需的，我们对(irf8 ^{-1-})和(irf8 ^{+/+})品系的Tg(myl7:h2b-GFP)斑马鱼进行了TUNEL染色。在受伤的(irf8 ^{+/+})心脏中，与未受伤的对照组相比，受伤后2小时和6小时凋亡心肌细胞的数量显著增加（分别为4.1±0.9 vs 0.0±0.0和5.3±1.0 vs 0.1±0.1，(n=15-29)），但在受伤后24小时恢复至基线水平。尽管巨噬细胞缺失的(irf8 ^{-1-})品系斑马鱼在受伤后2小时和6小时表现出相似的初始细胞死亡模式（凋亡心肌细胞分别为5.5±0.8和5.9±0.9个），但凋亡心肌细胞在受伤后24小时仍持续存在，直至48小时才恢复至未受伤水平。

在巨噬细胞消融模型中，我们观察到了相似的结果模式：所有处理组未受伤心脏中的凋亡细胞数量均可忽略不计，而在损伤后6小时每小时注射（hpi）达到峰值（NTR+met-、NTR-met+ 以及 (NTR+met+=6.4 pm) 组分别为 0.5、6.4 ± 0.5 和 6.0 ± 0.5，对应 (n=10-12) ）。至损伤后24小时每小时注射，未消融组的TUNEL阳性心肌细胞数量不再显著增加；然而，巨噬细胞消融组在损伤后24小时每小时注射仍保留凋亡细胞（((NTR+met+=1.5 pm 0.3))），并在损伤后48小时每小时注射时恢复正常。

为验证巨噬细胞是否直接清除心肌碎片，我们对受损的 Tg(myl7:GFP;mpeg1:mCherry) 幼虫进行了延时成像。我们观察到损伤部位附近的小型 GFP 阳性心肌碎片被巨噬细胞清除并内化，证实了巨噬细胞在损伤部位清创中的关键作用。

巨噬细胞并非幼鱼心脏结构与功能恢复的必需条件

接下来，我们旨在探究巨噬细胞是否是激光损伤后幼虫心脏结构与功能恢复所必需的。我们在巨噬细胞消融后对Tg(myl7:GFP;csf1ra:NfsB-mCherry)幼虫进行损伤，并通过心跳同步光片照明显微镜（LSFM）对单个幼虫的心脏结构进行了连续3D扫描。在所有处理组中，损伤面积在损伤后2至6小时（hpi）间保持一致，组间无差异。至损伤后24小时，巨噬细胞充足的NTR+甲硝唑（met）处理组幼虫的损伤几乎完全消退（95%恢复至(37.1 mu m^{2} pm 24.4)和(n=11-22)状态）。然而，对于巨噬细胞消融的NTR+met+组以及另一组巨噬细胞充足的NTR-met+组幼虫，损伤闭合在损伤后24小时时略有延迟（分别恢复至73%和75%，对应(234.7 pm 59.7 mu m^{2})和(221.4 pm 84.6 mu m^{2})状态）。至损伤后48小时，各组幼虫的损伤均完全消退，损伤心室的腔面重建显示肌小梁结构正常。这些结果表明，巨噬细胞并非损伤闭合所必需，但甲硝唑处理会轻微延迟该过程。

我们利用Tg(myl7:GFP)转基因斑马鱼幼虫，通过落射荧光显微镜获取了跳动心脏的侧视视频，并检测了巨噬细胞消融是否会影响心脏功能的恢复。在损伤后2小时（hpi），所有组的体积射血分数均从未损伤心室的74%下降至5%。在6小时pi时，所有处理组的射血分数均快速恢复（损伤组为78%，未损伤组为87%）；而在24小时pi和48小时pi时，损伤心脏的功能与未损伤心脏已无明显差异。这些数据表明，斑马鱼幼虫的损伤心脏可快速恢复功能，且该恢复过程不依赖巨噬细胞。

接下来，我们开展了相同的实验，在irf8突变体背景下的Tg(myl7:GFP)幼虫中检测心脏结构和功能的恢复情况。(irf 8^{+/+})和(irf8 ^{-1-})基因型的幼虫在感染后6至24小时内均出现了显著的病灶消退（80%）（分别对应(898.6 mu m^{2} pm 189.7)至(211.6 mu m^{2} pm 115.8)和(1,002.9 mu m^{2} pm 158.4)至(113.89 mu m^{2} pm 59.5)）。在任何时间点均未观察到病灶大小存在差异，且两种基因型的幼虫均在感染后48小时完全闭合了病灶。结构完全恢复后，两组幼虫在感染后48小时均呈现出正常的小梁结构。该模型中心射血分数的恢复趋势与甲硝唑-硝基还原酶模型一致，两种基因型的受伤幼虫在感染后24小时，其射血分数均与未受伤幼虫无明显差异。我们在irf8巨噬细胞缺失模型中得到的近乎一致的结果证实，激光损伤后幼虫心脏可快速恢复，且这一过程不依赖巨噬细胞。

最后，我们希望探究损伤闭合的机制。我们对损伤后即刻的 Tg(myl7:GFP) 斑马鱼幼虫的损伤部位进行了心跳同步延时成像。我们观察到 GFP 阳性的心肌细胞出芽于损伤边界区的两侧，随后侵入损伤部位，相互黏附形成桥接结构。在 Tg(myl7:h2bGFP;myl7:mKateCAAX) 幼虫中重复该实验，借助其标记的细胞核和质膜，可对单个心肌细胞进行追踪。我们发现，位于损伤边缘的心肌细胞并未发生分裂，而是向损伤部位伸出突起，直至与从损伤对侧桥接而来的其他单个心肌细胞黏附。这些成像结果表明，心肌结构的修复首先通过形态发生完成，而非细胞分裂。

图4. 巨噬细胞消融可消除损伤依赖性的心肌细胞增殖。(A)用于在受精后0-24小时（hpi）和受精后24-48小时（hpi）内标记增殖心肌细胞的EdU脉冲策略，分别对应左侧和右侧示意图。(B) 受精后48小时（hpi）时，Tg(myl7:h2b-GFP)转基因斑马鱼幼虫的EdU染色心脏图像。非心肌细胞的EdU信号在采集后被排除。A代表心房；v代表心室；白色方框为放大区域；白色箭头头为EdU阳性心肌细胞核；虚线为分裂的心肌子细胞核的轮廓。(C) 未损伤和损伤的Tg(myl7:h2b-GFP)转基因斑马鱼心脏在受精后0-24小时或24-48小时内脉冲标记后，心室中EdU阳性心肌细胞的百分比。*** 采用未配对t检验，p值对应(^{* *} p ≤0.001)，(n=10-25)(D) 用于在标准巨噬细胞消融组中，对Tg(myl7:h2b-GFP;csfr1a:NfsB-mCherry)斑马鱼幼虫在24–48小时 post-infection（hpi）内增殖心肌细胞进行标记的EdU脉冲标记策略。(E) 48小时每高倍视野（hpi）下通过光片照明显微镜（LSFM）获取的Tg(myl7:h2b-GFP;csfr1a:NfsB-mCherry)转基因斑马鱼心脏的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色图像。白色方框为放大区域；白色箭头头表示EdU阳性心肌细胞核；BA为动脉球。(F) 在未损伤和损伤的 Tg(myl7:h2b-GFP;csfr1a:NfsB-mCherry) 心脏中，24–48 小时脉冲标记后心室中 EdU+ 心肌细胞的百分比。*p (^{*} p ≤0.05)，采用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 多重比较事后检验，样本量 n = 12–19。(n=12-19)(G) 采用光片照明显微镜（LSFM）在损伤后48小时（hpi）拍摄的(irt8)品系Tg(myl7:h2b-GFP)斑马鱼中，未损伤与损伤心脏的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色图像。采集后会去除非心肌细胞的EdU信号，以获得可解读的最大强度投影图像。(H) 未损伤和损伤的 (irf8+/+) 及 (irt8-f-) Tg(myl7:h2b-GFP) 心脏在 24–48 小时脉冲标记后心室中 EdU+ 心肌细胞的百分比，** p (^{*} p ≤0.01) 非配对 t 检验，(n=10-16) t 检验，n = 10–16。除非另有说明，所有图像均为 3D 光片荧光显微镜（LSFM）堆叠的最大强度投影图。比例尺为 50 微米。数据以平均值±标准误（SEM）表示。

巨噬细胞消融可消除损伤相关的心肌细胞增殖增加

为了检测心肌细胞增殖是否会因激光损伤而增加，我们在两项实验中对 Tg(myl7:h2b-GFP) 幼虫进行了 EdU 染色。未损伤和损伤的幼虫分别在损伤后0–24小时（hpi）或24–48小时（hpi）期间暴露于 EdU。对未损伤和损伤心脏的比较显示，损伤后0–24小时，EdU 阳性心肌细胞核的比例无显著差异（分别为21.3±3.3和18.9±3.4，(n=10-14) 图4B和4C）。然而，在损伤后24–48小时期间，损伤心脏中 EdU 阳性心肌细胞的比例相较于未损伤心脏全器官范围内增加了35%（分别为43.5%±1.8%和32.2%±2.0%）(n=17-25)）。对分裂中心肌细胞的活体延时成像显示，细胞核分裂后紧接着胞质分裂，仅会产生单核细胞，未观察到明显的肥大现象。

为探究巨噬细胞是否是损伤诱导心肌细胞增殖增加所必需的，我们在无巨噬细胞模型的增殖期24-48小时损伤后（hpi）窗口内进行了EdU脉冲标记。在甲硝唑-硝基还原酶消融模型中，我们发现NTR+met组和NTR-met+对照组的损伤心脏中EdU阳性心肌细胞比例均有所增加，而巨噬细胞消融的NTR+met+组则无此变化。该结果表明，巨噬细胞是损伤诱导心肌细胞增殖增加的必要条件。然而，与甲硝唑-硝基还原酶消融模型不同，对(irf8 ^{-1-})突变体的心肌细胞增殖分析显示，损伤后这些突变体的EdU阳性心肌细胞比例也显著升高，与(irf 8^{+/+})幼虫的情况相当。

为解决这一差异，我们更细致地研究了这些模型之间的区别。与其他研究的发现一致，我们发现 (irf8 ^{-1-}) 突变体的中性粒细胞总数比 (irf 8^{+/+}) 斑马鱼更多，且对损伤的中性粒细胞应答反应更强。由于我们未在 NTR+met+ 幼虫中观察到中性粒细胞应答增强，因此推测在 (irf8 ^{-1-}) 幼虫中，中性粒细胞可能在代偿巨噬细胞的功能。为验证这一假设，我们使用受体拮抗剂“SB225002”抑制了 (irf8 ^{-1-}) 幼虫中中性粒细胞的募集，该拮抗剂可阻断中性粒细胞迁移的关键趋化因子受体 CXCR1/2 的激活。抑制 CXCR1/2 成功降低了募集的中性粒细胞数量（2.0±((2.0 pm) 3.4 对比 0.43±0.18），并消除了 (irf8 ^{-1-}) 中心肌细胞因损伤相关的数量增加。综上，这表明巨噬细胞是心肌细胞增殖所必需的，但可被过量的中性粒细胞替代。

再生的幼鱼心脏在受伤后48小时内消退炎症并进入修复阶段

接下来，我们试图了解在幼虫心脏损伤模型的最终48小时感染后（hpi）时间点，哪些生物学过程可能仍在进行。我们对48小时感染后（hpi）未受伤和受伤的幼虫心脏集合样本进行了RNA测序。我们发现，受伤的心脏中有418个基因上调（(log2) 倍数变化>1），1046个基因下调。我们未观察到增殖标志物（如MCM2、mKi67）的差异表达。以及增殖细胞核抗原（PCNA），这表明我们在24小时 post-infection（hpi）时观察到的增殖现象在48小时 post-infection（hpi）时已结束。

大多数炎症相关和 M1 型标志物在受损心脏中要么无差异表达，要么表达下调，例如 il1b。相比之下，我们发现了与损伤相关的39种胶原亚型的上调，以及转化生长因子β1a（tgfb1a）等多个促纤维化基因和波形蛋白（vimentin）等上皮-间质转化（EMT）标志物的上调。同样，差异表达基因的层次聚类分析揭示了9个不同的聚类簇，其中聚类簇1在受损心脏中呈上调表达，且富含胶原蛋白、基质金属蛋白（MMPs）和成纤维细胞生长因子（FGFs）。此外，聚类簇2包含多个上皮-间质转化基因，聚类簇8的基因与细胞募集和淋巴管生成相关，而聚类簇7则含有多种胚胎相关肌球蛋白和肌球蛋白结合蛋白，如肌球蛋白轻链10（myl10）和钙调蛋白结合蛋白1b（cald1b）。聚类簇3-6和9在损伤后呈下调表达，聚类簇2富含免疫基因，聚类簇4和6富含生长因子，聚类簇3和5则无明确的功能特征。综合来看，我们的RNA测序结果表明，炎症期和增殖期在损伤后48小时基本结束，此后以促消退和修复期为主导。

图5. 损伤后幼虫心脏的批量RNA测序分析。(A)在感染后48小时（hpi）提取未损伤和损伤的心脏，每个生物学重复合并200个心脏用于RNA测序，(n=3) (B) 火山图展示每个检测到的基因的转录本的对数2倍变化（log2(fold change)）和(log100) p值。校正p值低于0.05的基因被认为无统计学显著性，用蓝色标注。损伤心脏中上调的基因用品红色标注，未损伤心脏中上调的基因用灰色标注。(C) 热图显示具有(log _{2} (fold)倍变化>0.5的显著差异表达基因。通过皮尔逊相关和z评分对基因进行层次聚类。聚类及其树状图在左侧标注。品红色代表高表达，灰色代表低表达。与心脏再生相关的基因在图右侧标注为注释，n=3。

心脏损伤诱导心外膜激活并上调vegfaa

我们对幼虫激光损伤模型的详细表征发现，在损伤后24-48小时会出现巨噬细胞依赖性的心肌细胞增殖反应。因此，我们利用该模型的快速性和成像优势，探究了心肌细胞增殖诱导的潜在机制。心外膜Vegfaa最近已被证实可在冷冻损伤后驱动成年斑马鱼的心肌细胞增殖，并且我们推测，同样的机制可能也会促使受损幼体心脏中心肌细胞的增殖。

我们发现 vegfaa:GFP 仅在心肌上方的间皮细胞中稳定表达。在未受伤的 Tg(tcf21:DsRed;vegfaa:GFP) 斑马鱼幼体中，其与已确立的心外膜标记物 tcf21 共定位，证实这些细胞为早期心外膜。随后，我们通过对未受伤和再生心脏进行3D荧光强度分析，探究了心外膜处 vegfaa:GFP 的表达在损伤后是否发生变化。我们发现心外膜处的 vegfaa:GFP 荧光强度在损伤后48小时显著升高，且这种变化在整个器官范围内均存在。有趣的是，这既归因于心外膜细胞数量的增加，也归因于单个细胞的荧光强度增强。结合受损心脏中EdU阳性心外膜细胞比例的上升，这些数据表明心外膜通过增殖和增强vegfaa的表达来激活并响应损伤。

图6. 心脏损伤后巨噬细胞促进心外膜细胞数量扩增。(A)来自 Tg(myl7:mKateCAAX;myl7:h2b-GFP) 幼虫的未损伤3天胚胎期（3 dpf）心室图像，显示覆盖心肌（品红色）的血管内皮生长因子aa（vegfaa）阳性细胞（绿色）。青色框为放大区域。(B) 在损伤后48小时（hpi）获取的 Tg(vegfaa:GFP) 幼虫未损伤和损伤心室的图像。应用“热”查找表（LUT）以突出损伤心脏中外膜 vegfaa:GFP 信号强度的增加。(C) 标准损伤模型时间点下，未损伤和损伤心脏的心室总 vegfaa:GFP 荧光强度，n = 28–30。* p (n=28-30) (^{*} p ≤0.05)，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行霍尔姆-西达克多重比较事后检验。(D 和 E) 损伤后48小时未损伤和损伤的经5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色的 Tg(vegfaa:GFP) 心脏图像，显示 EdU 阳性外膜细胞（白色箭头头），(E) 中量化了 EdU 阳性外膜细胞的比例，(n=13-16)。采用非配对t检验，(^{* *} p ≤0.01)。(F) 损伤后48小时来自 Tg(vegfaa:GFP;csfr1a:NfsB-mCherry;kdrl:hsa.HRAS-mCherry)（缩写为 kdrl:mCherry）幼虫的心室图像，显示外膜-心肌微环境中的巨噬细胞（白色箭头头）。青色框为放大区域。(G) 来自甲硝唑-硝基还原酶巨噬细胞消融组的 Tg(vegfaa:GFP;csfr1a:NfsB-mCherry) 幼虫在损伤后48小时未损伤和损伤心室的图像。应用“热”查找表（LUT）以突出除 NTR+met+ 组外损伤组总荧光强度的增加。(H) 和 (I) 分别为甲硝唑-硝基还原酶巨噬细胞消融组的 Tg(vegfaa:GFP;csfr1a:NfsB-mCherry) 幼虫在损伤后48小时未损伤和损伤心室的总 vegfaa:GFP 荧光强度和外膜细胞数量。所有图像均为三维光片照明显微镜（3D LSFM）堆叠的最大强度投影。比例尺为50微米，(n=46.)、(^{*} p ≤0.05)、(^{*} p ≤0.01)、(^{* *} p ≤0.001)。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行霍尔姆-西达克多重比较事后检验。数据以平均值±标准误均值（mean ± SEM）表示。

巨噬细胞定位于心外膜微环境并诱导心外膜细胞数量扩增

鉴于我们的数据显示巨噬细胞消融可消除损伤依赖性心肌细胞增殖（图5F），我们假设巨噬细胞可能是心外膜激活。事实上，我们对损伤后巨噬细胞定位的3D分析显示，每种亚型的募集巨噬细胞自身均不表达vegfaa，但可侵入心肌-心外膜微环境并与心外膜细胞形成突触连接。为验证我们的假设，我们消融了巨噬细胞，并评估48小时 post-injury（hpi）时心外膜是否仍像之前一样被激活。损伤后，我们在巨噬细胞充足的NTR-met+组和NTR+met组中均观察到vegfaa:GFP表达升高，而在巨噬细胞消融的NTR+met+心脏中未出现该现象。有趣的是，巨噬细胞消融并未影响单个细胞中vegfaa:GFP的表达，但阻断了损伤后心外膜细胞数量的扩增。因此，我们的数据有力表明，巨噬细胞向心外膜的募集对于后续的心外膜激活至关重要，进而提升心脏整体的vegfaa表达水平。

图7. Vegfaa通过心内膜Notch信号通路驱动心肌细胞增殖。(A)注射0.1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）或斑马鱼血管内皮生长因子Aa（zfVegfaa）后，24小时 post-injection（hpi）时Tg(myl7:h2b-GFP)幼虫的光片照显微镜（LSFM）图像。(B) 24和48小时 post-injection（pi）时，注射0.1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）或斑马鱼血管内皮生长因子Aa（zfVegaa）的Tg(myl7:h2b-GFP)幼虫的心室心肌细胞数量，(n=20)。非配对t检验。(C) Tg(myl7:h2b-GFP)幼虫受损心室的图像，经5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色并置于赋形剂或AV951中处理，48小时 post-injection（hpi）时成像。采集后排除非心肌细胞的EdU信号。(D) Tg(myl7:h2b-GFP)幼虫未受损与受损心室中EdU阳性心肌细胞核的百分比，这些幼虫经5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色并置于赋形剂或AV951中处理，(n=13-36)。非配对t检验。(E) 赋形剂或DAPT处理的受损Tg(myl7:nlsDsRed)幼虫的图像，48小时 post-injection（hpi）时通过光片照显微镜（LSFM）采集。(F) 48小时 post-injection（hpi）时，赋形剂或DAPT处理的未受损与受损Tg(myl7:h2b-GFP)幼虫的心室心肌细胞数量，(n=24-40)。非配对t检验 

Vegfaa 对斑马鱼幼鱼心肌细胞的增殖既是必需的也是充分的

为验证心外膜 Vegfaa 是否驱动幼虫心脏再生中心肌细胞的增殖，我们首先检测了 Vegfaa 是否足以刺激心肌细胞增殖。将重组斑马鱼 Vegfaa 蛋白（zfVegfaa）显微注射到 72 小时受精后（hpf）的 Tg(myl7:h2b-GFP) 幼虫的循环系统中，并在处理后 24 小时（hpt）和 48 小时评估总心肌细胞数量。在处理后 24 小时，zfVegfaa 使总心肌细胞数量相较于注射磷酸盐缓冲液（PBS）的对照组增加了 13.3%。

为了验证血管内皮生长因子（VEGF）信号通路是否是损伤相关心肌细胞增殖所必需的，我们使用了高亲和力的全血管内皮生长因子受体（VEGFR）拮抗剂AV951（替沃扎尼）来阻断VEGF信号通路。在心脏损伤模型实验过程中，我们将斑马鱼幼鱼置于10纳摩尔浓度的AV951溶液中处理，在损伤后24至48小时的增殖窗口期用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）进行脉冲标记，并在损伤后48小时对EdU阳性心肌细胞进行定量分析。值得注意的是，AV951处理使未损伤组和损伤组的EdU阳性心肌细胞比例均出现下降（未损伤组：38.4±3.4 vs 28.0±3.0；损伤组：42.9±3.8 vs 31.6±2.2，(n=13-36) ）。重要的是，AV951处理并未影响损伤区域的愈合或射血分数的恢复。综上，这些数据表明，无论是在正常发育过程中还是心脏损伤后，心脏内的VEGF信号通路都在驱动斑马鱼幼鱼心脏的心肌细胞增殖。

Notch 信号通路与 Nrg-ErbB 信号通路是心肌细胞增殖所必需的

我们接下来探究了巨噬细胞诱导的心外膜Vegfaa信号通路是否可能与心肌细胞增殖中其他已被广泛研究的效应因子存在相互作用。Notch通路与Nrg-ErbB通路是极具潜力的候选因子，因为这两种信号通路均为成年斑马鱼心脏再生以及心肌细胞增殖所必需。我们首先验证了这些信号通路是否为损伤后幼鱼心脏中心肌细胞增殖所必需。我们对Tg(myl7:nlsDsRed)幼鱼进行激光损伤，并用100毫摩尔的全Notch抑制剂DAPT（N-[N(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯）对其进行药浴处理。DAPT是一种γ-分泌酶抑制剂，已在斑马鱼和果蝇中被证实可模拟Notch突变体的表型。抑制Notch信号通路会使未损伤心脏的心肌细胞数量减少8%（253.3±5.2 对比 233.4±4.5，(n=25-38)），使损伤心脏的心肌细胞数量减少约14%（266.0±5.6 对比 229.5±3.6，(n=25-38)；

我们使用1.75毫摩尔的ErbB2拮抗剂AG1478重复了该实验。小分子抑制剂AG1478可选择性抑制ErbB2，而ErbB2是ErbB4二聚化以及随后神经调节蛋白信号转导所必需的共受体，且能精准模拟erbb2突变体的表型。有趣的是，实验结果与Notch信号抑制实验的结果完全一致：未损伤的心脏中心肌细胞数量减少了9%（257.2±5.8 对比 235.2±4.2），损伤的心脏中心肌细胞数量减少了13%（265.7±5.5 对比 229.5±5.9）。这些结果证实，无论是未损伤还是损伤的幼体心脏，Notch信号通路和Nrg-ErbB信号通路均为心肌细胞数量扩增所必需。

心脏损伤与Vegfaa诱导心内膜Notch信号通路激活

鉴于血管内皮生长因子（VEGF）、Notch 信号通路以及神经调节素-表皮生长因子受体（Nrg-ErbB）信号通路在斑马鱼幼鱼心脏心肌细胞增殖过程中具有各自的独立作用，我们试图探究这些信号通路组分是否可能在同一条信号通路中发挥作用。以往的研究已证实，斑马鱼幼鱼心脏的发育性生长可通过心内膜 Notch 信号通路调控神经调节素-表皮生长因子受体（Nrg-ErbB）信号通路，由心脏收缩激活该过程。我们推测，血管内皮生长因子αa（Vegfaa）可能通过增强心内膜 Notch 信号通路，进而激活这一发育性信号通路，从而驱动心肌细胞增殖。

为了检测 Vegfaa 是否能激活心内膜的 Notch 信号通路，我们使用 Notch 信号通路报告系 Tg(Tp1:venusPEST) 作为心脏 Notch 信号通路的读数。将重组斑马鱼 Vegfaa 注射到 3 天受精后（dpf）的幼鱼体内，并在注射后 6、24 和 48 小时（hpt）通过心脏同步光片层荧光显微镜（LSFM）分析其心脏）。此外，另一组幼鱼不仅注射了斑马鱼 Vegfaa，还浸泡在 ErbB2 拮抗剂 AG1478 中。根据我们假设的通路，我们推断注射斑马鱼 Vegfaa 应能上调 Notch 信号通路，而抑制 Nrg-ErbB 信号通路则无法抑制斑马鱼 Vegfaa 诱导的 Notch 通路上调。

Notch信号主要存在于心内膜中，与内皮报告基因kdrl:mCherry共定位，但信号强度相对较低，且在任意给定时间点仅能在部分幼虫中检测到。我们发现，在注射zfVegfaa后，6小时 post-injection（hpi）时，notch阳性（Tp1:Venus阳性）心内膜的幼虫百分比有所增加（从46.4%升至78.6%，(n=28)），但在24和48 hpi时间点未观察到该变化。此外，AG1478无法阻断zfVegfaa注射后notch阳性心脏百分比的上升，这证实Nrg-ErbB信号并非vegfaa或Notch信号的上游通路。实际上，在48 hpi时，经zfVegfaa+AG1478处理的幼虫，其notch阳性心脏的百分比远高于仅用zfVegfaa处理的幼虫（25.0% vs 0%）。这提示存在一种负反馈机制，也与此前Nrg-ErbB位于Notch信号下游的研究结论相符。

为了检测该通路，在损伤过程中是否发挥类似作用，我们用斑马鱼Vegfaa（zfVegfaa）注射替代心脏损伤模型，重复了实验。心脏损伤同样提高了具有Notch阳性心内膜的心脏百分比，但这一现象在损伤后48小时（hpi）才较晚出现（50.0% 对比 11.1%，(n=18)）（图7N和图7O）。与之前一致，AG1478并未阻断Notch信号通路，反而似乎增强了该信号。尽管损伤组在损伤后24小时的Notch阳性心脏百分比未显著升高，但损伤并经AG1478处理的幼鱼相比未损伤幼鱼，该百分比显著上升（52.9% 对比 11.1%）。

接下来，我们重复了zfVegfaa刺激实验，此次使用Tg(myl7:h2b-GFP)幼虫，并评估了AG1478或DAPT是否会阻断Vegfaa依赖的心肌细胞数量增加。两种拮抗剂均抑制了该反应，表明notch和神经调节蛋白信号通路作用于Vegfaa的下游。

最后，我们检测了心外膜 Vegfaa 是否有可能到达心内膜。我们测量了静脉注射的 500 千道尔顿荧光葡聚糖从血液到心包液的扩散情况，发现其能轻松穿过心肌。鉴于斑马鱼 Vegfaa 体积小得多（14 千道尔顿），它很可能也能扩散穿过心肌。

综合来看，这些结果表明心脏损伤和Vegfaa会增强心内膜的Notch信号通路并增加心肌细胞数量，这揭示了巨噬细胞可通过刺激心外膜Vegfaa的表达来触发心肌细胞增殖的机制。

讨论

本研究首次对斑马鱼心脏再生幼虫模型进行了详细表征，揭示了巨噬细胞的异质性和可塑性心脏损伤，并检测巨噬细胞在清除凋亡细胞、心肌细胞增殖、心外膜激活以及心脏结构和功能恢复方面的需求。此外，我们利用斑马鱼幼虫心脏损伤模型可在体内进行心脏成像且易于开展药物干预的优势，验证了该模型的实用性，并发现巨噬细胞可通过心外膜激活促进心肌细胞增殖。

我们对斑马鱼幼鱼心脏损伤中巨噬细胞的研究表明，这些细胞可能能真实再现成年冷冻损伤模型中观察到的表型复杂性和功能。与此前在成年心脏中的研究结果一致，我们检测到了mpeg1+csf1ra+和mpeg1+csf1ra⁻巨噬细胞亚群。我们发现这些细胞的募集动态完全相同，在形态或行为上也无明显差异。未来的研究应聚焦于阐明这些亚群在心脏再生过程中的确切作用，尤其是mpeg1+csf1ra⁻巨噬细胞。

除了巨噬细胞异质性外，我们还观察到了巨噬细胞的表型可塑性。我们利用心跳同步活体成像技术证实，csf1ra+和mpeg1+巨噬细胞均可从tnfa+表型转化为tnfa+表型（注：原文表述可能存在笔误，结合语境应为从tnfa-转化为tnfa+）。针对斑马鱼脊髓和尾部损伤模型中巨噬细胞的研究表明，tnfa可作为M1样巨噬细胞的标志物，这类细胞随后会转化为M2样巨噬细胞（Nguyen-Chi等人，2015）。我们通过经典的M1极化细胞因子IFN-γ成功提高了tnfa+巨噬细胞的比例，这表明早期的tnfa+巨噬细胞确实具有促炎特性。与成年斑马鱼心脏冷冻损伤模型的研究结果一致，我们发现这类tnfa+巨噬细胞群是瞬时存在的，仅在损伤后24小时的早期反应阶段被检测到。同样，我们的再生幼体心脏RNA测序数据集显示，到损伤后48小时，受损的幼体心脏会下调促炎细胞因子和生长因子的表达，同时上调胶原蛋白和修复性细胞因子的表达。此外，尽管斑马鱼心脏在结构和功能上已完全恢复，但受损心脏中仍会激活促消退的纤维化程序，这一发现与近期一项研究的结论相符——该研究表明，疤痕缺失的(runx 1^{-1-})斑马鱼能够成功完成心脏再生。同样，prrx1b、col11a1a和spp1等纤维化相关基因的上调在成年斑马鱼损伤模型中也有充分报道，这提示斑马鱼幼体心脏再生过程中损伤后48小时的阶段，可能与成年斑马鱼损伤后4-7天的阶段具有可比性。然而，成年斑马鱼该阶段的特征是心肌细胞增殖增强，而损伤后48小时的幼体心脏却已完成了所有丢失心肌的再生。值得注意的是，vegfaa在损伤后48小时未出现差异表达，这可能表明vegfaa驱动的绿色荧光蛋白（GFP）的表达与积累之间存在时间差。或许炎症消退时，纤维化程序会同步激活，而无需依赖疤痕组织的形成。

我们采用了两种独立的方法来探究巨噬细胞在幼体心脏再生中的作用。有趣的是，通过csf1ra驱动的硝基还原酶表达进行的消融术，仍能消除受损心脏处csf1ra+巨噬细胞的数量。这或许表明存在一个正反馈系统，其中csf1ra+巨噬细胞的募集依赖于csf1ra+巨噬细胞本身。通过两种技术获得的细胞死亡数据均表明，巨噬细胞是及时完成再生过程所必需的损伤后凋亡细胞的清除。值得注意的是，即使没有巨噬细胞，凋亡细胞最终也会被清除。在未受伤的(irt8-/-)心脏中，于4天龄时观察到的发育性凋亡细胞也被清除了，且这些细胞在(irf8 ^{+/+})心脏中可能因存在时间过短而无法被检测到。我们的活体成像研究显示，死亡的心肌细胞可独立于巨噬细胞从心肌层中排出。这可能是心脏收缩作用的结果，尽管已知在神经上皮组织中也存在类似现象，其中神经元似乎会将凋亡细胞挤出组织外。

令人意外的是，我们发现尽管巨噬细胞是心肌细胞增殖所必需的，但巨噬细胞的缺失并不会影响受损幼虫心脏的结构或功能恢复。这与以往的研究结果形成对比，以往研究中，利用氯膦酸脂质体清除巨噬细胞，以及通过CCR2拮抗剂抑制巨噬细胞募集，会阻碍或延迟新生小鼠、成年斑马鱼以及美西螈心脏梗死区域的修复。幼虫心脏出现相反结果的原因，可能仅仅是其体积小、跨壁压低，使得存活的心肌能够独立于细胞分裂快速“愈合”。为支持这一观点，我们观察到单个心肌细胞会伸出突起伸入损伤部位。此前对受损成年斑马鱼和新生小鼠心脏边界区的组织学分析显示，在Ap-1和整合素连接激酶介导的肌节解体后，心肌细胞会呈现出类似的间充质表型。不过，这是首次通过活体跳动心脏的延时成像，证实了这种行为的存在。

对成年斑马鱼和新生小鼠的研究表明，巨噬细胞的消融会降低心肌细胞的增殖能力。然而，早期血管再生对心肌细胞增殖至关重要，且这一过程依赖于巨噬细胞，这使得巨噬细胞是否直接诱导心肌细胞增殖这一问题受到质疑。幼体心脏缺乏支持性脉管系统；因此，我们关于心肌细胞增殖依赖巨噬细胞的研究结果表明，巨噬细胞能够不依赖血管再生促进心肌细胞增殖。事实上，我们的数据显示，巨噬细胞会被招募至心外膜-心肌微环境中，并诱导心外膜细胞数量扩增，进而提高 Vegfaa 的表达水平。这或许可以解释此前在发育中和受损小鼠心脏中得到的研究结果——卵黄来源的巨噬细胞和 Gata6+ 心包腔巨噬细胞分别被招募至心外膜。巨噬细胞与心外膜之间的突触连接可能如同经典免疫突触一样，起到富集配体-受体对的作用。未来的研究应致力于明确巨噬细胞激活心外膜的具体机制。

心内膜的Notch信号通路是冷冻损伤成体中心肌细胞增殖以及幼体中心肌通过下游Nrg1因子生长所必需的。因此，我们发现损伤和Vegfaa均能增强心内膜Notch信号通路，这揭示了心外膜诱导心肌细胞增殖的重要机制。与以往研究一致，我们证实了在未损伤和损伤的心脏中，Notch 信号通路和 Nrg-ErbB 信号通路均是心肌细胞数量扩增所必需的。这两条信号通路似乎都是心肌细胞对 Vegfaa 产生有丝分裂反应所必需的，表明它们是下游关键组成部分。鉴于我们发现抑制 VEGFR 会降低未损伤幼体心脏的心肌细胞增殖能力，Vegfaa→Notch→Nrg-ErbB 很可能是一条心脏发育生长通路，该通路在心脏损伤后被上调，且可能在哺乳动物中也具有保守性。因此，我们发现巨噬细胞作用于该通路上游这一结论，为未来通过免疫调节增强心脏修复的治疗策略提供了令人振奋的新方向。

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